Oznaczanie aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę.

Hamowanie fotosyntetycznego transportu

elektronów przez DCMU

Wstęp.

Fotosystem II (PSII) jest jednym z

określenie "PSII" używane jest zawsze w dwóch kompleksów barwnikowo - białkowych

pierwszym znaczeniu.)

aparatu fotosyntetycznego w których następuje

Łańcuch reakcji przekazywania

ostateczne przekształcenie energii wzbudzenia

elektronów od wody do plastochinonów (i

dostarczonej przez foton na energię pary

następnie dalsze procesy fazy świetlnej

ładunków: elektron - kation. Elektron wybity z

fotosyntezy ) można traktować jako szereg centrum reakcji PS II jest przenoszony na

reakcji redox. Jedną z metod mierzenia

plastochinon i dalej a powstałą "dziurę

szybkości przekazywania elektronów w

elektronową" zajmuje elektron pochodzący z

reakcjach redox jest pomiar zmian stężenia

H20. W procesie rozkładu wody na O2,

utlenionego/zredukowanego donora lub

elektrony i protony bierze udział układ

akceptora elektronów w czasie, w warunkach

rozszczepiają-cy wodę, zawierający jony Mn o

umożliwiających reakcję.

cyklicznie zmieniającej się wartościowości.

Dichlorometylomocznik (DCMU) jest

(Uwaga dot. nazewnictwa: nazwy "fotosystem

inhibitorem kompetycyjnym transportu

II" używa się w dwóch znaczeniach: albo dla

elektronów między PSII a plastochinonem.

kompleksu chlorofilowo-białkowego

Hamuje linearny fotosyntetyczny transport

przenoszącego elektrony od układu

elektronów, konkurując z plastochinonem o

rozszczepiającego wodę do plastochinonu albo

miejsce, w którym ten ostatni zostaje

dla PSII w poprzednim rozumieniu wraz z

zredukowany przez wzbudzony PSII.

kompleksem rozszczepiającym wodę. Tutaj

Zasada oznaczenia.

Dichlorofenoloindofenol (DCIP),

wzbudzające fotosystem musi wysycać reakcję, sztuczny akceptor elektronów z PSII, w formie

gdyż w innym wypadku mierzona będzie nie

zredukowanej jest bezbarwny a w formie

aktywność maksymalna ale zależna od

utlenionej - intensywnie niebieskofioletowy

intensywności światła.

(pochłania światło przy λmax = 580 - 600 nm

Oznaczenie aktywności samego PSII

(zależnie od pH)). Szybkość zanikania

można przeprowadzić, dodając do powyżej

błękitnego zabarwienia DCIP (spadek

opisanego układu sztuczny donor elektronów

absorbancji w czasie) będzie więc miarą

dla PSII, np. difenylkarbazyd (DPC), dzięki szybkości redukcji tego związku. Forma

czemu redukcja DCIP przez fotosystem II nie

utleniona DCIP jest akceptorem elektronów z

będzie limitowana szybkością dostarczania

PSII, wobec czego można oznaczać szybkość

elektronów z wody. DCMU hamuje

przenoszenia elektronów od wody przez układ

przekazywanie elektronów z PS II do DCIP,

rozszczepiający wodę i fotosystem II na

wiążąc się z miejscem, w którym następuje

podstawie zmian absorbancji DCIP w

redukcja DCIP.

zawiesinie chloroplastów. W wypadku

Ponieważ redukcja DCIP przez DPC

obecności w zawiesinie chloroplastów DCIP

może zachodzić powoli również bez udziału

oznaczona zostanie albo aktywność układu

przenośników, należy określić "tło" reakcji rozszczepiającego wodę albo PSII - w

obserwując zmiany absorbancji w warunkach

zależności od tego, który z tych procesów

w których PSII nie działa.

będzie zachodził wolniej (będzie czynnikiem

limitującym). Niezależnie od tego, światło 5.1

Wykonanie pomiarów.

Przygotowanie próbki do pomiaru.

Rozcieńczyć buforem E do

chlorofilu po rozcieńczeniu, biorąc 200

stężenia ok. 10 µg/ml taką ilość

µl zawiesiny i 800 µl acetonu na każdą próbkę

zawiesiny błon tylakoidów, aby

(nie rozcieńczać już buforem!); dalej

postępować jak opisano w opisie izolacji błon

uzyskać jej ok. 7 ml. Uzyskaną próbkę

tylakoidów.

nadal przechowywać w lodzie i w

ciemności. Oznaczyć stężenie

Oznaczenie aktywności PSII wraz z układem rozszczepiającym wodę.

2 ml otrzymanej zawiesiny umieścić w

dodaniu DCIP, a następnie próbkę

kuwecie pomiarowej; dodać taką ilość

oświetlać przez 10s i zmierzyć jej

roztworu DCIP aby absorbancja tego

absorbancję. Pomiar powtórzyć po

związku przy λ=590 nm wynosiła ok.

dalszych 10, 20, 40 i 60s oświetlania.

0.5. Zmierzyć absorbancje próbki po

Oznaczenie aktywności PSII .

Do próbki przygotowanej jak w

metanolu. Pomiary wykonać jak

poprzednim doświadczeniu dodać

opisano wyżej.

10 µl nasyconego r-ru DPC w

Hamowanie aktywności PS II przez DCMU.

Do próbek przygotowanych jak w obu

roztworu DCMU do stężenia 10 µM.

poprzednich doświadczeniach dodać

Pomiary wykonać jak opisano wyżej.

Opracowanie wyników.

Na podstawie otrzymanych wyników oznaczyć szybkość przekazywania elektronów z H2O lub DPC do DCIP przez PSII (i w pierwszym przypadku, przez układ rozszczepiający wodę). Stwierdzić która z reakcji była czynnikiem limitującym. Szybkość przenoszenia elektronów określić w µmol/min i µmol chlorofilu (lub jednostkach pochodnych) i jako ilość elektronów na s i cząsteczkę chlorofilu.

Określić procent zahamowania reakcji przez DCMU oraz szybkość przekazywania elektronów z DPC

do DCIP w obecności DCMU.

Molowy współczynnik absorbancji DCIP wynosi 16000 JAbs590 * .cm * M.

Reakcja redukcji DCIP przebiega wg równania:

+

-

2H +2e

Cl

Cl

O =

= N

OH

OH

N

OH

Cl

Cl

H

Stężenie roztworów podstawowych wynosi: DCIP: 10 mM w buforze E, DPC: 100 mM w metanolu, DCMU: 10 mM w mieszaninie etanol/aceton 1:1.

AW

5.2