Oznaczanie aktywności fotosystemu II i układu rozszczepiającego wodę.
Hamowanie fotosyntetycznego transportu
elektronów przez DCMU
Wstęp.
Fotosystem II (PSII) jest jednym z
określenie "PSII" używane jest zawsze w dwóch kompleksów barwnikowo - białkowych
pierwszym znaczeniu.)
aparatu fotosyntetycznego w których następuje
Łańcuch reakcji przekazywania
ostateczne przekształcenie energii wzbudzenia
elektronów od wody do plastochinonów (i
dostarczonej przez foton na energię pary
następnie dalsze procesy fazy świetlnej
ładunków: elektron - kation. Elektron wybity z
fotosyntezy ) można traktować jako szereg centrum reakcji PS II jest przenoszony na
reakcji redox. Jedną z metod mierzenia
plastochinon i dalej a powstałą "dziurę
szybkości przekazywania elektronów w
elektronową" zajmuje elektron pochodzący z
reakcjach redox jest pomiar zmian stężenia
H20. W procesie rozkładu wody na O2,
utlenionego/zredukowanego donora lub
elektrony i protony bierze udział układ
akceptora elektronów w czasie, w warunkach
rozszczepiają-cy wodę, zawierający jony Mn o
umożliwiających reakcję.
cyklicznie zmieniającej się wartościowości.
Dichlorometylomocznik (DCMU) jest
(Uwaga dot. nazewnictwa: nazwy "fotosystem
inhibitorem kompetycyjnym transportu
II" używa się w dwóch znaczeniach: albo dla
elektronów między PSII a plastochinonem.
kompleksu chlorofilowo-białkowego
Hamuje linearny fotosyntetyczny transport
przenoszącego elektrony od układu
elektronów, konkurując z plastochinonem o
rozszczepiającego wodę do plastochinonu albo
miejsce, w którym ten ostatni zostaje
dla PSII w poprzednim rozumieniu wraz z
zredukowany przez wzbudzony PSII.
kompleksem rozszczepiającym wodę. Tutaj
Zasada oznaczenia.
Dichlorofenoloindofenol (DCIP),
wzbudzające fotosystem musi wysycać reakcję, sztuczny akceptor elektronów z PSII, w formie
gdyż w innym wypadku mierzona będzie nie
zredukowanej jest bezbarwny a w formie
aktywność maksymalna ale zależna od
utlenionej - intensywnie niebieskofioletowy
intensywności światła.
(pochłania światło przy λmax = 580 - 600 nm
Oznaczenie aktywności samego PSII
(zależnie od pH)). Szybkość zanikania
można przeprowadzić, dodając do powyżej
błękitnego zabarwienia DCIP (spadek
opisanego układu sztuczny donor elektronów
absorbancji w czasie) będzie więc miarą
dla PSII, np. difenylkarbazyd (DPC), dzięki szybkości redukcji tego związku. Forma
czemu redukcja DCIP przez fotosystem II nie
utleniona DCIP jest akceptorem elektronów z
będzie limitowana szybkością dostarczania
PSII, wobec czego można oznaczać szybkość
elektronów z wody. DCMU hamuje
przenoszenia elektronów od wody przez układ
przekazywanie elektronów z PS II do DCIP,
rozszczepiający wodę i fotosystem II na
wiążąc się z miejscem, w którym następuje
podstawie zmian absorbancji DCIP w
redukcja DCIP.
zawiesinie chloroplastów. W wypadku
Ponieważ redukcja DCIP przez DPC
obecności w zawiesinie chloroplastów DCIP
może zachodzić powoli również bez udziału
oznaczona zostanie albo aktywność układu
przenośników, należy określić "tło" reakcji rozszczepiającego wodę albo PSII - w
obserwując zmiany absorbancji w warunkach
zależności od tego, który z tych procesów
w których PSII nie działa.
będzie zachodził wolniej (będzie czynnikiem
limitującym). Niezależnie od tego, światło 5.1
Przygotowanie próbki do pomiaru.
Rozcieńczyć buforem E do
chlorofilu po rozcieńczeniu, biorąc 200
stężenia ok. 10 µg/ml taką ilość
µl zawiesiny i 800 µl acetonu na każdą próbkę
zawiesiny błon tylakoidów, aby
(nie rozcieńczać już buforem!); dalej
postępować jak opisano w opisie izolacji błon
uzyskać jej ok. 7 ml. Uzyskaną próbkę
tylakoidów.
nadal przechowywać w lodzie i w
ciemności. Oznaczyć stężenie
Oznaczenie aktywności PSII wraz z układem rozszczepiającym wodę.
2 ml otrzymanej zawiesiny umieścić w
dodaniu DCIP, a następnie próbkę
kuwecie pomiarowej; dodać taką ilość
oświetlać przez 10s i zmierzyć jej
roztworu DCIP aby absorbancja tego
absorbancję. Pomiar powtórzyć po
związku przy λ=590 nm wynosiła ok.
dalszych 10, 20, 40 i 60s oświetlania.
0.5. Zmierzyć absorbancje próbki po
Oznaczenie aktywności PSII .
Do próbki przygotowanej jak w
metanolu. Pomiary wykonać jak
poprzednim doświadczeniu dodać
opisano wyżej.
10 µl nasyconego r-ru DPC w
Hamowanie aktywności PS II przez DCMU.
Do próbek przygotowanych jak w obu
roztworu DCMU do stężenia 10 µM.
poprzednich doświadczeniach dodać
Pomiary wykonać jak opisano wyżej.
Opracowanie wyników.
Na podstawie otrzymanych wyników oznaczyć szybkość przekazywania elektronów z H2O lub DPC do DCIP przez PSII (i w pierwszym przypadku, przez układ rozszczepiający wodę). Stwierdzić która z reakcji była czynnikiem limitującym. Szybkość przenoszenia elektronów określić w µmol/min i µmol chlorofilu (lub jednostkach pochodnych) i jako ilość elektronów na s i cząsteczkę chlorofilu.
Określić procent zahamowania reakcji przez DCMU oraz szybkość przekazywania elektronów z DPC
do DCIP w obecności DCMU.
Molowy współczynnik absorbancji DCIP wynosi 16000 JAbs590 * .cm * M.
Reakcja redukcji DCIP przebiega wg równania:
+
-
2H +2e
Cl
Cl
O =
= N
OH
OH
N
OH
Cl
Cl
H
Stężenie roztworów podstawowych wynosi: DCIP: 10 mM w buforze E, DPC: 100 mM w metanolu, DCMU: 10 mM w mieszaninie etanol/aceton 1:1.
AW
5.2