INNE ENZYMY I BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE WYKORZYSTYWANE W

KLONOWANIU MOLEKULARNYM

Wiele różnych enzymów, nie tylko restryktazy, jest wykorzystywanych rutynowo w klonowaniu

molekularnym:

DNA POLIMERAZY (DNA- i RNA-ZALEŻNE)

Wiele etapów klonowania molekularnego wymaga syntezy DNA in vitro – reakcje te katalizują

polimerazy DNA. Są to enzymy, które wymagają matrycy (w większości) i syntetyzują produkt,

którego sekwencja nukleotydów jest komplementarna do matrycy. Większość polimeraz preferuje

matryce DNA, ale mogą również kopiować RNA (odwrotna transkryptaza).

RNA POLIMERAZY (DNA-ZALEŻNE)

Enzymy, które katalizują syntezę RNA na matrycy dsDNA. Polimerazy pochodzenia fagowego są

wykorzystywane in vitro do generowania dużych ilości RNA komplementarnego do jednej z nici

obcego DNA sklonowanego za fagowym promotorem w wektorze plazmidowym.

LIGAZY

Enzymy wykorzystywane do łączenia dwóch różnych cząsteczek DNA to ligazy DNA. Najczęściej

wykorzystywaną jest ligaza kodowana w genomie faga T4. RNA ligaza to enzym zdolny do

kowalencyjnego łączenia cząsteczek jednoniciowego RNA posiadających grupy 5’-fosforanową i

3’-hydroksylową.

KINAZY

Enzymy te wykorzystywane są do fosforylowania końców cząsteczek DNA pozbawionych reszt

fosforanowych, np.: kinaza polinukleotydowa faga T4.

FOSFATAZY

Odwrotnie niż kinazy enzymy te wykorzystujemy do defosforylacji, czyli usuwania grup

fosforanowych z 5’-końców łańcuchów polinukleotydowych, np.: fosfataza alkaliczna E. coli.

NUKLEAZY

Enzymy, które katalizują hydrolizę wiązania fosfodiestrowego. Egzonukleazy usuwają

mononukleotydy z końców liniowego DNA. Endonukleazy atakują wiązania fosfodiestrowe

wewnątrz cząsteczek dwu- lub jednoniciowych; np.: Dezoksyrybonukleaza I – endonkleaza, która

hydrolizuje ds lub ssDNA preferencyjnie w miejscach przylegających do nukleotydów

pirymidynowych; produkty takiej reakcji trawienia to złożona mieszanina 5’-fosfo mono- i

oligonukleotydów; w obecności jonów Mg2+ każda nić jest atakowana niezależnie, a miejsca

trawienia na obu niciach rozmieszczone w sposób przypadkowy; Rybonukleaza A –

endorybonukleaza, przecinająca wiązanie 3’-fosfodiestrowe przy pirymidynach, niewykazująca

żadnej aktywności w stosunku do DNA, stosowana do usuwania RNA z preparatów DNA

BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE

W inżynierii genetycznej wykorzystywane są również nieenzymatyczne białka wiążące DNA, np.:

białko SSB (ang. single-stranded DNA-binding protein), wiążące się w sposób kooperatywny z

ssDNA (ich użyteczność wynika z faktu, że mogą destabilizować struktury drugorzędowe powstałe

w obrębie jednej nici i zwiększać tym samym procesywność enzymów, usuwając „bariery” na ich

drodze).