INŻYNIERIA GENETYCZNA - Laboratorium

ĆWICZENIE NR V

1) Ligacja wektora pGEX-2T zlinearyzowanego enzymem BamHI i defosforylowanego (pGEX-2T/ BamHI) z fragmentem DNA kodującym domenę wiążącą DNA receptora ekdysteroidowego (EcRDBD/ BamHI) przy użyciu ligazy T4.

Plazmidowe DNA (pGEX-2T/ Bam HI, około 35 ng) zlinearyzowane enzymem Bam HI oraz insert (EcRDBD/ Bam HI, około 3 ng), trawiony tym samym enzymem restrykcyjnym zmieszać w sterylnej probówce Eppendorfa (stosunek molowy 1:1.5). Reakcję ligacji prowadzić w temperaturze ~20°C przez 1÷4 h, w 1× buforze do ligacji, w końcowej objętości 20 µl, przy użyciu ligazy T4 (1 U).

Skontrolować relegację wektora przez przygotowanie próbki kontrolnej, zawierającej analogiczne składniki jak mieszanina ligacyjna, lecz niezawierającej insertu.

Przygotowanie próbek do reakcji ligacji :

WEKTOR

Założenie: Stężenie preparatu pGEX-2T/ Bam HI wynosi około 17÷18 ng/µl.

Do reakcji ligacji użyć ok. 35 ng (=2 µl) wektora.

MW (pGEX-2T/ Bam HI) = 4948 pz × 640 g/mol pz = 3166720 g/mol 1 mol pGEX-2T/ Bam HI - 3166720 g

a pGEX-2T/ Bam HI - 35 × 10-9 g a = 1.11 × 10-14 mola

Insert ma być dodany do zlinearyzowanego wektora w stosunku molowym 1.5:1. Zatem ilość moli

insertu,

którą

należy

dodać

do

przeprowadzenia

ligacji

wynosi:

1.11× 10 -14 × 1.5 = 1.67 × 10 -14 mola.

Ćwiczenie V

INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012

1

INSERT

MW (EcRDBD/ Bam HI) = 306 pz × 640 g/mol pz = 195840 g/mol 1 mol insertu

195840 g

1.67 × 10 -9 mola

b

b = 3.24 × 10 -9 g = 3 ng

Reakcja ligacji (na 1 próbkę)

2 µl pGEX-2T/ Bam HI (35 ng)

2 µl EcRDBD/ Bam HI (3 ng, preparatu o stężeniu 1.5 ng/µl) 1 µl ligaza T4 (1U) (MBI Fermentas)

2 µl 10× bufor do ligazy T4 (MBI Fermentas)

13 µl H2OmilliQ auto.

20 µl

REAKCJA LIGACJI :

MIX (na 14 próbek)

2 µl (35 ng) pGEX-2T/ Bam HI

14 µl ligaza T4 (14 U)

2 µl (3 ng) EcRDBD/ Bam HI

28 µl 10×bufor do ligazy T4

16 µ l MIX

182 µl H2OmilliQ auto.

20 µl

224 µl

KONTROLA SAMOLIGACJI:

2 µl (35 ng) pGEX-2T/ Bam HI

2 µl H2OmilliQ auto.

16 µl MIX

20 µl

Ćwiczenie V

INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012

2

2) Transformacja komórek kompetentnych (Maniatis i wsp.1989).

100 µl zawiesiny komórek kompetentnych (XL1-Blue) rozmrozić na lodzie i przenieść natychmiast do schłodzonej probówki Eppendorfa, zawierającej mieszaninę po ligacji (lub mieszaninę kontrolną). Całość delikatnie wymieszać i inkubować na lodzie przez 20 min, a następnie przez 5 min w temperaturze 37°C. Dodać 100 µl pożywki płynnej LB i ponownie inkubować w temperaturze 37°C przez ok. 20 min. Następnie 200 µl zawiesiny transformowanych komórek wysiać na szalkę Petriego z podłożem LB-agar zawierającym karbenicylinę w stężeniu końcowym 100 µg/ml.

Przeprowadzić inkubację w temperaturze 37°C przez ok. 12 h, następnie policzyć kolonie transformantów wyrosłe na płytce po ligacji i płytce kontrolnej.

Stopień religacji wektora określić w procentach, dzieląc liczbę kolonii na płytce kontrolnej przez liczbę kolonii na płytce „po ligacji”.

Podłoża do hodowli bakterii i bufory wykorzystywane w ćwiczeniu: 10× bufor reakcyjny dla ligazy DNA faga T4 (MBI Fermentas) 400mM Tris-HCl (pH 7.8 at 25°C)

100mM MgCl2

5mM ATP

100mM ditiotreitol

Ćwiczenie V

INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012

3

Podłoże LB-agar z karbenicyliną (100 µg/ml):

ekstrakt drożdżowy

10 g

hydrolizat kazeinowy

5 g

NaCl

10 g

agar 15 g

1 litr H20 milliQ, pH 7.5 (1N NaOH)

Po ochłodzeniu autoklawowanego podłoża z agarem do temp. < 40°C dodać 1 ml roztworu karbenicyliny o stężeniu 100 mg/ml.

Ćwiczenie V

INŻYNIERIA GENETYCZNA Zima 2011/2012

4