1
II.2. WYPOSAŻENIE LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNEGO
ŻENIE LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNEGO
2.1. Podstawowa aparatura mikrobiologiczna
2.1. Podstawowa aparatura mikrobiologiczna
Autoklaw
Urządzenie służące do sterylizacji niektórych poż ętu mikrobiologicznego (płytki Petriego, kolby,
ą żące ż ę
ą żą do sterylizacji niektórych pożywek oraz jałowienia drobnego sprzętu mikrobiologicznego (płytki Petriego, k
probówki, zlewki, butelki).
probówki, zlewki, butelki).
Rys.2. Widok ogólny autoklawu (1):
Rys.2. Widok ogólny autoklawu (1):
1. Gałka zaworu bezpieczeństwa,
1. Gałka zaworu bezpieczeństwa,
2. Manometr komory steryliza
2. Manometr komory sterylizacyjnej,
3. Manometr kotła,
4. Zawór trójdrożny manometru,
żny manometru,
5. Termometr tarczowy wskazujÄ… Ä™
5. Termometr tarczowy wskazujÄ…cy temperaturÄ™ w komorze,
6. RÄ…czka zamka pokrywy,
7. Dz
wignia zaworu sterujÄ…cego,
z
wignia zaworu sterujÄ…cego,
8. Zawór doprowadzający parę
ący parę do kotła,
9. Dz
wignia zaworu selekcyjnego,
10. Wskaz
nik poziomu wody w komorze
11. Zawór odpowietrzający komorę,
12. Zawór odprowadzający kondensat z komory sterylizacyjnej
Autoklaw to hermetycznie zamknięty kocioł stalowy o podwójnych ś ę śnienie. Jest zaopatrzony w manometr, termometr, zawór
ęty ścianach i dnie, w którym uzyskuje się wysokie ciśnienie. Jest
ę kocioł stalowy o podwójnych ś ę ś
bezpieczeństwa i elektryczny system grzewczy. Czynnikiem jałowią w autoklawie jest przegrzana nasycona para wodna pod zwiększonym ciśnieniem. W aparacie gotująca
Å„stwa Ä…cym Ä™
ń i elektryczny system grzewczy. Czynnikiem jałowiącym w autoklawie jest przegrzana nasycona para wodna pod zwię
woda doprowadza do nadciśnienia parę wodną, która ulega nasyceniu po zupełnym wyparciu powietrza. Manometr znajdują się w obudowie wskazuje wzrost ciśnienia po
a nasyceniu po zupełnym wyparciu powietrza. Manometr znajdujący się w obudowie wskazuje wzrost ciś
Ä…cy Ä™ Å›
zamknięciu zaworu odpowietrzającego. Większość podłoży wyjaławia się żywki zawierające cukry i inne składniki termowrażliwe
Ä™ Ä… Ä™ ść ży wyjaÅ‚awia siÄ™ w temperaturze 121°C przez 20  30 min, pożywki zawierajÄ…
- 117°C, a materiaÅ‚ zawierajÄ…cy drobnoustroje zakaz
ne w temperaturze 134°C.Ponieważ Ä…cy pod wysokim ciÅ›nieniem, stÄ…d osoby go obsÅ‚ugujÄ…ce
Ä… z
ne ż ą
Ä… z
w temperaturze 134°C.Ponieważ autoklaw to kocioÅ‚ pracujÄ…cy pod wysokim ci
muszą przejść odpowiednie szkolenie. W przypadku zauważenia jakichkolwiek u ści, niekontrolowany wzrost ciśnienia i temperatury) autoklaw należy
ą ść żenia jakichkolwiek usterek (nieszczelności, niekontrolowany wzrost ciś ż
natychmiast odłączyć od z
ródła zasilania i za pomocą zaworu bezpieczeń ć ś
ą ć z
ą zaworu bezpieczeństwa zredukować ciśnienie.
Pasteryzator
Typowym pasteryzatorem jest aparat Kocha. Jest to lekki, metalowy kocioł parowy z dodatkowym aż dnem, pod którym znajduje się zbiornik z wodą. Kocioł przykryty
etalowy kocioł parowy z dodatkowym ażurowym dnem, pod którym znajduje się ą
żurowym ę ą
jest luz
ną pokrywą z otworem na termometr i wylot pary wodnej. W obudowie znajduje się ż z
y
ródłem wytwarzanej pary jest woda znajdująca
z
ą ą ę ż z
y

z
ą ą z otworem na termometr i wylot pary wodnej. W obudowie znajduje się również wskaz
nik poziomu wody. y
ródłem
siÄ™ na dnie kotÅ‚a, którÄ… doprowadza do wrzenia system grzaÅ‚ek. Czynnikiem wyjawiajÄ… żąca para wodna o temperaturze okoÅ‚o 100°C. SÅ‚uży do wyjaÅ‚awiania
ę ą ą żą
ę ą doprowadza do wrzenia system grzałek. Czynnikiem wyjawiającym jest bieżąca para wodna o temperaturze
pożywek mikrobiologicznych zawierających termowrażliwe składniki. Wyjaławiany n ę żurowych półkach. Czas pasteryzacji zależy od objętości i rodzaju
ż ą żliwe składniki. Wyjaławiany nateriał ustawia się na ażurowych półkach. Czas pasteryzacji zależ ę ś
wyjaławianego materiału i wynosi od 15-60 min.
Rys.3. Aparat Kocha (10)
Suszarki
Zaopatrzone w termoregulator urzą ą ą żą sterylizacji szkła
Zaopatrzone w termoregulator urządzenia ogrzewane energią elektryczną, służące do sterylizacji szkła
laboratoryjnego i niektórych zwią ż
laboratoryjnego i niektórych związków chemicznych oraz suszenia różnych substancji. Czynnikiem
wyjaławiającym jest suche, gorące powietrze. Czas jałowienia w temperaturze 1600C trwa na ogół 2 godziny.
ą ące powietrze. Czas jałowienia w temperaturze 160 C trwa na ogół 2 godziny.
Termostaty (cieplarki)
Służą do hodowli drobnoustrojów. Są
hodowli drobnoustrojów. Są to specjalne szafki wykonane z blachy stalowej (lub drewna),
zaopatrzone w płaszcz powietrzny lub wodny, który zapobiega utracie ciepła i niepożą wahaniom
zaopatrzone w płaszcz powietrzny lub wodny, który zapobiega utracie ciepła i niepożądanym wahaniom
żądanym
temperatury. W środku wyposażone są ż rganizmów. Termostaty są zasilane
ś żone są w ażurowe półki na hodowle mikroorganizmów. Termostaty są
energiÄ… elektrycznÄ…, a wymagana temperatura jest ustawiana i utrzymywana dziÄ™ tzw. termometrom
ą ą, ęki
ą ą a wymagana temperatura jest ustawiana i utrzymywana dzięki tzw. termometrom
kontaktowym.
Anaerostaty
Specjalne, hermetycznie zamykane aparaty do hodowli bakterii w warunkach beztlenowych. Zamiast powie
Specjalne, hermetycznie zamykane aparaty do hodowli bakterii w warunkach beztlenowych. Zamiast powie
Specjalne, hermetycznie zamykane aparaty do hodowli bakterii w warunkach beztlenowych. Zamiast powietrza
mogą być wypełnione gazem oboję ą z
ż ą zaopatrzone w pochłaniacze tlenu. Jest to
ą ć wypełnione gazem obojętnym (CO2 lub N2) bądz
też są zaopatrzone w pochłaniacze tlenu. Jest to
najczęściej mieszanina węglanu potasowego, pirogallolu i ziemi okrzemkowej.
ęś ęglanu potasowego, pirogallolu i ziemi okrzemkowej. Obecnie wiele firm
wytwarzajÄ…cych produkty do diagnostyki mikrobiologicznej poleca specjalne zestawy do wytwarzania
Ä…cych produkty do diagnostyki mikrobiologicznej poleca specjalne zestawy do wytwarzania
środowisk gazowych wśród których znajdują ę ś
ś śród ą ę środowiska beztlenowego; zestawy do
ś ś których znajdują się: zestawy do uzyskiwania środowiska beztlenowego; zestawy do
uzyskiwania atmosfery mikroaerofilnej; zestawy do hodowli organizmów wymagają CO
uzyskiwania atmosfery mikroaerofilnej; zestawy do hodowli organizmów wymagających do wzrostu CO2.
Rys.4. Anaerostat (10) ---
1. Åšruba mocujÄ…ca.
2. Pokrywa.
3. Saszetka z substancją pochłaniająą
ąpochłaniającą.
4. PÅ‚ytki Petriego.
5. Saszetka ze wskaz
nikiem warunków beztlenowych
z
nikiem warunków beztlenowych
WytrzÄ…sarki
Urządzenia umożliwiające hodowlę wgłę ą ż ynnych w warunkach tlenowych. Dzięki wytrząsaniu (rotacji) uzyskuje
ą ż ące hodowlę wgłębną drobnoustrojów w podłożach płynnych w warunkach tlenowych. Dzię ą
się lepsze napowietrzenie hodowli. W zależ ś ż ą ruchu posuwisto
ę lepsze napowietrzenie hodowli. W zależności od rodzaju ruchu wyróżniamy wytrząsarki:a) o ruchu posuwisto - zwrotnym z regulowaną amplitudą
drgań, b) rotacyjne z regulowanym skokiem drg
rotacyjne z regulowanym skokiem drgań
Temperaturę inkubacji utrzymuje własna komora cieplna (wodna  łaz
nia bakteriologiczna lub powietrzna), a wytrzÄ… Ä™
ę inkubacji utrzymuje własna komora cieplna (wodna z
nia bakteriologiczna lub powietrzna), a wytrzÄ…sarki bez komory umieszcza siÄ™
w pomieszczeniach o regulowanej temperaturze. Stosowane są ż ą ń ń glebowych lub rozcieńczeń z innych materiałów.
w pomieszczeniach o regulowanej temperaturze. Stosowane są również do sporządzania rozcieńczeń glebowych lub r
ą ż ą ń ń
Boksy (szafy) laminarne
Służą do wykonywania posiewów i przeszczepów mikroorganizmów, zabezpieczają badany materiał przed przypadkowymi zanieczyszczeniami z
żą ąc
żą do wykonywania posiewów i przeszczepów mikroorganizmów, zabezpieczając badany materiał przed przypadkowymi zanieczyszcz
powietrza oraz zapewniając bezpieczeń ą ś ą to boksy, w którym następuje przepływ powietrza w
ąc bezpieczeństwo pracy osobom wykonującym te czynności. Są to boksy, w którym nastę
układzie liniowym (pionowo lub poziomo) z określoną szybkoś ą ść powietrza w boksach oraz w pomieszczeniu ich usytuowania zapewniają zainstalowane w
ś ą ś ą ść
ś ą szybkością. Jałowość powietrza w boksach oraz w pomieszczeniu ich usytuow
obudowy filtry powietrza. Mogą to być filtry absolutne typu HEPA, które w 99,9% zatrzymują ą ś m lub filtry z węglem aktywnym absorbujące szkodliwe
ć filtry absolutne typu HEPA, które w 99,9% zatrzymujÄ… czÄ…stki o Å›rednicy 0,3 µm lub filtry z wÄ™ Ä…
czynniki zawiesin koloidalnych oraz gazy. Dodatkowym wyposaż hrony badanego materiału i pracownika.
czynniki zawiesin koloidalnych oraz gazy. Dodatkowym wyposażeniem boksów jest lampa UV, palnik oraz szyba uchylna do ochrony badanego materiału i pracownika.
Rys.5. Szafa laminarna z poziomym przepływem powietrza (10) (powyżej)
Rys.5. Szafa laminarna z poziomym przepływem powietrza (10)
2
Lampy bakteriologiczne
Są wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń, np. hal produkcyjnych,
laboratoriów, kamer do szczepień. y
ródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95% statyczne lub zabójcze promieniowanie o
długości fali 258 nm. Ponieważ promieniowanie to charakteryzuje się słabą przenikliwością (nie przenika przez zwykłe szkło), stąd nie jest wykorzystywane do wyjaławiania
szkła i podłoży agarowych.
Filtry
Ponieważ pory filtrów są mniejsze od wymiarów bakterii, są wykorzystywane do jałowienia  na zimno płynnych produktów (podłoży, buforów, płynów ustrojowych i innych
termowrażliwych składników podłoży. Można je również stosować w metodach wydzielania toksyn z hodowli płynnej, enzymów lub innych produktów metabolizmu, a także
do oznaczania liczby drobnoustrojów występujących w płynach o niewielkim skażeniu (woda, wino, klarowne soki, itp.).
Sączenie przez filtry przebiega jednak bardzo wolno, dlatego też proces sączenia przeprowadza się w warunkach podciśnienia, wykorzystując w tym celu pompy próżniowe. W
pracy mikrobiologicznej wykorzystuje siÄ™ filtry:
Membranowe (rys.E) najczęściej stosowane. Charakteryzują się dużą zdolnością filtracyjną. Są wykonane z estrów lub octanów celulozy, polichlorku winylu lub teflonu o
Å›rednicy porów od 0,05  14,0 µm. MajÄ… postać cienkiej, sprężystej bÅ‚ony. DziÄ™ki zastosowaniu różnicy ciÅ›nieÅ„ (nad- i podciÅ›nienie) charakteryzujÄ… siÄ™ dużą szybkoÅ›ciÄ…
przepływu (40 cm3/min/cm2).
Rys.6. Filtry mikrobiologiczne (16, 24)
Mikroskopy  sprzęt służący do badania morfologii komórki drobnoustrojów. Omówienie w kolejnym rozdziale skryptu.
2.2. Drobny sprzęt i szkło laboratoryjne
Igła preparacyjna  prosty drucik osadzony w oprawce, służący do posiewów wgłębnych bakterii, sporządzania preparatów mikologicznych. Może
być zakończony haczykiem i wtedy służy do przeszczepiania grzybów.
Eza  wykonany ze specjalnego rodzaju stali, często platynowy i osadzony w oprawce drut zakończony oczkiem. Służy do posiewów, przesiewów,
sporządzania preparatów mikroskopowych.
Rys.7. Igła, eza. głaszczka (21)
Głaszczka  szklany wygięty pręt służący do posiewów powierzchniowych, rozsiewania materiału biologicznego.
PÅ‚ytki Petriego - dwie szklane (jednorazowe z tworzywa, najczęściej o Ø 10 cm) zachodzÄ…ce na siebie szalki wykorzystywane do
hodowli, liczenia i określania morfologii kolonii mikroorganizmów na pożywkach zestalonych.
Kolby, probówki szklane (ze szkła obojętnego i bez wygiętego kołnierzyka) używane do wykonania rozcieńczeń, sporządzania i
rozlewania pożywek, do posiewów i hodowli na pożywkach płynnym i zestalonych.
Rurki Durhama  małe szklane probóweczki (C), które zanurza się do góry dnem w probówkach z pożywką płynną (A). Służą do
zbierania pęcherzyków gazu (B) wydzielanego podczas procesów fermentacyjnych przeprowadzanych przez drobnoustroje.
Rys.8. Probówka z płynnym podłożem i rurką Durhama (24)
Pipety szklane / miarowe (1 25 cm3) używane do posiewów ilościowych.
Pipety pasteurowskie  wykonane ze szkła sodowego, zabezpieczone wacikiem (1) szklane rurki (2) stosowane do posiewów płynnych.
Rys.9. Pipeta pasteurowska (2)
Komory - służą do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.
" Komora Thoma (hemocytometr)  szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość 0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów o powierzchni 1/400
mm2. Każdy z tych kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm3.
Rys.10. Komora Thoma (21)
3
" Komora Bürkera - szklana pÅ‚ytka z 2 wgÅ‚Ä™bieniami (0,1 mm) i siatkÄ… podzielonÄ… na kwadraciki o boku 0,2 mm, powierzchni 0,04 mm2 i objÄ™toÅ›ci pod szkieÅ‚kiem
ębieniami ą ą
Ä™ (0,1 mm) i siatkÄ… Ä… na kwadraciki o boku 0,2 mm, powierzchni 0,04 mm
nakrywkowym 0,004 mm3;
" Komora Howarda  szklana, gruba płytka z wyżłobionym dołkiem o głębokości 0,1 mm, który przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, posiadającym 25
żłobionym ę ś ę ą
ż dołkiem o głę ś ę szkiełkiem nakrywkowym, posiadają
przez
roczystych pól o średnicy 1,382 mm. Stosowana w analizach obecnoś ś
z
średnicy 1,382 mm. Stosowana w analizach obecności grzybów pleśniowych w sokach.
Ponadto w pracowni mikrobiologicznej wykorzystuje się szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe, szkiełka z łezką (komora Lindnera) do preparatów przyż
biologicznej wykorzystuje się szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe, szkiełka z łezką Lindnera) do preparatów przyżyciowych, kolby i
ę ą (komora ż
czopy fermentacyjne, skalpele, pincety, szczypce, wanienki do barwienia, statywy na probówki, koszyki druciane i metalowe puszki do sterylizacji płytek Petriego i pipet.
skalpele, pincety, szczypce, wanienki do barwienia, statywy na probówki, koszyki druciane i metalowe puszki do sterylizacji płytek Petriego i pipet.
II.3. METODY JAA
OWIENIA
W badaniach mikrobiologicznych ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki ma higiena osobista oraz jałowość pomieszczeń ę
W badaniach mikrobiologicznych ogromny wpływ na uzyskiwane wyniki ma higiena osobista oraz jałowość pomieszczeń, sprzętu i pożywek, które są
ść ń ę
wykorzystywane w pracy. W metodach jałowienia, wykorzystywanych również spożywczego i w życiu codziennym, zastosowanie
jałowienia, wykorzystywanych również w medycynie, zakładach przetwórstwa rolno-spoż ż
mają następujące procesy:
Dezynfekcja. Terminem tym określa się  proces zabicia wszystkich form wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych i niechorobotwórczych za pomocą
proces zabicia wszystkich form wegetatywnych mikroorganizmów chorobotwórczych i niechorobotwórczych za pomocą
metod fizycznych, chemicznych i mechanicznych . Proces ten nie zapewnia całkowitej jałowoś ż ą aktywne formy przetrwalne bakterii.
 . Proces ten nie zapewnia całkowitej jałowości, gdyż pozostają aktywne formy przetrwalne bakterii.
ś ż ą
Sterylizacja. W ujęciu mikrobiologicznym sterylizacja to  ący na zabiciu wszystkich mikroorganizmów
ęciu mikrobiologicznym sterylizacja to  proces polegający na zabiciu wszystkich mikroorganizmów - niezależnie od stadium rozwojowego, a więc
zarówno form wegetatywnych, jak też form przetrwalnych .
Wyjaławianie przeprowadza się najczęściej przy użyciu metod fizycznych (temperatura, promieniowanie), mechanicznych (odfiltrowanie, odwirowanie) lub
ę ęściej przy uż chanicznych (odfiltrowanie, odwirowanie) lub
chemicznych.
3.1. Metody fizyczne
" Zastosowanie wysokich temperatur (na sucho lub na mokro):
(na sucho lub na mokro):
Wyżarzanie i opalanie. Ezy i igły wyżarza się do czerwoności w ś ą części płomienia palnika spirytusowego lub gazowego.
żarzanie i opalanie. ż ę ś świecącej ęści płomienia palnika spirytusowego lub gazowego.
Czynność tą wykonuje się przed i po każdym ich użyciu. Wyloty probówek, kolb i wszelkich naczyń, które są zamykane korkami, opala się po
ść ą ę ż ż ń ą
ść ą ę przed i po każ życiu. Wyloty probówek, kolb i wszelkich naczyń ą
otworzeniu w płomieniu palnika, co zapobiega zanieczyszczeniu hodowli. Pincety, skalpele, noże, bagietki, głaszczki opala się w płomieniu po
omieniu palnika, co zapobiega zanieczyszczeniu hodowli. Pincety, skalpele, noż bagietki, głaszczki opala się
że, ę
uprzednim zanurzeniu w alkoholu.
Rys. 11. Wyżarzanie ezy i opalanie wylotu probówki (21)
żarzanie ezy i opalanie wylotu probówki (21)
Gotowanie. Szkiełka podstawowe i nakrywkowe gotuje się w roztworze mydła lub środka myjącego, a następnie dokładnie płucze
. Szkiełka podstawowe i nakry ę środka myją ę
stosujÄ…c na koniec wodÄ™ destylowanÄ…. Po umyciu przechowuje siÄ™ je na sucho w specjalnych pojemnikach, bÄ…dz
też na mokro w 95% etanolu.
Ä… Ä™ Ä… Ä™ Ä… z
ż
Ä… Ä™ destylowanÄ… Ä™ je na sucho w specjalnych pojemnikach, bÄ… z
ż
Również metalowe narzędzia po oczysz ć w autoklawie (temperatura 121
ż ędzia po oczyszczeniu można wygotować (20 30 minut) lub wyjałowić w autoklawie (temperatura 1210C, 20 minut).
Gorące i suche powietrze ę do wyjaławiania szkła oraz niektórych związków chemicznych np.
Ä…ce i suche powietrze o temperaturze 160-180°C wykorzystuje siÄ™ do wyjaÅ‚awiania szkÅ‚a oraz niektórych zwiÄ…
węglanu wapnia, związków oleistych, wosku. Zabieg ten przeprowadza się w suszarkach laboratoryjnych.
stych, wosku. Zabieg ten przeprowadza siÄ™ w suszarkach laboratoryjnych.
Ä™
Ponieważ szkło nowe lub nieużywane wykazuje odczyn alkaliczny stąd przed sterylizacją i użyciem
ż żywane wykazuje odczyn alkaliczny stą ą ż
należy je wygotować w wodzie z dodatkiem 1% HCl (30 min), wypłukać i ponownie wygotować w 1%
ż ć w wodzie z dodatkiem 1% HCl (30 min), wypłukać ć
roztworze Na2CO3 (30 minut). Po dokładnym wypłukaniu w wodzie bieżącej i destylowanej,
(30 minut). Po dokładnym wypłukaniu w wodzie bieżą
wysuszeniu, pakuje się je w papier, folię aluminiową lub też ę
ę ę ą lub też umieszcza się w metalowych puszkach i
sterylizuje przez 2 godz. w temperaturze 160°C.
Przed włożeniem do suszarki kolby, probówki i pipety zamyka się korkami. Z uwagi na możliwość
do suszarki kolby, probówki i pipety zamyka się ż ść
samozapÅ‚onu i zwÄ™glenia temperatury 180°C nie można przekraczać podczas sterylizacji probówek z
ę żna przekraczać
korkami z waty lub ligniny oraz szkła opakowanego w papier. Wysokie temperatury o
korkami z waty lub ligniny oraz szkła opakowanego w papier. Wysokie temperatury obniżają także
trwałość szkła laboratoryjnego, a niedokładne wysuszenie powoduje jego pę
ść szkła laboratoryjnego, a niedokładne wysuszenie powoduje jego pękanie.
Rys.12. PÅ‚ytki Petriego przygotowane do sterylizacji (2)
Gorąca bieżąca para wodna. Jest wykorzystywana w procesie pasteryzacji (łagodnej
. Jest wykorzystywana w procesie pasteryzacji (Å‚agodnej
sterylizacji) w aparacie Kocha. Pasteryzacja polega na jednokrotnym ogrzaniu wyjaławianego materiału do temperatury
polega na jednokrotnym ogrzaniu wyjaławianego materiału do temperatury
ok.100°C. W procesie tym ginÄ… jedynie formy wegetatywne, natomiast nie ulegajÄ… czeniu formy przetrwalne bakterii, które wytrzymujÄ… wielogodzinne gotowanie. Proces
ą jedynie formy wegetatywne, natomiast nie ulegają zniszczeniu formy przetrwalne bakterii, które wytrzymują
pasteryzacji stosuje siÄ™ w przypadku podÅ‚oży mikrobiologicznych i produktów żywnoÅ›ciowych, których skÅ‚adniki w temperaturach powyżej 100°C mogÄ… ulegać rozkÅ‚adowi, a
ę ży ż ś
ę ż mikrobiologicznych i produktów ż ściowych, których składniki w temperaturach
także konserw o pH poniżej 4,5 (mikroorganizmy acidofilne charakteryzuje obniż ść
żej 4,5 (mikroorganizmy acidofilne charakteryzuje obniżona odporność cieplna).
WiÄ™kszość podÅ‚oży mikrobiologicznych poddaje siÄ™ dziaÅ‚aniu temperatury w granicach 100°C przez od 15 żliwe na wysokie temperatury produkty (mleko,
Ä™ ść ż Ä™ dziaÅ‚aniu temperatury w granicach 100°C przez od 15 - 30 minut. Wrażliwe na wysokie temperatury produkty (mleko,
śmietanki, moszcz, soki, piwo i inne) wyjaławia się wykorzystują
Å› Ä™ wykorzystujÄ…c modyfikacje tego procesu. Jest to pasteryzacja:
" dÅ‚ugotrwaÅ‚a (niska; LTLT  Low Temperature Short Time): temperatura 62 - 65°C / 20 - 30 minut;
Low Temperature Short Time): temperatura 62
" krótkotrwaÅ‚a (wysoka; HTST  High Temperature Short Time); temperatura 72°C / 15 sekund;
Short Time); temperatura 72°C / 15 sekund;
" momentalna: temperatura 85 - 90°C / 1  2 s.
Z praktycznego punktu widzenia pasteryzacja jest zabiegiem wystarczajÄ…cym, jeÅ›li nastÄ™pnie produkt zostanie schÅ‚odzony do 2-4°C i hermetycznie zamkniÄ™ty, co
Z praktycznego punktu widzenia pasteryzacja jest zabiegiem wystarczają ś ępnie produkt zostanie schłodzony do 2
Ä… Å› Ä™
uniemożliwia rozwój przeżywających ten zabieg mikroorganizmów.
ż ących ten zabieg mikroorganizmów.
OdmianÄ… pasteryzacji jest tyndalizacja (pasteryzacja frakcjonowana). Jest to trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstÄ™
(pasteryzacja frakcjonowana). Jest to trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstÄ™
(pasteryzacja frakcjonowana). Jest to trzykrotna pasteryzacja przeprowadzana w odstępach co 24 godziny. W pierwszej fazie
giną formy wegetatywne. Okres przerwy po pierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy
ierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy
ierwszej pasteryzacji pozwala na wykiełkowanie form przetrwalnych, które nie uległy zabiciu. Druga pasteryzacja zabija formy
wegetatywne, które rozwinęły się z form przetrwalnych, a trzecia upewnia nas o zabiciu wszystkich drobnoustrojów.
ę ę z form przetrwalnych, a trzecia upewnia nas o zabiciu wszystkich drobnoustrojów.
Gorąca para wodna pod ciśnieniem. Aby uzyskać ś ć w optymalnej temperaturze, przy odpowiednim
Aby uzyskać właściwy efekt sterylizacji w autoklawie proces musi przebiegać w optymalnej temperaturze, przy odpowiednim
ć ś ć
ciśnieniu i przez określony czas. Pomiędzy ciśnieniem a temperaturą ą ż ę ą a efektem sterylizacji istnieją ścisłe zależności:przy
ś ś ę śnieniem a temperaturą wewnątrz autoklawu, a także pomiędzy temperaturą a efektem sterylizacji istnieją ś ż ś
nadciśnieniu:
0,0 atm. temperatura w autoklawie wynosi 100ºC
0,5 atm. - 111,7° (112°) C
1,0 atm. - 120,6° (121°) C
4
2,0 atm. - 133,9° (134°) C.
podobne efekty odkażania uzyskuje się stosując nw. temperatury i czas ekspozycji:
121°C przez 2 minuty;
110°C - 20 minut;
100°C - 200 minut.
Zatem im wyższe jest ciśnienie wewnątrz kotła tym wyższe są temperatury, a im wyższe temperatury tym krótszy okres sterylizacji. Stosując zwiększone ciśnienie,
uzyskuje się zatem możliwość zniszczenia zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnych. Czas sterylizacji zależy także od objętości materiału i rodzaju przedmiotów
poddawanych sterylizacji (tab.1).
Tab.1. Czas sterylizacji w zależności od objętości materiału
ObjÄ™tość (cm3) Czas sterylizacji w temperaturze 121°C (min)
10  50 12  14
200 12  15
1000 20  25
2000 30  35
9000 50  55
PodÅ‚oża i produkty nie zawierajÄ…ce skÅ‚adników wrażliwych na wysokietemperatury sterylizuje siÄ™ w autoklawie w temp. 121°C przez 15-20 min lub w temperaturze
117°C przez 15-30 minut. Procesowi sterylizacji poddaje siÄ™ także konserwy o pH powyżej 4,5. Eliminacja form przetrwalnych zapobiega możliwoÅ›ci pojawienia siÄ™ form
wegetatywnych bakterii, które w warunkach niskiej kwasowości znajdują odpowiednie warunki do rozwoju.
Niektóre termowrażliwe produkty płynne (np. mleko) poddaje się sterylizacji błyskawicznej (UHT  Ultra High Temperature) w systemie przepływowym lub
poprzez wtrysk pary wodnej o temperaturze 135-150°C w czasie od 2 - 9 s. Procedura ta niszczy formy wegetatywne i przetrwalne w stopniu zapewniajÄ…cym trwaÅ‚ość handlowÄ…
produktu (jeśli zostanie zapakowany w sterylnych warunkach).
SzkÅ‚o używane, zawierajÄ…ce hodowle drobnoustrojów sterylizuje siÄ™ w autoklawie w temperaturze co najmniej 134°C przez okres od 30 90 minut (w zależnoÅ›ci od iloÅ›ci i
objętości sterylizowanego materiału). Po sterylizacji szkło należy opróżnić i umyć w wodzie z detergentem lub wygotować w roztworze mydła. Po dokładnym wypłukaniu w
wodzie destylowanej sterylizujemy je ponownie w suszarce (160°C / 2 godz.).
" Zastosowanie promieniowania (UV, X i gamma).
W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o
długości fali 250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowane przez kwasy nukleinowe. y
ródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami
rtęci, emitujące w 95% promieniowanie o długości fali 258 nm. Promieniowanie UV jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na
odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów ichłodni, ładowni statków, laboratoriów, kamer). Ponieważ charakteryzuje
się słabą przenikliwością  nie przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do wyjaławiania szkła i podłoży agarowych w szklanych
naczyniach.
Efekt biobójczy promieniowania zależy między innymi od objętości napromienianego powietrza, wielkości powierzchni, odległości i ustawienia lamp UV. Czas emisji
promieniowania nie powinien być krótszy niż 30 min, odległość lampy od sterylizowanej powierzchni nie może przekraczać 3 m, a lampy winny być ustawione prostopadle do
powierzchni.
Do sterylizacji sprzętu medycznego jednorazowego użytku, surowców i preparatów farmaceutycznych oraz utrwalania produktów spożywczych (świeżych i
suszonych owoców i warzyw, mięsa drobiowego, ryb, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. w konserwach)
wykorzystuje się niekiedy promieniowanie jonizujące (X, gamma), które charakteryzuje się bardzo dużą przenikliwością, energią i aktywnością biologiczną. Ponieważ
stosowanie dawek promieniowania pow.10 kGy (radiopasteryzacja, radiosterylizacja) powoduje zmiany właściwości organoleptycznych, odżywczych i zdrowotnych
produktów, stąd do ich sterylizacji stosuje się dawki promieniowania nie przekraczające tej wartości (raduryzacja, radycydacja). Raduryzacja to zmniejszenie ogólnej liczby
mikroorganizmów i zahamowanie rozwoju form przeżywających ten zabieg; radycydacja  zmniejszenie liczebności populacji mikroorganizmów patogennych (np. Clostridium,
Salmonella) i zahamowanie produkcji toksyn bakteryjnych (np. jadu kiełbasianego przez Clostridium botulinum). Stosowanie tych metod jest dozwolone tylko w niektórych
krajach UE.
3.2. Metody mechaniczne
" Filtrowanie. Zabieg ten stosujemy w przypadku. gdy mamy do czynienia z materiałami, które w podwyższonej temperaturze ulegają zmianom fizycznym i chemicznym.
Są to zwykle pożywki zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik i termolabilne składniki dodawane do podłoży. Do wyjaławiania używa się najczęściej
filtry membranowe o porach od 0,20-0,40 (0,75) µm Å›rednicy. Ponieważ pory sÄ… mniejsze od wymiarów bakterii, odfiltrowane drobnoustroje osadzajÄ… siÄ™ na filtrze, a
uzyskany filtrat jest jałowy.
" Wirowanie jest zabiegiem dzięki któremu następuje oddzielanie komórek mikroorganizmów od zawiesiny. Wykonujemy je w wirówkach z regulowanymi obrotami i
czasem działania, a materiał wirowany umieszcza się w specjalnie przygotowanych pojemnikach.
3.3. Metody chemiczne
Do sterylizacji podłóg, ścian i powierzchni roboczych, linii technologicznych, czy też maszyn lub ich części stosuje się także (zgodnie z zaleceniami producenta)
różne środki dezynfekcyjne. Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania. Aktywność biologiczna środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku
chemicznego; gatunku mikroorganizmów, ich wieku i liczebności populacji; czynników środowiskowych - temperatura, kwasowość podłoża i obecność w nim innych
związków chemicznych, zwłaszcza organicznych.
Mechanizm działania związany jest w pierwszym rzędzie ze strukturą chemiczną i właściwościami substancji biologicznie czynnej związku. W zależności od tych
czynników, a także od koncentracji efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów (działanie statyczne) lub w następstwie oddziaływania na zasadnicze
struktury lub szlaki metaboliczne ich zabicie (działanie bakterio- lub grzybobójcze). Polegać ono może na: uszkadzaniu lub zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i
błony cytoplazmatycznej oraz wypływie do środowiska zewnętrznego składników komórki; utlenianiu struktur komórkowych i zakłóceniu procesów metabolicznych
mikroorganizmów; tworzeniu kompleksów z białkami - blokowaniu grup funkcyjnych (-NH2, -SH, -COOH); dezaktywacji enzymów; spowodowaniu koagulacji cytoplazmy i
denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych, kwasów nukleinowych).
Do związków chemicznych najczęściej stosowanych w dezynfekcji należą:
" Czwartorzędowe sole amoniowe (Sterinol, Dezogen). Charakteryzuje je szerokie spektrum działania (bakterie G+ i G-, grzyby pleśniowe, drożdże, wirusy), długotrwały
efekt sterylizacyjny i przyjemny zapach. Ujemną stroną tych preparatów jest silna presja selekcyjna i możliwość uodpornienia się bakterii G- (np. Proteus vulgaris i
Serratia marcescens), co wymusza konieczność przemiennego ich stosowania z preparatami o odmiennych mechanizmach działania (związkami nadtlenowymi,
podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności związków organicznych i mydła.
5
" ZwiÄ…zki nadtlenowe (kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy). Najpowszechniej stosowany kwas nadoctowy jest aktywny w stosunku do form
wegetatywnych i przetrwalnych bakterii. Ponieważ związek ten nie wykazuje właściwości korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi na produkty nieszkodliwe (woda, tlen,
kwas octowy) dla produktów spożywczych, może być stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych (np. w browarnictwie i winiarstwie) bez konieczności
przepłukiwania ich wodą. Taka procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu, gdy jakość mikrobiologiczna będącej do dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto
związek ten może być użyty do sterylizacji przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk.
" Alkohole (etanol, izopropanol). Charakteryzuje je szerokie działanie biobójcze (formy wegetatywne bakterii G+ i G-) uwarunkowane obecnością wody. Z tego też
względu działają najsilniej jako 50-70% roztwór wodny. Aktywność alkoholi wzrasta wraz ze wzrostem liczby molowej i liczby C w łańcuchu, a maleje w obecności
substancji organicznej. Są wykorzystywane do dezynfekcji systemów zamkniętych bez konieczności płukania wodą, powierzchni roboczych, sprzętu i rąk.
Wykorzystanie takich środków dezynfekcyjnych, jak: aldehydy (mrówkowy, glutarowy, formalina), związki fenolowe i pochodne fenoli (fenol, lizol, kwas karbolowy),
związki chloru (podchloryn sodowy, chloramina T), jodofory (połączenia jodu z polimerami lub SPC), związki azotu (pochodne biguanidyny kw. glutaminowego i pirydyny),
metale ciężkie, jest bardzo często ograniczone jedynie do dezynfekcji powierzchni roboczych nie mających kontaktu z żywnością, a w niektórych krajach zakazane. Wynika to
z ich toksyczności (alergie, zakłócenia metabolizmu), wywoływania podrażnień skóry i błon śluzowych, słabej biodegradacji, długotrwałego przykrego zapachu, działania
korozyjnego, wysokiej presji selekcyjnej i możliwości wykształcenia się form odpornych, uwarunkowania ich aktywności od czynników środowiskowych.
II.4. WARUNKI HODOWLI MIKROORGANIZMÓW
Skład ilościowy (liczebność) i jakościowy (różnorodność gatunkowa) mikroflory różnych środowisk jest odmienny, niekiedy nawet bardzo specyficzny. Zależy on
od właściwości gatunkowych mikroorganizmów oraz od czynników ekologicznych: abiotycznych (fizycznych i chemicznych) oraz biotycznych (dodatnich i ujemnych,
bezpośrednich i pośrednich oddziaływań jednych organizmów na drugie).
Tak silne oddziaływanie czynników środowiskowych na mikroorganizmy wynika z uproszczonej budowy, a zwłaszcza z ich ogromnej zbiorowej powierzchni
czynnej (powierzchni styku ze środowiskiem). Wg Gołębiowskiej jeden organizm o objętości 1 cm3 ma powierzchnię styku ze środowiskiem ok. 6 cm2, podczas gdy 1000 mld
komórek bakteryjnych mieszczących się w 1 cm3 ma powierzchnię styku około 60 tys.cm2.
Oddziaływanie poszczególnych czynników środowiskowych przebiega zgodnie z prawami,  minimum ,  maksimum i  tolerancji . To ostatnie mówi, że:  zarówno
nadmiar, jak i niedobór jakiegoś czynnika, tak w sensie ilościowym, jak i jakościowym, poza granice tolerancji organizmu, powoduje zahamowanie wzrostu i rozwoju oraz
śmierć komórki .
Najważniejszymi czynnikami abiotycznymi wpływającymi na wzrost i rozwój drobnoustrojów, w tym także na podłożach mikrobiologicznych w warunkach
laboratoryjnych, są takie czynniki fizyczne (temperatura), chemiczne (kwasowość, tlenowość) a także zawartość składników odżywczych.
4.1. Temperatura
Mikroorganizmy rozwijać siÄ™ mogÄ… w bardzo szerokim zakresie temperatur, od  23°C (silnie zasolone wody Antarktydy w których stwierdzono obecność bakterii z
rodzaju Corynebacterium i grzybów z rodzaju Sporobolomyces) do 113°C (gorÄ…ce z
ródła, kominy termalne  Pyrodictium brockii). Większość mikroorganizmów rozwija się
jednak w temperaturach od 10  37°C. W warunkach laboratoryjnych najczęściej stosowanÄ… temperaturÄ… hodowli bakterii jest zakres 30  37°C natomiast dla grzybów
temperatura 20  25°C.
Ze względu na różnice w minimalnych, optymalnych i maksymalnych temperaturach wzrostu, mikroorganizmy dzieli się na ogół na trzy grupy:
" Psychrofilne (-23-0; 15; 20°C). Do tej grupy zalicza siÄ™ szereg drobnoustrojów zdolnych do rozwoju w Å›rodowiskach naturalnych o niskich temperaturach, jak rejony
podbiegunowe, szczyty wysokich gór, dna oceanów, osady głębokich jezior. Bakterie tej grupy stanowią również poważny problem w przechowalnictwie. Występując w
chłodniach i magazynach, na i w schłodzonych produktach mleczarskich, mięsnych i owocowo-warzywnych, wywierają niekorzystny wpływ na ich jakość i trwałość.
Najczęściej są to bakterie G- należące do rodzaju Pseudomonas oraz gatunki z rodzajów Vibrio, Aeromonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Chromobacterium i
Flavobacterium. Wśród bakterii G+ dominują gatunki należące do rodzajów: Micrococcus, Bacillus i Arthrobacter oraz niektóre Lactobacillus.
Spośród drożdży są to przedstawiciele rodzajów Candida, Debaryomyces, Pichia, Rhodotorula i Thurolopsis, a spośród pleśni: Aureobasidium pullulans, Botrytis cinerea i
Geotrichum candidum.
Szczególne niebezpieczeństwo zatruć pokarmowych stwarzają niektóre bakterie patogenne: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i Bacillus cereus.
" Mezofilne (10-30; 20-37; 35-50°C). Grupa drobnoustrojów zdolna do wzrostu w umiarkowanych temperaturach. Do mezofili zalicza siÄ™ wiÄ™kszość drobnoustrojów
występujących w środowisku (glebie, wodzie, na powierzchni ciała roślin i zwierząt). Są to na ogół mikroorganizmy saprofityczne oraz chorobotwórcze dla roślin, zwierząt
i człowieka, wśród nich wywołujące zatrucia pokarmowe.
" Termofilne (25-45; 45-65/80; 60-90°C). Drobnoustroje o wysokich optymalnych temperaturach wzrostu. Podzielono je na dwie grupy. Pierwsza zwana termofilami -
obejmuje mikroorganizmy o optymalnej temperaturze wzrostu powyżej 45°C. Druga grupa to hipertermofile o optymalnej temperaturze wzrostu dopiero powyżej 80°C.
Mikroorganizmy tej grupy sÄ… szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Spotyka siÄ™ je w gorÄ…cych z
ródłach, w fermentujących resztkach roślinnych (tytoniu, sianie,
nawozie i kiszonkach) oraz w przewodzie pokarmowym niektórych zwierząt. Niektóre bakterie, np. Desulfovibrio desulphuricans, rozwijają się w rurach wymienników
ciepła powodując ich korozję.
Większość termofili to bakterie G+, przetrwalnikujące należące do rodzaju Bacillus (Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans). Obok nich są to przedstawiciele
rodzajów: Clostridium (Clostridium thermosaccharolyticum), Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, Staphylococcus i inne. Liczba termofili wśród bakterii G- jest
ograniczona. Znane są również termofilne promieniowce (Thermomonospora, Thermoactinomyces), bakterie zielone i sinice oraz liczne gatunki grzybów, np. Absidia
ramosa, Aspergillus fumigatus.
4.2. Tlenowość - potencjał oksydacyjno-redukcyjny
W warunkach naturalnych z natlenieniem środowiska łączy się zagadnienie potencjału oksydacyjno-redukcyjnego (Eh) mierzonego w woltach lub miliwoltach. Przy
lepszym natlenieniu wartości potencjału redox są dodatnie i wyższe (do +0,4), a przy gorszym są niższe i przybierać mogą wartości ujemne (-0,4). Zapewnienie
mikroorganizmom odpowiedniego potencjału  tlenowości ma duże znaczenie w badaniach mikrobiologicznych, przemyśle fermentacyjnym i przechowywaniu żywności. W
praktyce mikrobiologicznej, w zależności od wymagań mikroorganizmów, stosujemy metody hodowli w warunkach tlenowych lub beztlenowych.
Pod względem reakcji na natlenienie środowiska mikroorganizmy dzielimy na:
" Bezwzględne tlenowce (b.aeroby). Rozwijają się najlepiej przy wartościach Eh od +0,2 do +0,4 V. Obecność tlenu jest dla wzrostu i rozwoju tych mikroorganizmów
niezbędna. Do tej grupy zalicza się liczne autotroficzne bakterie chemosyntetyzujące (bakterie nitryfikacyjne, Thiobacillus), wiele bakterii heterotroficznych
(Pseudomonas, bakterie śluzowe), wiele gatunków grzybów pleśniowych i drożdży.
Liczne mikroorganizmy należące do tlenowców rozwijają się na w nieopakowanych produktach żywnościowych lub których opakowania zostały uszkodzone, są także
wykorzystywane w procesach biotechnologicznych, np. produkcji kwasów organicznych, antybiotyków. Należą do nich bakterie z rodzaju Bacillus, pleśnie z rodzaju
Aspergillus, Penicillium, promieniowce Streptomyces, Micromonospora, Nocardia.
" Względne beztlenowce. Do względnych beztlenowców należy wiele różnorodnych gatunków bakterii, grzybów i pierwotniaków. Obecność tlenu może być dla tych
6
mikroorganizmów korzystna, brak tlenu nie wyklucza jednak możliwości ich rozwoju (np. bakterie Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp., Pseudomonas sp.,
drożdże Saccharomyces cerevisiae). Mikroorganizmy te zależnie od warunków wzrostu uzyskują energię zarówno na drodze oddychania tlenowego, jak i beztlenowego.
Względne beztlenowce rozwijają się w produktach żywnościowych szczelnie opakowanych, ale nie odpowietrzonych, np. porcjowane kawałki mięsa, ryby na tackach w
woreczkach z tworzyw sztucznych.
" Mikroaerofile. Rosną najlepiej gdy stężenie tlenu w środowisku ich bytowania jest mniejsze. Większe stężenia tlenu powodują zahamowanie wzrostu i zatrucie komórki
(bakterie fermentacji mlekowej).
" Bezwzględne beztlenowce (b.anaeroby). Rozwijają się jedynie w środowisku beztlenowym przy ujemnych wartościach Eh (poniżej -0,2V). Energię uzyskują na drodze
fermentacji lub oddychania beztlenowego.
Do grupy tej zalicza się: przetrwalnikujące laseczki (Clostridium) przeprowadzające fermentację masłową lub wytwarzające toksyny, które występują w odpowietrzanych
konserwach oraz głębokich warstwach żywności, np. mięsie, serach; zasiedlające żwacz ziarniaki (Ruminococcus) i pałeczki (Bacteroides); bakterie metanogenne czynne w
procesie beztlenowego oczyszczania ścieków).
Spośród grzybów jedynie nieliczne (Mucor) przeprowadzają w warunkach beztlenowych fermentację alkoholową.
4.2.1. Tlenowe metody hodowli mikroorganizmów to:
o Hodowle powierzchniowe  na powierzchni pożywek zestalonych;
o Hodowle statyczne  służą do badań morfologii, fizjologii, biochemii oraz otrzymywania czystych kultur;
o Hodowle wgłębne  wzrost mikroorganizmów zachodzi w całej objętości pożywki płynnej na skutek ciągłego ruchu pożywki wywołanego intensywnym mieszaniem
lub wytrzÄ…saniem;
o Hodowle ciągłe  wymagające stałego utrzymywania wzrostu drobnoustrojów przez sukcesywne zaopatrywanie hodowli w świeżą pożywkę, jednocześnie z
fermentatora odprowadzana jest taka sama ilość podłoża zawierającego biomasę i szkodliwe metabolity.
4.2.2. Beztlenowe metody hodowli bakterii
Prowadzi się je eliminując ze środowiska hodowlanego tlen następującymi metodami:
o fizycznymi  np. wypompowanie tlenu ze środowiska lub przez hodowlę bakterii w pożywce płynnej zawierającej tkankę zwierzęcą (kawałki wątroby, nerki lub
mięśnia sercowego np. pożywka Wrzoska) lub tkankę roślinną (marchew, ziemniak), które adsorbują tlen ze środowiska hodowlanego;
o chemicznymi  zastosowanie substancji wiążących tlen, np. podsiarczynu sodu, alkalicznego roztworu trioksybenzenu, a także środków chemicznych redukujących
tlen glukoza, kwas askorbinowy, cysteina, siarczyn sodowy);
o biologicznymi  wspólna hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych w dwóch oddzielonych od siebie częściach płytki Petriego szczelnie oklejonej
parafilmem lub plasteliną. Wyrastający wcześniej organizm tlenowy wykorzystuje tlen ze środowiska umożliwiając rozwój organizmu beztlenowego (metoda
Fortnera). Niezbędnym warunkiem prowadzenia tej metody jest zastosowanie składniku pożywki, która jest optymalna zarówno dla tlenowców jak i beztlenowców.
Metodę tą można zastosować do hodowli beztlenowych bakterii amylolitycznych (Clostridium acetobutylicum, Clostridium pasterianum) w obecności Bacillus
subtilis, Serratia marcescens lub Candida mycoderma.
4.3. Kwasowość - odczyn środowiska
pH lub stężenie jonów wodorowych jest jednym z czynników, który znacząco wpływa na ilościowy i jakościowy skład mikroflory w danym środowisku. Chociaż pH
soku komórkowego mikroorganizmów utrzymuje się na poziomie bliskim obojętnemu, co zapobiega rozkładowi wrażliwych na działanie kwasów i zasad składników
komórkowych, to mikroorganizmy charakteryzują się:
o różnymi wartościami punktów kardynalnych. Większości bakteriom odpowiada na ogół odczyn lekko zasadowy lub obojętny (pH 6,5-7,7). Grzyby pleśniowe i
drożdże rozwijają się lepiej przy niższych wartościach pH (4-6).
o rozpiętością tolerowanych granic pH. Część drobnoustrojów rozwija się w dość wąskim zakresie pH (Streptococcus pneumoniae), natomiast inne (np. Aspergillus
niger) w szerokim zakresie - pH od 1,5  11.
Biorąc pod uwagę reakcję drobnoustrojów na minimalne, optymalne i maksymalne stężenie jonów wodorowych podzielono je na:
" Alkalofile. Mikroorganizmy rozwijające się najlepiej w środowisku alkalicznym (optimum pH 8,0  11). Zalicza się do nich bakterie nitryfikacyjne (Nitrosomonas i
Nitrobacter), wolno żyjące asymilatory azotu (Azotobacter), chorobotwórcze (Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae), Enterococcus faecalis, promieniowce,
przedstawiciele rodzaju Bacillus (rozwijają się jeszcze przy pH 11), a także niektóre glony rozwijające się przy pH 13.
" Neutrofile. RozwijajÄ… siÄ™ najlepiej przy pH od 6,5  7,5.
" Acidofile. Drobnoustroje środowisk kwaśnych (optimum pH 2,0  5,0). Zalicza się do nich, grzyby pleśniowe z rodzajów: Aspergillus, Oospora, Penicillium, drożdże
Saccharomyces oraz bakterie fermentacji octowej, fermentacji mlekowej, a zwłaszcza bakterie siarkowe (Thiobacillus thiooxidans, Ferrobacillus thiooxidans), które
utleniając związki siarki do kwasu siarkowego rozwijają się przy jego stężeniu dochodzącym do 10% i przy pH poniżej 0,8 (kw.siarkowy w akumulatorach).
Odczyn środowiska wpływa nie tylko na wzrost drobnoustrojów, ale modyfikuje także biochemizm komórki  zdolność do produkcji toksyn, kierunek procesów
fermentacyjnych. Wobec silnej reakcji mikroorganizmów na pH, znajomość punktów kardynalnych i regulowanie odczynu środowiska jest ważnym zabiegiem w wielu
procesach badawczych i technicznych. Ma kapitalne znaczenie przy:
" Przygotowywaniu podłoży agarowych dla hodowli mikroorganizmów. Pamiętać należy, że kwasowość podłoża zależy od jego temperatury. Obniżenie pH zwiększa
wrażliwość mikroorganizmów na wysokie temperatury, co jest wykorzystywane w procesie pasteryzacji produktów owocowo-warzywnych;
" Zabezpieczaniu produktów żywnościowych poprzez obniżenie pH do 3,5  4,2 (większość ma odczyn słabo kwaśny), przed szkodliwym działaniem drobnoustrojów
saprofitycznych, chorobotwórczych, toksynotwórczych, w szczególności wytwarzających formy przetrwalne.
4.4. Składniki odżywcze
Metabolizm komórki opiera się na dwóch przeciwstawnych procesach, które łączy proces wytwarzania, gromadzenia i przekazywania energii. Są to:
" Anabolizm (asymilacja)  pobieranie z otoczenia i synteza na drodze redukcji związków o dużej złożoności (małej entropii), przy wykorzystaniu energii zgromadzonej w
ATP, która następnie jest magazynowana w postaci wiązań chemicznych wytworzonych związków organicznych.
" Katabolizm (dysymilacja) - powstawanie na drodze biologicznego utleniania substratu związków o małej złożoności (dużej entropii), z jednoczesnym uwolnieniem
energii i wydaleniem na zewnątrz powstałych, niekiedy szkodliwych dla mikroorganizmów metabolitów.
Przebieg tych procesów, warunkujących prawidłowy wzrost i rozwój mikroorganizmów, zależy od: stałego i bezawaryjnego dopływu z otaczającego środowiska
mineralnych i organicznych związków, stanowiących materiał budulcowy lub z
ródło energii; nakładów energii i obecności odpowiednich enzymów, od których zależy
przebieg reakcji metabolicznych; planu, który zapisany jest w układzie genetycznym każdego organizmu.
7
4.4.1. Skład chemiczny mikroorganizmów
Skład chemiczny drobnoustrojów jest zbliżony do składu chemicznego innych organizmów. Około 80% stanowi woda, która z jednej strony jest środowiskiem
wewnętrznym komórki, w którym przebiega szereg reakcji chemicznych, a z drugiej odgrywa czynną rolę w tych reakcjach. Do innych bardzo ważnych związków
organicznych wytwarzanych w komórce zaliczyć należy białka, węglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe i deoksynukleinowe.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
białka węglowodany lipidy kw.nukleinowe kw.deoksynukleinowe popiół
Wykres 1. Przeciętny skład chemiczny suchej masy komórki drobnoustrojów (4)
Najważniejszymi pierwiastkami organogenicznymi, wchodzącymi w skład struktur komórkowych są: węgiel (50-65%), azot (6-12%), tlen (30%) i wodór (7%) i inne
(1,5-15%). Do pozostałych ważnych pierwiastków życia, występujących w stanie wolnym lub w postaci związków mineralnych albo organicznych, zalicza się:
" makroelementy (od 10-4 do 10-3 mola) - składniki strukturalne komórki, odpowiedzialne z utrzymanie właściwego ciśnienia osmotycznego w komórce (P, K, Ca, S, Fe,
Mg);
" mikroelementy (od 10-8 do 10-6 mola) - będące w pierwszym rzędzie składnikami enzymów (Mn, Cu, Co, Bo, Zn, Ni, Mo);
" witaminy (kilka ppm) - będące składnikami lub prekursorami enzymów;
" substancje wzrostowe, które stymulują wzrost i rozwój, lecz nie wchodzą w skład enzymów (np. aminokwasy, aminy, sterole, zw. pirymidynowe, puryny, itp.).
Zapotrzebowanie i rodzaj wykorzystywanych związków (mineralne, organiczne) przez poszczególne rodzaje mikroorganizmów jest odmienne i waha się niekiedy w
szerokich granicach. Wśród mikroorganizmów występować mogą bowiem zarówno prototrofy (np. Escherichia coli, Psudomonas sp.), które dysponując kompletnym zestawem
enzymatycznym z prostych związków wytworzyć mogą wszystkie niezbędne do życia związki organiczne, jak również auksotrofy (np. drożdże, bakterie fermentacji mlekowej)
wymagające obecności w środowisku określonych związków organicznych (aminokwasów, substancji wzrostowych, itp.). Z tego też powodu wszystkie niezbędne dla
prawidłowego wzrostu i rozwoju składniki winny być zawarte w podłożach mikrobiologicznych.
4.4.2. Skład pożywek hodowlanych
Pożywki hodowlane zwane inaczej podłożami mikrobiologicznymi służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Stosując różne podłoża
możemy prowadzić izolację mikroorganizmów, różnicować je, namnażać oraz identyfikować.
Podstawowym materiałem budulcowym komórki, stanowiącym szkielet każdego związku, są proste związki węgla, które równocześnie dostarczają energię potrzebną
do syntezy (za wyjątkiem CO2). Węgiel jest zatem atrybutem zarówno pokarmu, jak również energii. Biorąc pod uwagę pochodzenie i formę wykorzystywanego C
mikroorganizmy dzielimy na typy pokarmowe:
" autotrofy (organizmy samożywne)  pobierające C w formie utlenionych zw. mineralnych (nieorganicznych)  CO2, H2CO3. Zalicza się do nich niektóre bakterie i
wszystkie glony;
" heterotrofy (organizmy cudzożywne)  wymagające obecności w środowisku zredukowanych związków organicznych zawierających C (np. węglowodanów). Są to w
większości bakterie i wszystkie grzyby.
Organizmy tej grupy dzielimy na:
o saprotrofy  wykorzystujÄ…ce martwÄ… materiÄ™ organicznÄ…,
o biotrofy  pobierające związki wytwarzane przez organizmy żywe. W obrębie tych ostatnich wyróżnia się organizmy pasożytnicze będące sprawcami chorób
roślin, zwierząt i człowieka oraz symbiotyczne, których współżycie przynosi obu partnerom korzyści.
lignina
zw.aromatyczne
zw.alifatyczne
błonnik
pektyny, hemicelulozy
skrobia, białka
zasady organiczne
aminokwasy
dwu- i trójcukry
kw.tłuszczowe, glicerol
cukry proste
Wykres 2. Dostępność różnych z
ródeł energii i węgla dla heterotrofów (8)
Pochodzenie poszczególnych składników podłoży jest różne np.:
" z
ródłem węgla i energii są najczęściej węglowodany (np. glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, celuloza), a także glicerol, mannitol oraz niektóre kwasy organiczne. Dodaje
się je w ilości 0,5-2%.
" z
ródłem azotu  oprócz bakterii, które wiążą azot z atmosfery, uniwersalnym z
ródłem azotu jest dodawany do pożywek pepton (łańcuch polipeptydowych i wolnych
aminokwasów otrzymywany przez rozkład hydrolityczny białka pod wpływem działania trypsyny, pepsyny bądz
20% HCl). Innym z
ródłem azotu stosowanym w
sztucznych podłożach są różne ekstrakty (mięsny, drożdżowy}, a także sole amonowe, wodorotlenek amonu oraz azotany. Często dodaje się czyste białko, bądz
wolne
aminokwasy.
8
Oprócz tych składników w podłożach powinny znajdować się:
" składniki mineralne  należą do nich zarówno sole mineralne, jak i pierwiastki śladowe. Sole dodawane do pożywki to: fosforan potasu utrzymujący właściwy odczyn
pH (zwiększona pojemność buforowa), a także NaCl (sól kuchenna, dodawana w ilości 3-5g/l) reguluje ciśnienie osmotyczne.
" pierwiastki  dodawane do podłoża należą do następujących grup: pierwiastki biogenne: O,H, P,S (składniki budulcowe komórki), pierwiastki biorące udział w procesach
życiowych komórki: Na, K, Mg, Ca, Fe, mikroelementy biorące udział w reakcjach komórkowych: Zn, Mn, Cu, Co.
" substancje wzrostowe  są to zarówno roztwory syntetyczne witamin, a także ekstrakty roślinne i zwierzęce oraz sok pomidorowy, wyciąg glebowy, brzeczka słodowa,
wyciÄ…g ziemniaczany.
" substancje różnicujące i wybiórcze  składniki różnicujące to te, które po dodaniu do pożywki ulegają pod wpływem wzrostu drobnoustrojów rozkładowi (np. cukry 
następuje zmiana barwy pożywki) lub też wskazują na obecność produktów metabolizmu bakterii (np. wytwarzanie siarkowodoru, tworzenie indolu).
Składniki wybiórcze natomiast dodaje się po to, żeby hamując wzrost pewnych grup mikroorganizmów umożliwić jednocześnie rozwój flory pożądanej (mogą to być: sole
kwasów żółciowych, fiolet krystaliczny, błękit brylantowy, antybiotyki).
" czynniki zestalające  w przypadku pożywek o konsystencji stałej dodaje się do podłoża agar (jest to polisacharyd, który ma właściwości żelujące, dodaje się go w
ilości 1,5-3%) lub żelatynę (substancja białkowa, bogata w kolagen, dodaje się w ilościach 12-15%).
4.4.3. Podział pożywek hodowlanych
Podłoża hodowlane podzielić możemy biorąc pod uwagę:
" skład chemiczny:
o naturalne  bulion, mleko, brzeczka słodowa, melasa buraczana
o syntetyczne  złożone z odczynników chemicznych o ściśle znanym składzie ilościowym i jakościowym
o półsyntetyczne  przygotowane z odczynników chemicznych z dodatkiem pojedynczego składnika naturalnego (wyciąg mięsny, mleko, serwatka, wyciągi roślinne:
ziemniaczany, pomidorowy, melasa buraczana, namok kukurydziany, brzeczka słodowa).
" cel hodowli:
o namnażające  służące do otrzymania biomasy drobnoustroju (np. zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella i pożywka Kesslera-Swenartona dla pałeczek
z grupy coli, podłoże Czapka lub Sabuoroda do hodowli grzybów)
o selektywne  zawierają zarówno składniki odżywcze jak i wybiórcze (np. fiolet krystaliczny jest składnikiem wybiórczym w podłożu do hodowli bakterii z
grupy coli, pH kwaśne podłoża pozwala na wzrost grzybów, hamując wzrost bakterii).
o różnicujące  zawierają substancje diagnostyczne, pozwalające stwierdzić w środowisku obecność drobnoustrojów określonych rodzajów (np. podłoże Endo do
hodowli bakterii coli, agar z krwią do hodowli paciorkowców hemolizujących, agar SS do hodowli bakterii Salmonella, Schigella, podłoże Blickfeldta do wykrywania
bakterii kwaszących, podłoże Wrzoska do oznaczania bakterii beztlenowych).
" wymagania pokarmowe drobnoustrojów:
o ogólne (zwykłe)  do hodowli drobnoustrojów heterotroficznych o niewielkich wymaganiach pokarmowych, prototroficznych (bulion odżywczy, agar odżywczy)
o wzbogacone  do hodowli drobnoustrojów o zwiększonych wymaganiach hodowlanych, auksotroficznych (np. bulion odżywczy z dodatkiem substancji
wzrostowych; agar wzbogacony z dodatkiem glukozy)
o wybiórcze  do izolacji ściśle określonych grup drobnoustrojów. Do podłoża dodaje się składnik, który w przypadku hodowli mieszanej pozwala na wzrost tylko
tych mikroorganizmów, które tolerują ten składnik (pożywka Kesslera  Swenartona z fioletem krystalicznym dla hodowli bakterii z grupy coli).
o różnicujące  do identyfikacji drobnoustrojów w hodowli mieszanej. Określone grupy mikroorganizmów różnicuje się na podstawie rozkładu przez nie substratów
wprowadzonych do podłoża (podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową do identyfikacji bakterii z grupy coli; podłoże z mannitolem do identyfikacji
gronkowców)
" konsystencjÄ™:
o płynne  służą głównie do namnażana drobnoustroju (np. bulion)
o półpłynne - zawierają agar w ilości 0,15 0,5% i służą do hodowli organizmów o mniejszym zapotrzebowaniu na tlen oraz do badania ruchu bakterii
o stałe  jako czynnik zestalający stosuje się agar, bądz
żelatynę, służą do różnicowania i izolowania bakterii i grzybów, a także hodowli i liczenia bakterii.
4.4.4. Rodzaje pożywek stosowanych w mikrobiologii (przykłady):
" Pożywki ogólnego zastosowania
o bulion zwykły, odżywczy, brzeczka słodowa
o agar zwykły, odżywczy, bulion z agarem
o żelatyna
" Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:
o podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira)
o podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, Kesslera-Swenartona, Endo)
o podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu)
o podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem)
" Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży:
o podłoże Sabourauda
o brzeczka agarowa
o pożywka Czapka  Doxa
o podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.