BADANIE WAAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH AMINOKWASÓW IDENTYFIKACJA AMINOKWASÓW BIAAKA, JAK I WOLNE AMINOKWASY REAGUJ ZA POŚREDNICTWEM GRUP: -NH2 I COOH Z NINHYDRYN, DINITROFLUOROBENZENEM I KWASEM AZOTOWYM (III). WYSTPOWANIE W STRUKTURZE AMINOKWASÓW INNYCH GRUP FUNKCYJNYCH, OPRÓCZ AMINOWEJ I KARBOKSYLOWEJ, UMOŻLIWIA IDENTYFIKACJ TYCH AMINOKWASÓW NA PODSTAWIE CZUAYCH REAKCJI BARWNYCH. Reakcja biuretowa Nazwa pochodzi od biuretu, związku powstającego przy ogrzewaniu mocznika do 180OC. Reakcję biuretową dają wszystkie połączenia zawierające w cząsteczce co najmniej 2 grupy -CO-NH- połączone ze sobą bezpośrednio (np. w diamidzie kwasu szczawiowego NH2-CO-CO-NH2), poprzez azot (w biurecie) lub poprzez atom węgla (w diamidzie kwasu malonowego, bursztynowego, w produktach hydrolizy białek). W wyniku utworzenia połączenia koordynacyjnego Cu2+ z dwoma przyległymi wiązaniami CO-NH- powstaje barwny produkt. Dodatniego odczynu reakcji biuretowej nie dają wolne aminokwasy i dipeptydy. Wykonanie: Do 1 ml danej próby dodać 1 ml NaOH i kilka kropli 0,5% CuSO4 W obecności białka powstaje fioletowe zabarwienie. Uwaga: ponieważ niebieska barwa odczynnika może maskować właściwy odczyn należy unikać nadmiaru CuSO4. Reakcja ninhydrynowa Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji cząsteczki zredukowanej i utlenionej ninhydryny z amoniakiem powstaje niebiesko-fioletowe zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasów. 1 O O H C C OH H H2O R C COOH + C R CH + CO2 + C + OH OH C C NH2 NH O O ninhydryna zredukowana ninhydryna H R CH + H2O R C + NH3 O NH O O O O C C C C OH H C + 2NH3 + C C N C OH HO C C C C O O O O barwny kompleks + 3H2O + NH4 Wykonanie: Do 1 ml próby badanej dodać 3-4 krople 0,1% roztworu ninhydryny w 50% etanolu. Po wymieszaniu próbę ogrzać do wrzenia. Wszystkie aminokwasy (oprócz proliny) reagują z ninhydryną tworząc niebieskie zabarwienie. Reakcja ksantoproteinowa Aminokwasy aromatyczne oraz fenole ulegają reakcji nitrowania w czasie ogrzewania ze stężonym HNO3, dając żółto zabarwione pochodne nitrowe (fenyloalanina wymaga do nitrowania dodatku H2SO4). COOH COOH H2C NH3 H2C NH3 2H2O + 2HNO3 O2N OH OH Wykonanie: Do 1 ml próby badanej dodać 0,5 ml stężonego HNO3 i ogrzewać na wrzącej łazni wodnej przez 2 min. Wytrąca się żółty osad. Reakcja Adamkiewicza Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu zawierającego pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego i formaldehydu (kwas glioksalowy) dwie grupy indolowe ulegają kondensacji z wydzieleniem cząsteczki wody i dają barwny fioletowy związek. Schemat przebiegu reakcji: 2 Wykonanie: Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli formaldehydu. Po wymieszaniu roztwór podwarstwić (po ściance) stężonym H2SO4. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień. Reakcja Millona Reakcja na wykrywanie tyrozyny jest mało specyficzna, ponieważ dodatni wynik dają również związki zawierające reszty fenolowe. Wykonanie: Do 1 ml próby badanej dodać kilka kropli odczynnika Millona. Mieszaninę ogrzewać w łazni wodnej przez kilka minut. W przypadku obecności tyrozyny pojawia się biały osad, który zabarwia się na żółto, a pózniej na czerwono (lub powstaje czerwone zabarwienie roztworu). Wykrywanie cysteiny i cystyny Zawarta w cysteinie i cystynie siarka w silnie zasadowym środowisku ulega uwolnieniu w postaci jonów siarczkowych, które z jonami Pb2+ dają czarny osad PbS. Metionina nie daje dodatniego wyniku w tej reakcji. Schemat przebiegu reakcji: COOH CH3 2 HC NH2 + 2OH C O + S + NH3 + H2O H2C SH COOH 2 2 Pb + S PbS Wykonanie: Do 1 ml próby badanej dodać 1 ml roztworu octanu ołowiu i 3 ml 10% roztworu NaOH (roztwór powinien być klarowny). Próbkę ogrzewać na łazni wodnej, po kilku minutach pojawia się czarny osad. 3 Wykrywanie glutaminy Próba na obecność glutaminy wykorzystuje obecność w jej cząsteczce ugrupowania amidowego, z którego w warunkach hydrolizy zasadowej uwalnia się gazowy amoniak. Dodatni wynik tej reakcji dają też asparagina i sole amonowe. Wykonanie: Do 3 ml próby badanej dodać 3 ml 10% NaOH (roztwór dodać do probówki pipetą, tak aby nie dotknąć jej wylotu). Całość umieścić we wrzącej łazni wodnej a do wylotu probówki zbliżyć zwilżony uniwersalny papierek lakmusowy. W przypadku obecności glutaminy papierek zmienia zabarwienie na niebieski Uwaga: należy uważać, aby nie dotknąć papierkiem brzegu probówki. wówczas zmiana zabarwienia papierka następuje na skutek obecności NaOH a nie amoniaku. 4