ĆWICZENIE NR 1 Drożdże część praktyczna A. Budowa komórki drożdżowej i fizjologia drożdży Cel ćwiczenia Poznanie budowy komórek drożdży i ich fizjologii. Wykonanie 1. Badania makroskopowe Rozróżnianie wybranych szczepów drożdży piwowarskich, gorzelniczych i piekarskich Na podÅ‚ożu pÅ‚ynnym należy zwrócić uwagÄ™ na : " wystÄ™powanie osadu na dnie pożywki, " gazowanie (ostrożne wstrzÄ…Å›niÄ™cie pÅ‚ynu), " tworzenie siÄ™ kożuszka, bÅ‚onki lub pierÅ›cienia na powierzchni pÅ‚ynu. Na podÅ‚ożu staÅ‚ym po okreÅ›lonym czasie hodowli w temp. 200C należy zwrócić uwagÄ™ na: " rodzaj wzrostu (jednolity nalot lub pojedyncze kolonie), " powierzchniÄ™ wzrostu (matowa, bÅ‚yszczÄ…ca) i strukturÄ™ kolonii (zwarta, mazista), " zabarwienie i ksztaÅ‚t kolonii. 2. Badania mikroskopowe Obserwacje mikroskopowe: ksztaÅ‚tu, wielkoÅ›ci, sposobu uÅ‚ożenia oraz rozmnażania komórek. Preparaty wykonuje siÄ™ z jedno dobowych kultur hodowanych na podÅ‚ożu pÅ‚ynnym w temp. 300C. Preparaty mikroskopowe różnych ras drożdży: winiarskich, piwowarskich, gorzelniczych, piekarskich. 2.1.Badanie żywotnoÅ›ci drożdży polega na zabarwieniu ich wodnym roztworem bÅ‚Ä™kitu metylenowego. Na szkieÅ‚ku przedmiotowym do kropli badanych drożdży dodaje siÄ™ roztworu barwnika, przykrywa szkieÅ‚kiem nakrywkowym i oglÄ…da pod mikroskopem. Komórki martwe barwiÄ… siÄ™ na niebiesko, natomiast żywe pozostajÄ… niezabarwione. 2.2.Badanie obecnoÅ›ci glikogenu przeprowadza siÄ™ podobnie, jak badanie na żywotność z tym, że do barwienia używa siÄ™ pÅ‚ynu Lugola. Komórki zawierajÄ…ce glikogen bÄ™dÄ… zabarwione na kolor ciemnobrunatny, natomiast pozostaÅ‚e na jasnożółty. 3. Oznaczanie iloÅ›ci komórek w 1 cm3 gÄ™stwy drożdżowej SporzÄ…dza siÄ™ szereg rozcieÅ„czeÅ„ gÄ™stwy drożdżowej (1:10, 1:50, 1:100) z udziaÅ‚em wody destylowanej i KOH (7 cm3 H2O + 2 cm3 5 % KOH + 1 cm3 gÄ™stwy drożdżowej). MateriaÅ‚ po dokÅ‚adnym wymieszaniu nanosi siÄ™ pipetÄ… na komorÄ™ Thoma i liczy pod mikroskopem komórki drożdży przy powiÄ™kszeniu 100-500 razy. 1 B. Drożdże piekarnicze Cel ćwiczenia Poznanie metod badaÅ„ drożdży piekarskich prasowanych i suszonych, ocena technologiczna drożdży. Wykonanie 4. Sprawdzanie masy drożdży piekarskich suszonych Zawartość opakowania zważyć z dokÅ‚adnoÅ›ciÄ… do 0,1 g porównać z deklarowanÄ… masÄ… netto. 5. OkreÅ›lenie barwy BarwÄ™ badanej próbki należy okreÅ›lać wzrokowo przy Å›wietle dziennym rozproszonym. 6. OkreÅ›lenie zapachu Należy przeprowadzić w pomieszczeniu pozbawionym obcych zapachów, zapach drożdży piekarskich prasowanych należy okreÅ›lić bezpoÅ›rednio po skrojeniu wierzchniej warstwy cegieÅ‚ki, a zapach drożdży piekarskich suszonych, paszowych i piwowarskich natychmiast po otwarciu opakowania. 7. OkreÅ›lenie konsystencji CegieÅ‚kÄ™ drożdży należy nagnieść lekko palcem w Å›rodku bocznej powierzchni; konsystencja powinna być Å›cisÅ‚a, dopuszcza siÄ™ zewnÄ™trznÄ… mazistość, jeÅ›li nie jest poÅ‚Ä…czona z przykrym zapachem rozkÅ‚adajÄ…cego siÄ™ biaÅ‚ka. 8. Oznaczanie zawiesiny wodnej Do probówki szklanej wrzucić grudkÄ™ drożdży (okoÅ‚o 1 g na 20 cm3) pobranÄ… z wnÄ™trza cegieÅ‚ki, dodawać porcjami wodÄ™ do okoÅ‚o poÅ‚owy pojemnoÅ›ci probówki z korkiem. Obserwować zawiesinÄ™ po caÅ‚kowitym wymieszaniu zawiesina powinna być jednorodna, w ciÄ…gu 5 min nie powinna wykazywać grudek ani kÅ‚aczków na dnie probówki. 9. Oznaczanie zawartoÅ›ci suchej masy W naczyÅ„ku wagowym, wysuszonym w temp. 1050 C do staÅ‚ej masy i uprzednio zważonym, odważyć okoÅ‚o 1g drożdży z dokÅ‚adnoÅ›ciÄ… do 0,001 g. NaczyÅ„ko otwarte wraz z przykrywkÄ… umieÅ›cić w suszarce na 1,5 2h, w temp. 55 600C lub pod lampÄ… promiennikowÄ…. NastÄ™pnie otwarte naczyÅ„ko ponownie umieÅ›cić w suszarce, w temp.1050C na 1h. Oznaczenie uważa siÄ™ za zakoÅ„czone, jeÅ›li różnica masy po kolejnym dosuszeniu nie przekracza 0,001g. 10. Kwasowość drożdży RozpuÅ›cić 10g drożdży w 50 cm3 wody destylowanej i otrzymanÄ… zawiesinÄ™ miareczkować 0,1 M NaOH wobec fenoloftaleiny. Wynik podać w cm3 1 M NaOH na 100g drożdży. 2 11. Oznaczanie czasu podnoszenia ciasta 5g drożdży odważyć w zlewce, na wadze technicznej z dokÅ‚adnoÅ›ciÄ… do 0,01 g. SporzÄ…dzić 160 cm3 roztworu soli kuchennej o stężeniu 2,5%. Przenieść odważone drożdże za pomocÄ… przygotowanego roztworu (ogrzanego do temp. 350C) do 280 g mÄ…ki ogrzanej w cieplarce do temp. 350C, uprzednio wsypanej do miesiarki. Zanotować czas dodania drożdży do ciasta. NastÄ™pnie miesić ciasto przez 5min po czym przenieść do foremki ogrzanej do temp. 350C, wysmarowanej wewnÄ…trz olejem jadalnym. Ciasto rozÅ‚ożyć równomiernie w foremce, zawiesić poprzeczkÄ™ i natychmiast wstawić foremkÄ™ do cieplarki. Ciasto pozostawić w cieplarce do chwili, gdy dotknie ono poprzeczki (1 pÄ™d). NastÄ™pnie wyjąć foremkÄ™ z cieplarki i w ciÄ…gu 1min ugniatać ciasto w miesiarce lub rÄ™cznie, i ponownie umieÅ›cić w foremce. Zawiesić poprzeczkÄ™ i wstawić caÅ‚ość do cieplarki. Gdy ciasto dotknie poprzeczki, zanotować czas (2 pÄ™d) i powtórzyć wykonane czynnoÅ›ci dla trzeciego pÄ™du. 12. Oznaczanie aktywnoÅ›ci sacharolitycznej drożdży 0,5g drożdży prasowanych, rozprowadzić w 10 cm3 wody wodociÄ…gowej o temp. 350C. Do otrzymanej zawiesiny dodać 10cm3, 10% roztworu sacharozy ogrzanego do temp. 350C. NastÄ™pnie postÄ™pować wedÅ‚ug metody A lub B, w zależnoÅ›ci od dostÄ™pnego wyposażenia. A) KolbÄ™ zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkÄ™ odprowadzajÄ…cÄ… CO2 do wyskalowanej biurety wypeÅ‚nionej wodÄ… i wstawić do termostatu (350C). Mierzyć czas wydzielenia 10cm3 CO2 MiarÄ… aktywnoÅ›ci sacharolitycznej jest ilość cm3 CO2 wydzielona przez 0,1 g s.s. drożdży w ciÄ…gu 1 godz. B) KolbÄ™ zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkÄ™ fermentacyjnÄ… napeÅ‚nionÄ… glicerynÄ…, zważyć caÅ‚ość z dokÅ‚adnoÅ›ciÄ… 0,01g, a nastÄ™pnie wstawić do cieplarki (350C) na okres 1 godziny. ZnajÄ…c różnicÄ™ mas przed i po fermentacji obliczyć ilość wydzielonego CO2 [cm3]. Aktywność sacharolitycznÄ… podać jako ilość cm3 CO2 wydzielonych przez 0,1g s.s (suchej substancji) drożdży w ciÄ…gu 1 godz., wiedzÄ…c, że 1 mol CO2 = 44,0g odpowiada objÄ™toÅ›ci 22,4 dm3. 3 13. BezpoÅ›rednie liczenie komórek drożdży w zawiesinie. Liczenie przy użyciu komór. Komory do liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem majÄ… postać szklanych pÅ‚ytek z wyciÄ™tym wgÅ‚Ä™bieniem podzielonym na kwadraty lub prostokÄ…ty o znanej powierzchni. Używane sÄ… komory Thoma (hemocytometr), Howarda, Bürkera, Fuch Rosenthala i inne. RóżniÄ… siÄ™ one wymiarami powierzchni, na których liczy siÄ™ drobnoustroje. Dane dotyczÄ…ce powierzchni i gÅ‚Ä™bokoÅ›ci podane sÄ… na komorach. W komorach można zasadniczo liczyć tylko wiÄ™ksze komórki drobnoustrojów, takie jak drożdże, zarodniki i strzÄ™pki grzybów. Ograniczenia te wynikajÄ… po pierwsze stÄ…d, że grubość i gÅ‚Ä™bokość komory nie pozwalajÄ… na użycie obiektywów o dużej sile powiÄ™kszenia, a wiÄ™c tym samym o maÅ‚ej odlegÅ‚oÅ›ci roboczej i po drugie przy dużej gÅ‚Ä™bokoÅ›ci komory (100 mikrometrów = 0,1 mm) maÅ‚e drobnoustroje np. bakterie o Å›rednicy 5 mikrometrów (µm), mogÄ… ukÅ‚adać siÄ™ w wielu pÅ‚aszczyznach i przy użyciu silniejszych obiektywów o maÅ‚ej gÅ‚Ä™bi ostroÅ›ci część komórek poÅ‚ożona nad i pod pÅ‚aszczyznÄ… pola widzenia bÄ™dzie niewidoczna. KomorÄ™ Thoma przedstawia rysunek 3. Jest to grube szkieÅ‚ko przedmiotowe z wyciÄ™tymi wgÅ‚Ä™bieniami o gÅ‚Ä™bokoÅ›ci 0,1 mm (100 µm). WgÅ‚Ä™bienia te widoczne sÄ… goÅ‚ym okiem po obydwu stronach Å›rodkowego kanalika jako równoramienne krzyże, powstaÅ‚e z przeciÄ™cia linii wyznaczajÄ…cych regularne, kwadratowe i prostokÄ…tne powierzchnie. Bok kwadratu wynosi 1/20 mm (50 µm). Powierzchnia kwadracika wynosi wiÄ™c 1/400 mm2 (2500 µm2). W każdej siatce znajduje siÄ™ 400 kwadracików. Po przykryciu komory szkieÅ‚kiem przykrywkowym nad każdym kwadracikiem powstaje prostopadÅ‚oÅ›cian o objÄ™toÅ›ci 1/400 mm2 x 0,1mm = 1/4000 mm3 (2500 µm x 100 µm3 = 25 000 µm3). Co piÄ…ty kwadrat w obu kierunkach podzielony jest na pół dodatkowÄ… liniÄ…, w wyniku czego część kwadratów ma powierzchniÄ™ o poÅ‚owÄ™ mniejszÄ…, a caÅ‚a komora podzielona jest w ten sposób na 16 dużych kwadratów, z których każdy skÅ‚ada siÄ™ z 16 maÅ‚ych kwadracików. Na przeciÄ™ciu dodatkowych linii powstajÄ… maleÅ„kie kwadraciki o czterokrotnie mniejszej powierzchni równej 1/1600 mm2 . Na powierzchni komory Thoma wyżłobione sÄ… trzy kanaliki tworzÄ…ce literÄ™ H, dwa poprzeczne i jeden Å›rodkowy, Å‚Ä…czÄ…cy je. MajÄ… one za zadanie zatrzymywać nadmiar pÅ‚ynu naniesionego na komorÄ™. Oznaczanie liczby drobnoustrojów przy użyciu komory Thoma wykonuje siÄ™ nastÄ™pujÄ…co. ZawiesinÄ™ komórek drożdży majÄ…cych tendencjÄ™ do zlepiania siÄ™ rozcieÅ„cza siÄ™, biorÄ…c 5 objÄ™toÅ›ci zawiesiny i 1 objÄ™tość kwasu siarkowego rozcieÅ„czonego wodÄ… w stosunku 1:10, wytrzÄ…sa siÄ™ kilka minut, przenosi szybko do komory Thoma, przykrywa szkieÅ‚kiem przykrywkowym i przystÄ™puje do liczenia. Po ustawieniu oÅ›wietlenia, należy znalezć siatkÄ™ komory najpierw przy obiektywie 10x, a nastÄ™pnie przy obiektywie 40x. JeÅ›li stwierdzi siÄ™ zbyt duże zagÄ™szczenie drobnoustrojów, to należy próbÄ™ rozcieÅ„czyć iloÅ›ciowo, np. 10-krotnie i powtórzyć oznaczenie. Oblicza siÄ™ Å›redniÄ… liczbÄ™ drobnoustrojów z ok. 40 maÅ‚ych kwadracików (o pow. 1/400 mm2). W sumie należy policzyć ok. 700 komórek, by bÅ‚Ä…d nie przekroczyÅ‚ 10%. Komórki rozmieszczone sÄ… nierównomiernie, w jednych kwadracikach może być ich kilka, a w innych - kilkanaÅ›cie. Przy Å›redniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieÅ„czeniu (n), zawartość komórek (L) w 1 cm3 wynosi: L = 4 " 106 " a " n Rysunek 3. Komora Thoma: a widok z góry, b widok z boku, c wgÅ‚Ä™bienie z naciÄ™tymi kwadratami, c' 4 siatka kwadratów w powiÄ™kszeniu