Pomiar wydajności kwantowej fotosyntezy

metodą pomiaru fluorescencji chlorofilu

Zagadnienia do przygotowania:

Faza świetlna (jasna) fotosyntezy. Fotosyntetyczny transport elektronów.

Wydajność procesu.

Cel ćwiczenia:

wyznaczenie stosunku ilości kwantów wykorzystanych do przeprowadzenia reakcji fazy

świetlnej fotosyntezy do ilości kwantów zaabsorbowanych przez barwniki aparatu

fotosyntetycznego.

Metodyka:

Bezpośrednie określenie ilości kwantów wykorzystywanych do procesu fotosyntezy nie jest możliwe.

Ponieważ chlorofil wykazuje zjawisko fluorescencji, energia zaabsorbowana przez barwniki aparatu

fotosyntetycznego (a) może zostać wykorzystana w trzech procesach: fotosyntezy (p) fluorescencji (f) i dezaktywacji cieplnej (t).

Oczywiście całkowita ilość energii wykorzystanej (p + t + f) musi być równa energii zaabsorbowanej a:

a = p + t + f

Chcąc więc wyznaczyć wydajność kwantową fotosyntezy, p/a, wystarczy określić ilość energii zaabsorbowanej,

a, i ilość energii traconej przez układ, t + f

p = a - (t + f)

Wydajność kwantowa fotosyntezy Y wynosi zatem

Y = p/a = [a-(t+f)]/a

przy założeniu pomiaru wszystkich wartości przy tej samej intensywności światła padającego I. Wzór można

stosować do wyników otrzymanych przy różnych natężeniach światła padającego (z ograniczeniami - patrz

niżej), jeżeli zamiast wartości p, a, t i f podstawimy wartości normalizowane do natężenia światła padającego I: P = p/I; F = f/I, T = t/I; A = a/I;

wydajność kwantowa fotosyntezy równa jest wtedy

Y = P/A = [A-(T+F)]/A

Bezpośrednie zmierzenie ilości energii absorbowanej w układzie (a) a zatem i A, jest niemożliwe, można jednak wyznaczyć A w warunkach gdy fotosynteza nie zachodzi, tj gdy P = 0, gdyż wtedy A = F + T. Przktycznie wykonuje się pomiar przy bardzo dużym natężeniu światła, wielokrotnie przekraczającym próg wysycenia

fotosyntezy - w tych warunkach P stanowi nieznaczną część A i można ją zaniedbać. Wartość zmierzoną w ten sposób można oznaczyć jako DM.

Pomiar określający P (czyli A - (F+T)) należy natomiast przeprowadzić w warunkach gdy P jest maksymalne, a zatem optymalnych dla fotosyntetycznego przepływu elektronów. Uzyskaną wartość oznaczymy jako D0.

Wyniki tych pomiarów będą więc opisywać maksymalną wydajność fotosyntezy wg równania:

Y = DM - D0 / DM = (TM+FM) - (T0+F0) / (TM+FM)

Jeżeli pomiary DM i D0 wykonamy w bardzo krótkim odstępie czasu, to stosunek F/T pozostanie w obydwu z nich stały, FM / TM = F0 / T0, z czego wynika że D0 / DM = F0 / FM.

Dzięki temu do określenia Y można wykorzystać łatwe do zmierzenia wydajności kwantowe fluorescencji:

Y = (FM - F0) / FM.

(FM - F0) jest często oznaczane symbolem FV i nosi nazwę fluorescencji zmiennej.

W praktyce stosowane są dwie metody pomiarowe.

a). Metoda wzbudzenia impulsowego (PAM = Pulse Amplitude Modulation) wykorzystuje możliwość rejestracji fluorescencji wzbudzanej modulowanymi impulsami o niskim natężeniu.

Najpierw rejestruje się intensywność fluorescencji indukowanej podczas oświetlania wyłącznie impulsami, co

odpowiada F0 (niskie natężenie światła, maksymalna wydajność fluorescencji) a następnie próbkę dodatkowo

oświetla się bardzo silnym światłem ciągłym, którego intensywność wielokrotnie przekracza próg wysycenia

fotosyntezy. Fluorescencja indukowana przez to światło nie jest jednak rejestrowana, natomiast intensywność

fluorescencji indukowanej w tych warunkach przez impulsy odpowiada fluorescencji "bez fotosyntezy" a więc

jest to FM.

b). Metoda krzywej Kautsky'ego

Krzywa Kautsky'ego przedstawia zmiany intensywności fluorescencji chlorofilu w aparacie fotosyntetycznym

po silnym oświetleniu zaciemnionej przedtem próbki. W pierwszym momencie fluorescencja jest na poziomie

F0, gdyż procesy fotochemiczne zachodzą z maksymalną wydajnością. Bardzo szybko jednak poszczególne

przenośniki elektronów fazy świetlnej (jasnej) fotosyntezy wysycają się, co obrazują punkty przegięcia krzywej,

aż do całkowitego wysycenia aparatu fotosyntetycznego i osiągnięcia poziomu odpowiadającego FM. Dla

zachowania założenia FM / TM = F0 / T0 czas osiągania FM musi być krótszy niż 1 s, co wymaga dużej

intensywności światła wzbudzającego (ponad 3000 µE m-2 s-1). To z kolei pociąga za sobą bardzo krótki czas w

którym próbka wykazuje F0 - zwykle 20 - 50 µs a to wymaga dużej rozdzielczości czasowej stosowanych

fluorymetrów.

Materiał roślinny

Przygotować liście roślin lub inne próbki fotosyntetycznie aktywne o spodziewanej różnej

wydajności fotosyntezy. UWAGA! Próbki muszą pochodzić z obiektów o ustalonej

przynależności systematycznej!

Przebieg doświadczenia:

Próbki przeznaczone do pomiaru inkubować w ciemności przez min. 15 min. Do aparatów

Hansatech, mierzących met. krzywej Kautsky'ego próbki zaciemnia sie przy użyciu klipsów

(pamiętac o zasunięciu zasuwek!), do aparatu Walz - PAM 210 materiał włożyć do ciemnej

szafkilub szuflady a dalsze operacje wykonywać w stłumionym lub zielonym świetle wg.

wskazówek prowadzącego ćwiczenia.

Sposób opracowania wyników:

Wyniki przedstawić w tabeli:

Gatunek

stan fizjologiczny próbki

FM

Y = FV/FM

Interpretacja wyników

Ustosunkować się do zależności między FM i FV/FM a stanem fizjologicznym próbki oraz do

zróżnicowania międzygatunkowego zmierzonych parametrów.