EKSTRAKCJA OLEJKÓW ETERYCZNYCH Z MATERIAŁU ROSLINNEGO
ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- EKSTRAKCJA OLEJKÓW ETERYCZNYCH Z MATERIAAU ROŚLINNEGO Biosynteza metabolitów wtórnych jest ściśle powiązana z przemianami metabolizmu podstawowego poprzez wspólne metabolity pośrednie (np. ufosforylowane cukry, acetylo-CoA, malonylo-CoA, aminokwasy białkowe) czy też poprzez enzymatycznie modyfikowane pochodne metabolitów szlaków podstawowych (np. aminocukry, propionylo-CoA, metylomanoly-CoA, aminokwasy niebiałkowe). Poniższa tabela przedstawia przykłady prekursorów zużywanych w syntezach specyficznych, ich charakterystykę oraz metabolity specyficzne powstające z tych prekursorów. Typy Przykłady prekursorów Idiolity powstające z tych prekursorów prekursorów Aktywne acetylo-CoA, propionylo-CoA, Poliketydy np. antracykliny, formy kwasów malonylo-CoA, amidomalonylo- tetracykliny, ryfamycyny, tłuszczowych CoA, metylomalonylo-CoA flawonoidy, mewalonian, składniki olejków eterycznych, Jednostki pirofosforan izopentenylu żywic, sterydy, pochodne izoprenowe karotenowców, L-ą-aminokwasy, D-Ala, D-Wal, cyklosporyny, antybiotyki -laktamowe, gramicydyna, Aminokwasy i D-Phe, -Ser, -Tyr, -Lys, alkaloidy (np. nikotyna, kokaina), ich pochodne iminokwasy, pochodne N-metylowe olejki gorczyczne aminokwasów, dehydroaminokwasy p-aminobenzoesan, choryzmian, pochodne kwasów fenolowych np. aminokwasy aromatyczne kumaryny, flawonoidy, Prekursory alkaloidy (np. morfina, kodeina, kol- aromatyczne chicyna, papaweryna, chinina, strychnina) ufosforylowane cukry proste, aminocukry, metyloaminocukry, poliketydy, polieny, antybiotyki Cukry i ich deoksycukry (np. streptoza), aminoglikozydowe, pochodne cyklitole (np. inozytol), fruktany, glukany (np. dekstran) aminocyklitole (np. streptydyna) Zasady zasady purynowe i pirymidynowe alkaloidy (kofeina, teobromina, azotowe teofilina) 1 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Budowa i występowanie olejków eterycznych W naszym klimacie olejki eteryczne najczęściej pozyskuje się z roślin należących do następujących rodzin: baldaszkowatych (Umbelliferae), krzyżowych (Cruciferae), liliowatych (Liliaceae), różowatych (Rosceae), wargowych (Labiatae), złożonych (Compositae). Olejki wytwarzane są w wyspecjalizowanych tkankach wydzielniczych. W komórce powstają tylko w cytoplazmie przy udziale struktur Golgiego i retikulum endoplazmatycznego. Są one uważane za końcowe produkty przemiany materii. Gęstość właściwa większości olejków jest mniejsza niż wody. W temperaturze pokojowej olejki mają zwykle konsystencję płynną, rzadziej mazistą, a wyjątkowo zestalają się (olejek anyżowy). Najczęściej są bezbarwne, ale mogą być lekko żółte, brunatnawe, błękitne i zielone. Bardzo słabo rozpuszczają się w wodzie, natomiast stosunkowo łatwo rozpuszczają się w tłuszczach, rozpuszczalnikach organicznych oraz innych olejkach eterycznych. Olejki są optycznie czynne - prawo- i lewoskrętne. Temperatury wrzenia mieszczą się zwykle w przedziale 150-300 OC. W temperaturze poniżej 0OC niektóre olejki eteryczne wydzielają związki stałe, najczęściej w postaci krystalicznej, które zwane są stearoptenami. Na przykład z olejku miętowego uzyskuje się w ten sposób mentol, z olejku anyżowego - anetol, z kamforowego - kamforę. Jeden olejek przeważnie składa się z kilkudziesięciu związków o różnym stężeniu, pochodzeniu i charakterze biogenetycznym. Najważniejsze składniki olejków eterycznych należą do związków terpenowych i ich pochodnych. W ich składzie można ponadto spotkać inne niż terpeny substancje zapachowe, np. estry (octan linalilu), alkohole (benzylowy, fenylowy), aldehydy (cynamonowy, benzoesowy), ketony (iron), fenole (tymol), etery (anetol, eugenol), węglowodory, kumaryny, kwasy organiczne. Skład olejku zależy też od części rośliny, z których jest otrzymywany. W przypadku drzewa cynamonowego, głównym składnikiem olejku eterycznego zawartego w liściach jest eugenol, podczas gdy w olejku z kory dominuje aldehyd cynamonowy. 2 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Charakterystyka niektórych olejków eterycznych Aktywność Występowanie Zapach Główny składnik aromatoterapeutyczna Skórka cytryny cytrynowy D-limonen, cytral bakteriobójcza infekcje górnych dróg Igły jodły pospolitej balsamiczny pinen, limonen oddechowych Skórka pomarańczy antydepresyjna, pomarańczowy nerol, limonen słodkiej lekko uspokajająca antyseptyczna, łagodząca, Ziele mięty miętowy mentol, menton stymulująca trawienie, pieprzowej znieczulająca Nasiona kminku kminkowy karwon, limonen łagodząca geraniol, cytronelol, Płatki kwiatów róży stymulująca, afrodyzjalna, różany alkohol damasceńskiej antyinfekcyjna fenyloetylowy pinen, kareny, antyseptyczna, Igły sosny żywiczny kadiden immunostymulująca stymulująca, uspokajająca, octan linalilu, antyseptyczna, Nasiona lawendy lawendowy geraniol przeciwgrzybicza, przeciwbólowa przeciwbakteryjna, eukaliptol, cyneol, Liście eukaliptusa orzezwiający przeciwwirusowa, łagodząca, pinen, kamfen pobudzająca, przeciwbólowa -tujon, pinen, stymulująca, łagodząca Ziele szałwi gorzko ziołowy salwen, kamfen, depresje, ułatwiająca borneol oddychanie immunostymulująca, Ziele tymianku tymolowy tymol pobudzająca TERPENY wchodzące w skład olejków eterycznych to: Ą% hemiterpeny ( jedna jednostka izoprenowa-1xC5), Ą% monoterpeny (dwie jednostki izoprenowe-2xC5) acykliczne, monocykliczne lub dwucykliczne Ą% seskwiterpeny ( trzy jednostki izoprenowe-3xC5). 3 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Hemiterpeny - kwas metyloetylooctowy z olejku arcydzięglowego COOH CH3 CH2 CH - kwas izowalerianowy z olejku walerianowego - alkohol izoamylowy z olejku miętowego CH3 - prenol z olejku kopru włoskiego kwas metyloetylooctowy H3C H3C H3C CH CH2 COOH CH2OH CH CH2 CH2OH CH C 20 H3C H3C H3C kwas izowalerianowy prenol alkohol izoamylowy Monoterpeny (C10H16) W olejkach monoterpeny stanowią najliczniejszą grupę związków. Są one bardzo lotne i mają intensywny zapach. Związki te charakteryzują się dużą różnorodnością struktur związanych z możliwością cyklizacji, obecności podwójnych wiązań, izomerii strukturalnej i optycznej. Ze względu na budowę monoterpeny oraz ich pochodne (najczęściej tlenowe), czyli monoterpenoidy, można podzielić na niecykliczne, jednopierścieniowe, i dwupierścieniowe. Ze względu na stopień utlenienia w wymienionych monoterpenach i monoterpenoidach można wyróżnić węglowodory, alkohole, aldehydy, ketony, kwasy, estry i tlenki. monoterpeny niecykliczne: cytronelol olejek różany i pelargoniowy; geraniol olejek różany, pelargoniowy i cytrynowy. CH2OH CH2OH OH OH H H izomery cytronelolu izomery geraniolu 4 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- monoterpeny jednopierścieniowe: limonen olejek pomarańczowy, cytrynowy, kminkowy, świerkowy, jodłowy; ą-terpinen składnik olejku kolendrowego i pomarańczowego; mentol składnik olejku mięty pieprzowej. OH limonen terpinen (-)-mentol monoterpeny dwupierścieniowe: stanowią jedną z najbardziej zróżnicowanych grup terpenoidów i dzielą się pod względem budowy szkieletu węglowego na siedem głównych grup. Najważniejsze to grupa tujanu - ą-tujon olejek tujowy i ziele piołunu; grupa karanu - 3-karen z olejku sosnowego oraz grupa pinenu, której przedstawicielem jest kamfora z olejku kamforowego. O O kamfora tujon 3-karen Seskwiterpeny C15H24 Stanowią dużą grupę związków. Są gęstymi lepkimi cieczami, wrzącymi powyżej 250 OC , nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast łatwo ulegają rozpuszczeniu w rozpuszczalnikach organicznych. Możemy wśród nich wyróżnić związki acykliczne, monocykliczne, dwucykliczne i trójcykliczne. Przykłady seskwiterpenów to farnezol składnik olejku konwaliowego, lipowego, muszkatołowego, akacjowego; bisabolen - z olejku bergamotowego oraz roślin cytrusowych; kadiden olejek sosnowy. 5 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- OH farnezol H H bisabolen kadinen ZWIZKI AROMATYCZNE wchodzące w skład olejków eterycznych to węglowodory aromatyczne i ich pochodne, fenole i ich pochodne oraz heterocykliczne pochodne związków aromatycznych. Bardzo często są one syntetyzowane z jednostek izoprenoidowych (tak jak terpenoidy) a nie w przemianach pierścienia aromatycznego (cykl szikimowy). węglowodory aromatyczne - na uwagę zasługują tutaj alkohol i aldehyd kuminowy, istotne składniki olejku otrzymywanego z kminu rzymskiego, aldehyd anyżowy oraz główne składniki olejku cynamonowego (alkohol, aldehyd i kwas cynamonowy). CHO CH=CH-COOH CH=CH-CH2OH kw. cynamonowy ald. kuminowy alk. cynamonowy fenole i ich pochodne Przykładem fenoli jednowodorotlenowych są anetol oraz estragol składniki olejku estragonowego a także tymol składnik olejku tymiankowego. Do fenoli dwuwodorotlenowych należy eugenol składnik ziela angielskiego i liści laurowych. 6 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- CH2CH=CH2 CH2CH=CH2 OH OMe OMe OH tymol anetol eugenol METODY EKSTRAKCJI OLEJKÓW ETERYCZNYCH Olejki eteryczne wydobywa się z różnych części roślin, np. z kwiatów, owoców, liści, drewna, łodyg, kłączy czy też nasion roślin uprawnych lub dziko rosnących. Olejki eteryczne można otrzymać z materiału roślinnego różnymi sposobami, najczęściej przez destylację z parą wodną, ale również przez wytłaczanie, ekstrakcję rozpuszczalnikami, a te najcenniejsze ekstrahuje się tłuszczami, np. olejek jaśminowy czy różany. Do oddestylowania olejków eterycznych służy aparat Derynga, wykorzystywany w przemyśle zielarskim do przeprowadzania ilościowej analizy zawartości olejków eterycznych w materiale roślinnym w celu określenia wartości leczniczych danego surowca. W zależności od rodzaju materiału roślinnego, destylacje prowadzi się parą wodną z dodatkiem lub bez m-ksylenu lub kwasu siarkowego. Wielkość naważki dobiera się w zależności od spodziewanej ilości olejku. Nieodzownym warunkiem sprawnego działania aparatu jest jego czystość. Pozostające po oznaczeniu resztki olejku usuwa się przepłukując aparat spirytusem lub acetonem. Aparat składa się z okrągłodennej kolby szklanej oraz z części zasadniczej, w której skład wchodzi kolumna destylacyjna, chłodnica i odbieralnik, które są połączone za pomocą kurka trójdrożnego, co pozwala uzyskać zamknięty obieg wody w czasie destylacji. Kolumna destylacyjna, połączona za pomocą szlifu z kolbą okrągłodenną, przechodzi do chłodnicy wodnej tworząc rurkę kondensacyjną. Przed destylacją wprowadzamy do rurki kondensacyjnej wodę, na powierzchni, której zbiera się oddestylowany olejek. Rurka kondensacyjna przechodzi poniżej chłodnicy w część kalibrowaną, stanowiącą odbieralnik zaopatrzony w podziałkę. 7 ZAKAAD BIOCHEMII METABOLIZM IV rok Biochemii UMCS WTÓRNY i Biotechnologii -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Dokładnie odważyć próbkę surowca (10g / 100 ml wody destylowanej) i natychmiast umieścić w kolbie. Najpierw zalać połową ilości wody, a po wymieszaniu zawartości kolby, spłukać surowiec ze ścianek pozostałą jej częścią. Do kolby dodać kawałki porcelanki!!! Kolbę połączyć z aparatem Derynga, napełnić odbieralnik wodą, włączyć chłodzenie i ogrzewać 2 godziny, licząc od chwili rozpoczęcia wrzenia zawartości kolby. Po zakończeniu destylacji chłodzenie wyłączyć, olejek sprowadzić na mikroskali i odczytać otrzymany wynik. Odczytaną ilość olejku przeliczyć na 100 gramów surowca roślinnego. 2. Dla wybranej próbki olejku eterycznego sporządzić widmo w UV na spektrofotometrze (5 l olejku rozpuścić w 5 ml etanolu). 3. Dla wybranych dwóch olejków wykonać chromatografię cienkowarstwową. Na linię startu nanieść 10 l olejku, wysuszyć i rozwijać w mieszaninie chloroform : benzen (3:1). Po rozwinięciu chromatogramu, płytkę wysuszyć i spryskać bardzo ostrożnie roztworem waniliny w kwasie siarkowym. FORMA ZALICZENIA Przedstawić opis doświadczenia w zeszycie wraz z rysunkiem aparatu Derynga i z charakterystyką otrzymanego materiału roślinnego. Dołączyć wyniki pomiaru spektro- fotometrycznego (kopię lub oryginał) oraz podać ilość wydzielonego podczas destylacji olejku eterycznego. Narysować wybarwioną płytkę chromatograficzną. ODCZYNNIKI 1. Zestaw do chromatografii cienkowarstwowej (mieszanina rozwijająca- chloroform : benzen (3:1), 1% roztwór waniliny w stężonym kwasie siarkowym) 2. Aparat Derynga 3. Materiał roślinny (melisa, lawenda, mięta, skórki pomarańczowe, skórki cytrynowe) 4. Wzorce olejków eterycznych 8