Strona 1 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/03/06
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie E
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy Grupa: IV
Wstęp
Enzymy przyspieszają przebieg reakcji chemicznej przez obniżenie energii aktywacji.
Nie zużywają się w czasie reakcji, są po niej odtwarzane. Enzymy nie wpływają na równowagę reakcji. Działają specyficznie względem substratów. Aktywność enzymów jest ściśle związana z temperaturą.
Celem doświadczenia jest wyznaczenie optimum temperaturowego reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę w 1/15 M buforze fosforanowym o pH 5,6. Działanie inwertazy (ß-fruktofuranozydaza, EC 3.2.1.26) polega na odszczepieniu wolnej fruktozy. Gdy hydrolizowana jest sacharoza to powstaje D-fruktoza i D-glukoza.
Reakcję enzymatyczną należy przeprowadzić w różnych temperaturach. Do oznaczenia stężenia glukozy w próbkach można wykorzystać metodę Nelsona. Aktywność enzymu jest wyznaczana pośrednio przez pomiar absorbancji próbek przy długości fali 660 nm. Im większe stężenie glukozy, produktu reakcji enzymatycznej, tym większa jest aktywność enzymu w danych warunkach temperaturowych.
Materiały
a) Odczynniki:
wyciąg drożdżowy, zawierający enzym – inwertazę
2% roztwór sacharozy – substrat
0,005% roztwór glukozy – standard glukozy
1/15 M bufor fosforanowy o pH 5,6
odczynnik miedziowy A (2,4% NaKC4H4O6, 5% NaHCO3, 4% Na2CO3, 3,6% K2C2O4)
odczynnik miedziowy B (1,3% CuSO4 ∙ 5H2O)
odczynnik arseno-molibdenowy
b) Szkło laboratoryjne:
probówki chemiczne
probówki kalibrowane: 10 ml
pipety miarowe: 1 ml; 0,1 ml; 5 ml; 10 ml
c) Aparatura:
fotokolorymetr „Specol”,kuwety szklane do „Specola”: 2 szt.,
statywy do probówek: 2 szt.
naczynie z lodem,
łaźnie wodne o temperaturach: 37°C, 55°C, 100°C,
tryskawka, bibuła, lignina.
Strona 2 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/03/06
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie E
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy Grupa: IV
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „E”. Zastosowano jednak łaźnię wodną 37°C zamiast 40°C oraz 55°C zamiast 60°C. Temperatura pokojowa wynosiła 23°C.
1. Przygotowano odczynnik miedziowy przez zmieszanie 6 ml odczynnika A i B.
2. Do przygotowanych, ponumerowanych zgodnie z tabelą 1., 16 kalibrowanych probówek dodano po 0,5 ml odczynnika miedziowego.
3. Do przygotowanych, ponumerowanych od 12 do 16 i od 12’ do 16’, 10 probówek chemicznych dodano po 0,5 ml buforu o pH 5,6 oraz po 5 ml substratu.
4. Probówki inkubowano wstępnie w odpowiednich łaźniach przez 5 minut w temperaturach: 12, 12’ – 0°C ; 13, 13’ – 23°C ; 14, 14’ – 37°C ; 15, 15’ – 55°C ; 16, 16’ – 100°C.
5. Do probówek od 12 do 16 dodano po 0,5 ml enzymu oraz do probówek od 12’ do 16’ dodano po 0,5 ml wody. Inkubowano probówki dokładnie przez 10 minut w odpowiednich łaźniach.
6. Reakcję przerywano przez przeniesienie 0,1 ml roztworu z probówek chemicznych (od 12 do 12
oraz od 12’ do 16’) do odpowiednich probówek kalibrowanych (od 7 do 11 oraz od 7’ do 11’).
7. Do probówek od 7 do 11 oraz od 7’ do 11’ dodano po 0,4 ml wody.
8. Do probówek od 1 do 6 dodano standard glukozy i wodę zgodnie z tabelą 1.
9. Wszystkie probówki kalibrowane inkubowano przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.
10. Probówki kalibrowane oziębiono i dodano po 0,5 ml odczynnik arseno-molibdenowego.
11. Probówki kalibrowane uzupełniono wodą destylowaną do 4 ml i wymieszano ich zawartość.
12. Odczytano absorpcję probówek przy długości fali 660 nm względem probówki 1.
Wyniki (A660) umieszczono w tabeli 1.
Strona 3 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/03/06
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie E
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy Grupa: IV
Wyniki
Tabela 1. – Zawartość próbek kalibrowanych
ak
standard
próby E+S
wó
odczynnik
glukozy
inkubowane
odczynnik
b
miedziowy
c=0,05
w różnych
arseno-
A
ro
660
p
A+B
mg/ml
woda
temp.
molibdenowy
A660
/kor/
/nr/
/ml/
/ml/
/ml/
/nr/
/ml/
/ml/
1
0,5
-
0,5
-
-
0,5
0,000
-
2
0,5
0,1
0,4
-
-
0,5
0,075
-
3
0,5
0,2
0,3
-
-
0,5
0,120
-
4
0,5
0,3
0,2
-
-
0,5
0,185
-
5
0,5
0,4
0,1
-
-
0,5
0,245
-
6
0,5
0,5
-
-
-
0,5
0,395
-
7
0,5
-
0,4
12
0,1
0,5
0,125
0,065
7’
0,5
-
0,4
12’
0,1
0,5
0,060
-
8
0,5
-
0,4
13
0,1
0,5
0,310
0,110
8’
0,5
-
0,4
13’
0,1
0,5
0,200
-
9
0,5
-
0,4
14
0,1
0,5
0,620
0,570
9’
0,5
-
0,4
14’
0,1
0,5
0,050
-
10
0,5
-
0,4
15
0,1
0,5
0,720
0,520
10’
0,5
-
0,4
15’
0,1
0,5
0,200
-
11
0,5
-
0,4
16
0,1
0,5
0,140
0,020
11’
0,5
-
0,4
16’
0,1
0,5
0,120
-
Wykres 1. – Krzywa standardowa glukozy
Przy wyznaczaniu regresji liniowej pominięto próbę nr 6, ze względu na znaczne odstępstwo wartości absorbancji od pozostałych próbek.
0,40
0,35
0,30
0,25
A = 0,0123 ∙ m
A
0,20
660
0,15
0,10
0,05
0,00
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
m /μg/
Strona 4 z 4
Sprawozdanie 2.
Wydział Chemiczny
Data zajęć: 2008/03/06
Biochemia 1 (BTC3009l)
Łukasz Czok
Ćwiczenie E
laboratorium
Mateusz Jędrzejewski
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy Grupa: IV
Tabela 2. – Wpływ temperatury na aktywność inwertazy
temperatura
A660 /kor/
zawartość*
aktywność**
/°C/
glukozy /μg/
/j.a./
0
0,065
5,285
0,352
23
0,110
8,943
0,596
37
0,570
46,341
3,089
55
0,520
42,276
2,818
100
0,020
1,626
0,108
* zawartość glukozy obliczono z krzywej standardowej [Wykres 1.]
0,0123 ∙ 81,3 ∙
** aktywność obliczono ze wzoru [str. 22 w instrukcji „E”]
∙ 6
µmol
0,1 ∙ 0,5 ∙ 10 ∙ 180 15 ml∙ min
Wykres 2. – Zależność aktywności inwertazy od temperatury 3,5
3,0
2,5
2,0
a
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
T /°C/
Wnioski
Stężenie glukozy, produktu reakcji, w próbce świadczy o aktywności enzymatycznej inwertazy.
Zgodnie z wykresem 2. widać, że temperatura znacznie wpływa na aktywność inwertazy.
Do 40°C szybkość katalizowanej reakcji zwiększa się ze wzrostem temperatury.
Maksymalna aktywność inwertazy przypada dla temperatury ok. 40°C. Znalezione optimum temperaturowe zgadza się z wynikiem zawartym w instrukcji „E”.
Powyżej temperatury 40°C aktywność gwałtownie spada. Enzym ulega denaturacji cieplnej.
Inwertaza ulega procesowi nieodwracalnej zmiany swojej białkowej struktury przestrzennej, co uniemożliwia jej dalej katalizowanie reakcji chemicznej.