Pomiar wydajności kwantowej fotosyntezy
metodą pomiaru fluorescencji chlorofilu
Zagadnienia do przygotowania:
Faza świetlna (jasna) fotosyntezy. Fotosyntetyczny transport elektronów.
Wydajność procesu.
Cel ćwiczenia:
wyznaczenie stosunku ilości kwantów wykorzystanych do przeprowadzenia reakcji fazy
świetlnej fotosyntezy do ilości kwantów zaabsorbowanych przez barwniki aparatu
fotosyntetycznego.
Metodyka:
Bezpośrednie określenie ilości kwantów wykorzystywanych do procesu fotosyntezy nie jest możliwe.
Ponieważ chlorofil wykazuje zjawisko fluorescencji, energia zaabsorbowana przez barwniki aparatu
fotosyntetycznego (a) może zostać wykorzystana w trzech procesach: fotosyntezy (p) fluorescencji (f) i dezaktywacji cieplnej (t).
Oczywiście całkowita ilość energii wykorzystanej (p + t + f) musi być równa energii zaabsorbowanej a:
a = p + t + f
Chcąc więc wyznaczyć wydajność kwantową fotosyntezy, p/a, wystarczy określić ilość energii zaabsorbowanej,
a, i ilość energii traconej przez układ, t + f
p = a - (t + f)
Wydajność kwantowa fotosyntezy Y wynosi zatem
Y = p/a = [a-(t+f)]/a
przy założeniu pomiaru wszystkich wartości przy tej samej intensywności światła padającego I. Wzór można
stosować do wyników otrzymanych przy różnych natężeniach światła padającego (z ograniczeniami - patrz
niżej), jeżeli zamiast wartości p, a, t i f podstawimy wartości normalizowane do natężenia światła padającego I: P = p/I; F = f/I, T = t/I; A = a/I;
wydajność kwantowa fotosyntezy równa jest wtedy
Y = P/A = [A-(T+F)]/A
Bezpośrednie zmierzenie ilości energii absorbowanej w układzie (a) a zatem i A, jest niemożliwe, można jednak wyznaczyć A w warunkach gdy fotosynteza nie zachodzi, tj gdy P = 0, gdyż wtedy A = F + T. Przktycznie wykonuje się pomiar przy bardzo dużym natężeniu światła, wielokrotnie przekraczającym próg wysycenia
fotosyntezy - w tych warunkach P stanowi nieznaczną część A i można ją zaniedbać. Wartość zmierzoną w ten sposób można oznaczyć jako DM.
Pomiar określający P (czyli A - (F+T)) należy natomiast przeprowadzić w warunkach gdy P jest maksymalne, a zatem optymalnych dla fotosyntetycznego przepływu elektronów. Uzyskaną wartość oznaczymy jako D0.
Wyniki tych pomiarów będą więc opisywać maksymalną wydajność fotosyntezy wg równania:
Y = DM - D0 / DM = (TM+FM) - (T0+F0) / (TM+FM)
Jeżeli pomiary DM i D0 wykonamy w bardzo krótkim odstępie czasu, to stosunek F/T pozostanie w obydwu z nich stały, FM / TM = F0 / T0, z czego wynika że D0 / DM = F0 / FM.
Dzięki temu do określenia Y można wykorzystać łatwe do zmierzenia wydajności kwantowe fluorescencji:
Y = (FM - F0) / FM.
(FM - F0) jest często oznaczane symbolem FV i nosi nazwę fluorescencji zmiennej.
W praktyce stosowane są dwie metody pomiarowe.
a). Metoda wzbudzenia impulsowego (PAM = Pulse Amplitude Modulation) wykorzystuje możliwość rejestracji fluorescencji wzbudzanej modulowanymi impulsami o niskim natężeniu.
Najpierw rejestruje się intensywność fluorescencji indukowanej podczas oświetlania wyłącznie impulsami, co
odpowiada F0 (niskie natężenie światła, maksymalna wydajność fluorescencji) a następnie próbkę dodatkowo
oświetla się bardzo silnym światłem ciągłym, którego intensywność wielokrotnie przekracza próg wysycenia
fotosyntezy. Fluorescencja indukowana przez to światło nie jest jednak rejestrowana, natomiast intensywność
fluorescencji indukowanej w tych warunkach przez impulsy odpowiada fluorescencji "bez fotosyntezy" a więc
jest to FM.
b). Metoda krzywej Kautsky'ego
Krzywa Kautsky'ego przedstawia zmiany intensywności fluorescencji chlorofilu w aparacie fotosyntetycznym
po silnym oświetleniu zaciemnionej przedtem próbki. W pierwszym momencie fluorescencja jest na poziomie
F0, gdyż procesy fotochemiczne zachodzą z maksymalną wydajnością. Bardzo szybko jednak poszczególne
przenośniki elektronów fazy świetlnej (jasnej) fotosyntezy wysycają się, co obrazują punkty przegięcia krzywej,
aż do całkowitego wysycenia aparatu fotosyntetycznego i osiągnięcia poziomu odpowiadającego FM. Dla
zachowania założenia FM / TM = F0 / T0 czas osiągania FM musi być krótszy niż 1 s, co wymaga dużej
intensywności światła wzbudzającego (ponad 3000 µE m-2 s-1). To z kolei pociąga za sobą bardzo krótki czas w
którym próbka wykazuje F0 - zwykle 20 - 50 µs a to wymaga dużej rozdzielczości czasowej stosowanych
fluorymetrów.
Materiał roślinny
Przygotować liście roślin lub inne próbki fotosyntetycznie aktywne o spodziewanej różnej
wydajności fotosyntezy. UWAGA! Próbki muszą pochodzić z obiektów o ustalonej
przynależności systematycznej!
Przebieg doświadczenia:
Próbki przeznaczone do pomiaru inkubować w ciemności przez min. 15 min. Do aparatów
Hansatech, mierzących met. krzywej Kautsky'ego próbki zaciemnia sie przy użyciu klipsów
(pamiętac o zasunięciu zasuwek!), do aparatu Walz - PAM 210 materiał włożyć do ciemnej
szafkilub szuflady a dalsze operacje wykonywać w stłumionym lub zielonym świetle wg.
wskazówek prowadzącego ćwiczenia.
Sposób opracowania wyników:
Wyniki przedstawić w tabeli:
Gatunek
stan fizjologiczny próbki
FM
Y = FV/FM
Interpretacja wyników
Ustosunkować się do zależności między FM i FV/FM a stanem fizjologicznym próbki oraz do
zróżnicowania międzygatunkowego zmierzonych parametrów.