Zasady diagnostyki
chorób mitochondrialnych
Dorota Piekutowska-Abramczuk
Zakład Genetyki Medycznej IPCZD
Warszawa, 12.01.12
ChorobÄ… mitochondrialnÄ…
nazywamy stan chorobowy wywołany
uwarunkowanÄ… genetycznie zmianÄ… budowy
białka, pierwotnie zaburzającą przebieg
procesu fosforylacji oksydacyjnej w komórce.
System fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS)
Dehydrogenaza Dehydrogenaza Kompleks Oksydaza
NADH bursztynianowa cytochromów bc1 cytochromu c
Syntaza ATP
Podjednostki
45 4 11 13 16
mtDNA
7 1 3 2
nDNA 38 4 10 10 14
Zaburzenia aktywności kompleksów  izolowane lub złożone
najczęściej  KI i KIV
 Choroby mitochondrialne
Częstość występowania 1:8500 - 1:5000
Prawdopodobnie wiele przypadków pozostaje nierozpoznanych
Heterogenność kliniczna, biochemiczna i genetyczna
Patomechanizm
obniżenie efektywności syntezy ATP
wzrost produkcji reaktywnych form tlenu
zaburzenia homeostazy wapnia
Choroby mitochondrialne
Uwarunkowane mutacjami w genach:
: mitochondrialnych
strukturalne podjednostki OXPHOS
tRNA
>50% wszystkich mutacji w mtDNA (gł. MTTK, MTTL1, MTTI)
rRNA
: jÄ…drowych
strukturalne podjednostki OXPHOS
niestrukturalne
: czynniki towarzyszÄ…ce (assembly factors) (I-V)
: czynniki zaburzajÄ…ce replikacjÄ™ mtDNA
: zaburzające transkrypcję i translację genów OXPHOS
: zaburzające import białek mitochondrialnych
: biosynteza kofaktorów
: deficyt CoQ i in.
Dziedziczenie
matczyne
autosomalne recesywne
autosomalne dominujÄ…ce
sprzężone z chromosomem X
Przypadki sporadyczne
Mitochondrialne DNA
Øð WystÄ™puje w 103  105 kopii
Øð Kolista czÄ…steczka o wielkoÅ›ci
16 569 kpz (nić H i L)
Øð Zawiera 37 genów (13
strukturalnych podjednostek
systemu OXPHOS, 2 rRNA, 22
tRNA)
Øð MaÅ‚e lub brak przestrzeni
międzygenowych
Øð Brak intronów
Øð 2 maÅ‚e obszary niekodujÄ…ce:
pętla D  zawiera miejsca
inicjacji transkrypcji i replikacji
nici H i miejsce startu replikacji
nici L
Øð OdstÄ™pstwa od uniwersalnego
kodu genetycznego
(np. TGA (Stop) Trp)
Genetyka mitochondrialna
Øð Dziedziczenie matczyne
Tylko kobieta przekazuje zmutowany gen swemu potomstwu, zarówno córce
jak i synowi (nieliczne mtDNA plemnika sÄ… aktywnie usuwane we wczesnych
podziałach zygoty).
üð Poliploidalność mitochondriów (setki mitochondriów, a w każdym do 10
czÄ…steczek mtDNA)
üð Szybkie tempo ewolucji (maÅ‚a wydajność systemów naprawy, brak
histonów, brak zjawiska rekombinacji, nadprodukcja ROS)
üð Heteroplazmia i wartość progowa
Prezentacja objawów zależy od poziomu heteroplazmii i wartości progowej
(treshold effect).
üð Segregacja mitotyczna (efekt bottleneck) w oogenezie tÅ‚umaczy czÄ™ste
zmiany poziomu mutacji w kolejnych pokoleniach i znaczne zróżnicowanie
fenotypowe.
üð Ekspansja klonalna (preferencyjna amplifikacja mutacji mtDNA do
wysokiego poziomu w tkankach postmitotycznych)
Dziedziczenie w linii matczynej
Schemat mitochondrialnego efektu szyjki butelki
(bottleneck) w dojrzewających komórkach jajowych
Cechy mutacji mtDNA
Heteroplazmatyczne
Homoplazmatyczne
Stabilne
" silna korelacja genotyp-fenotyp
" mała/brak zmienność poziomu mutacji w różnych tkankach
" mała/brak zmienność poziomu w czasie (podczas rozwoju płodowego i
po urodzeniu)
m.8993T>G, m.8993T>C
Niestabilne
" bardzo zróżnicowany obraz kliniczny
" niejednorodne tkankowe rozmieszczenie mutacji
" duża zmienność poziomu mutacji w czasie
m.3243A>G
Choroby mitochondrialne u dzieci
üð Częściej wynikajÄ… z mutacji w jÄ…drowym DNA
üð Cięższe od objawiajÄ…cych siÄ™ w wieku póz
niejszym i częściej
wielonarzÄ…dowe;
üð DotyczÄ… dysfunkcji wÄ…troby (MDS), choroby nerek (MDS, deficyt
KIII) i zaburzeń hemopoezy (zespół Pearsona)
üð Opóz
nienie rozwoju w połączeniu z kwasicą mleczanową
üð PostÄ™pujÄ…cy regres rozwojowy, utrata posiadanych umiejÄ™tnoÅ›ci
(zespół Leigha)
üð Niespecyficzne objawy zaburzenia w odżywianiu, wzrastania,
drgawki, częste infekcje
üð Rzadko obecne RRF
Rozpoznanie choroby mitochondrialnej
vð Zdefiniowane, wysoce prawdopodobne
analiza mutacji
vð Prawdopodobne
biopsja mięśnia
vð Możliwe
obserwacja, biopsja mięśnia, zabezpieczenie
materiału w wypadku zgonu
Materiał biologiczny
vð miÄ™sieÅ„
vð krew obwodowa
vð wymaz z nabÅ‚onka jamy ustnej
vð mocz
vð wÄ…troba
vð fibroblasty
vð wÅ‚osy
Oragene DNA
vð pÅ‚yn owodniowy
www.dnagenotek.com
vð kosmki kosmówki
Biopsja mięśnia
kompleksowe potwierdzenie rozpoznania
vð Ocena morfologiczna (włókna RRF)
vð Badanie histochemiczne (oksydaza cytochromu c mozaikowość,
dehydrogenaza bursztynianowa)
vð Badanie proteomiczne (obecność i aktywność kompleksów Å‚aÅ„cucha
oddechowego i ich poszczególnych podjednostek)
vð Analiza enzymatyczna (aktywność kompleksów Å‚aÅ„cucha oddechowego i
syntazy cytrynianowej)
vð Analiza molekularna
A B
(A) (B)
C D
(C) (D)
Przekrój poprzeczny przez mięsień szkieletowy.
Włókna RRF (A) wykazują dodatnią reakcję w kierunku dehydrogenazy bursztynianowej (B) i
brak aktywności oksydazy cytochromowej (C). Uszkodzone włókna wykazują niewielki wzrost
aktywności kwaśnej fosfatazy (D)
Zespół mitochondrialny IPCZD
Klinika Chorób Metabolicznych
Klinika Neurologii i Epileptologii
Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii
Zakład Biochemii i Medycyny Doświadczalnej
Zakład Patologii
Zakład Genetyki
Współpraca zewnętrzna
Diagnostyka molekularna chorób
mitochondrialnych w ZGM IPCZD
1. Identyfikacja powszechnych mutacji
" m.8993T>C/G (MTATP6) - NARP/MILS
" m.3243A>G (MTTL1) - MELAS
podstawowy
skrining mtDNA
" m.8344A>G (MTTK) - MERRF
" delecja 4977pz (m.8470_13446del) KSS i in. zespoły delecyjne
" m.11778G>A (MTND4), m.3460G>A (MTND1), m.14484T>C (MTND6) - LHON
" g.1541G>A (SCO2) - deficyt białka SCO2
" c.845_846delCT, c.311_312insAT312_321del10(SURF1)  LS
2. Poszukiwanie mutacji w innych, znanych genach zwiÄ…zanych z fenotypem
" MTND1-MTND6 - LS
" DGUOK, MPV17 - HC-MDS
3. W przyszłości dalsza analiza molekularna obejmująca geny nie badane lub nowo
odkryte.
Schemat postępowania
Øð Izolacja DNA
Øð Amplifikacja, w tym L-PCR (delecje)
Øð Sekwencjonowanie
Øð MLPA (mutacje punktowe, delecje)
Øð Real-Time PCR (poziom heteroplazmii, deplecji)
Øð Analiza restrykcyjna (poziom heteroplazmii)
Negatywny wynik badania molekularnego zwykle nie
wyklucza rozpoznania.