Krawczyk Aneta
Kocur Justyna
Przybyłowska Marta
Tracz Anna
Diagnostyka i chemioterapia
zakażeń wirusowych
DIAGNOSTYKA ZAKAŻEC
WIRUSOWYCH
Podstawową metodą diagnostyczną zakażeń wirusowych jest izolacja i
identyfikacja wirusa. Jest to metoda referencyjna dla wszystkich innych metod
diagnostycznych. Inną grupę metod stanowią te, które umożliwiają wykazanie
antygenów wirusowych w płynach ustrojowych, tkankach lub wydalinach i
wydzielinach.
W niektórych zakażeniach wirusowych poza metodami bezpośrednimi
mają zastosowanie metody pośrednie, wykazujące obecność przeciwciał
przeciwwirusowych u chorych. Diagnostyka serologiczna niektórych zakażeń
wirusowych może być tylko jedyną dostępną metodą w wielu laboratoriach
klinicznych.
Izolacja wirusa
Grupa wirusów Wykrycie antygenu Serologia
(hodowla)
Adenowirusy + ++ ++ (2 surowice)
Enterowirusy - ++ -
virus Epsteina-Barr + ++ ++
Paramykowirusy + ++ ++
Rotawirusy ++ - -
Rabies ++* ++* ++*
Togawirusy - + ++
RSV ++ ++ ++
HBV ++ - ++
CMV - + ++
++ metody podstawowe + rzadko stosowane
++* tylko w referencyjnych laboratoriach - nie stosowano
METODY IZOLACJI I IDENTYFIKACJI WIRUSÓW
Techniki zmierzające do izolacji i identyfikacji wirusów są stosowane w
laboratoriach referencyjnych. Ogólne zasady sprowadzają się do pobrania
materiału od chorego, jego transportu, a następnie wyboru odpowiedniej
techniki dla wzrostu (namnożenia) wirusa, obserwacji zmian w hodowli i
dokonania identyfikacji wirusa.
Próbki materiałów pobierane od chorych
Materiałami do badań mogą być: krew, płyn mózgowo-rdzeniowy,
wydzieliny układu oddechowego (plwocina, popłuczyny z nosa lub oskrzeli,
wymaz z gardła, materiał pobrany w czasie bronchoskopii, aspirat z nakłucia
przeztchawiczego), mocz, kał lub wymaz z odbytu, materiał ze zmian skórnych
(ropa, zeskrobiny, płyn pęcherzykowy, itp.).
Materiał powinien być uzyskany z miejsca, gdzie obserwowany jest
proces chorobowy. Należy pamiętać jednak o tym, że większość wirusów wnika
do organizmu przez drogi oddechowe lub przewód pokarmowy, gdzie wstępnie
się namnażają, a podstawowe objawy kliniczne występują w narządach dalej
położonych. W takich przypadkach właściwe jest pobieranie próbek materiałów
z kilku miejsc, niezależnie od miejsca chorobowego. Jest to użyteczne, kiedy
trudno jest uzyskać próbkę z narządu wewnętrznego lub gdy wirus jest trudny
do izolacji z docelowego narzÄ…du.
Próbki świeże powinny natychmiast być wykorzystywane do posiewów,
mogÄ… być przechowywane w lodówce w stanie zamrożenia (-70°C). Przy
dłuższym transporcie zaleca się stosowanie podłoży transportowych, często z
dodatkiem antybiotyków w celu zahamowania wzrostu bakterii oraz przesyłanie
w termostatach (+ 4°C).
Techniki izolacji wirusów
Wirusy namnażają się
wyłącznie w żywych wrażliwych
komórkach. W warunkach
laboratoryjnych izolacja wirusa
jest możliwa dzięki
zastosowaniu zwierzÄ…t
laboratoryjnych, zarodków
kurzych oraz tzw. hodowli
tkankowych lub komórkowych
prowadzonych w warunkach
sztucznych in vitro. Używane są
hodowle pierwotne, linie
komórkowe diploidalne oraz
ustalone linie komórkowe 
heteroploidalne.
Podstawowe
Typ hodowli Charakterystyka Przykłady
wykorzystanie
Influenza,
diploid, komórki
pierwotna Parainfluenza,
Pierwotna mieszanych typów, 1
nerki małpiej niektóre enterowi
lub 2 pasaże
rusy
diploid, fibroblasty, ludzkie, diploidalne
HSV, CMV, VZV,
Linie komórkowe ograniczona liczba fibroblasty (WI-38,
Rhinovirus
pasaży (<50-70) MRC-5, HEL)
Ustalone (ciągłe) heteroploid, ciągłe
HeLa, Hep-2 RSV, Adenovirus
linie komórkowe pasaże in vitro
Do hodowli ciągłej (ustalonej) używa się tkanek nowotworowych
pasażowanych przez wiele lat. Często używa się tkanek:
- HeLa  z nowotworu nabłonkowego szyjki macicy
- KB  z nowotworu nabłonkowego jamy ustnej i języka
- FL  tkanka ludzka z błony owodniowej
Linie komórkowe do izolacji wirusów stanowią najczęściej fibroblasty
mysie (L) lub fibroblasty ludzkie (WI-38, MRC-5, HEL); sÄ… to tkanki
prawidłowe.
Wybór odpowiedniego typu hodowli tkankowej lub komórkowej zależy
od powinowactwa wirusa do
takich komórek. W celu izolacji
wirusa HIV stosowane sÄ…
specjalne hodowle limfocytów T
CD4 pochodzenia ludzkiego.
Wyizolowanie wirusa
polega na pobraniu
odpowiedniego materiału i
wstrzyknięciu wrażliwemu
zwierzęciu lub zakażeniu zarodka
kurzego, czy też hodowli
tkankowej. W zakażonych
narządach lub tkankach po określonym czasie obserwuje się zmiany - efekty
cytopatyczne (CPE).
Liczne wirusy zawierają na powierzchni składniki, które mają zdolność
aglutynowania krwinek czerwonych różnych gatunków zwierząt i/lub
człowieka. Zjawisko to jest nazywane hemaglutynacją czynną (HA). Niektóre
wirusy adsorbujÄ… siÄ™ tylko na powierzchni krwinek czerwonych, nie powodujÄ…c
ich aglutynacji  zjawisko to nazywane jest hemadsorpcjÄ… (HAd). Zjawiska HA
i HAd mogą występować z różnymi krwinkami i w różnych temperaturach
inkubacji. Służą one do dalszej lub jedynej (np. wirus grypy) identyfikacji
wirusów. Dla ostatecznej identyfikacji wirusów stosuje się swoiste grupowo lub
typowo surowice odpornościowe.
Wykorzystywane sÄ… odczyny serologiczne:
1. Odczyn neutralizujÄ…cy wirusa.
2. Odczyn wiązania dopełniacza (grupowe antygeny ortomyksowirusów).
3. Odczyn zahamowania hemaglutynacji czynnej  polega na dodaniu
surowicy odpornościowej do hodowli wirusów, które w ten sposób
związane zostają ze swoistymi przeciwciałami i pozbawione wolnych
receptorów biorących udział w połączeniu z krwinką, co w konsekwencji
daje zahamowanie hemaglutynacji; np. określane typów serologicznych
wirusa grypy.
4. Odczyn zahamowania hemadsorpcji  wykorzystuje siÄ™ hodowlÄ™
kontrolną i zakażoną wirusami. Na powierzchni komórek zakażonych
wirusami adsorbujÄ… siÄ™ krwinki czerwone, Dodanie surowicy
odpornościowej hamuje to zjawisko; zastosowanie w identyfikacji
myksowirusów.
5. Immunofluorescencja bezpośrednia dla wielu wirusów jest ostatnio
końcowym etapem identyfikacji.
Do identyfikacji wirusów wykorzystywane jest również mikroskop
elektronowy. Swoiste antygeny w hodowli coraz częściej są identyfikowane za
pomocą przeciwciał monoklonalnych w testach immunofluorescencji i
immunoenzymatycznych oraz neutralizacji wirusa. Coraz szersze wykorzystanie
ma również hybrydyzacja in situ.
BEZPOŚREDNIE WYKAZANIE WIRUSÓW W PRÓBKACH
MATERIAA
ÓW
Mikroskop świetlny:
1. Preparat bezpośredni barwiony barwnikami do barwienia
histopatologicznego  wykazanie obecności ciałek wtrętowych i/lub
komórek olbrzymich
2. Preparat bezpośredni barwiony metodą immunoperoksydazową (PAP) 
metody immunohistochemiczne
3. Mikroskopowa faza stała EIA
Mikroskop luminescencyjny:
1. Technika immunofluorescencji bezpośredniej ze znakowanymi FITC
surowicami odpornościowymi
2. Techniki immunofluorescencyjne w różnych odmianach (mikroskopowa
faza stała)
Mikroskop elektronowy:
1. Wykazanie cząstek wirusa w próbkach kału (Rotavirus, Norwalk,
adenowirusy jelitowe, HAV)
Metody immunologiczne do wykazania antygenów wirusowych:
1. Różne odmiany metod immunoenzymatycznych (EIA, ELISA, dot-
ELISA) z przeciwciałami monoklonalnymi (np. RSV, Influenzavirus A,
B, Parainfluenza 1-3, HSV, VZV, CMV, Rotavirus)
2. Aglutynacja lateksowa (Rotavirus)
3. Immunoelektroforeza przeciwprÄ…dowa (CIE) (Rotavirus)
4. Western blot (HIV)
Techniki molekularne:
1. Hybrydyzacja in situ w skrawkach tkanek lub w teście probówkowym:
Adenovirus, CMV, HSV, HPV  sondy genetyczne znakowane
radioaktywnie
2. Hybrydyzacja in situ  sondy nieradioaktywne
a) sondy biotynylowane: handlowe odczynniki Enzo dla wirusów: HSV
1/2, CMV, HBV, HPV-1, EBV, HAV, JC, BK, SV-40, Adenovirus typ
5
b) sondy oligonukleotydowe znakowane bezpośrednio za pomocą
fosfatazy alkalicznej dla: HSV-1, HSV-2, HSV1/2, HBV-sAg i HBV-
cAg
c) sondy molekularne znakowane chemiluminescencyjnie  gotowe
zestawy handlowe
3. Metody PCR
DIAGNOSTYKA SEROLOGICZNA ZAKAŻEC
WIRUSOWYCH
W diagnostyce chorób wirusowych wykorzystywana jest rutynowo
diagnostyka serologiczna. Najczęściej wykonywane są testy umożliwiające
wykrycie obecności swoistych przeciwciał wobec określonych antygenów
wirusowych. Stosuje się również testy wykrywające obecność rozpuszczalnych
antygenów wirusowych krążących we krwi.
Przeciwciała i antygeny wykrywane w surowicy nazywane są znacznikami
określonego zakażenia wirusowego. Potwierdzenie istniejącego czynnego
zakażenia wirusowego ma miejsce wówczas, gdy wykazywany jest antygen lub
swoiste przeciwciała IgM albo obserwowana jest serokonwersja ( wzrost 4-
krotny w kolejnym badaniu ) dla przeciwciał klasy IgG.
Przejściowe występowanie swoistych przeciwciał klasy IgM u noworodków
lub niemowląt wskazuje na zakażenie wrodzone lub okołoporodowe . Swoiste
IgM przeciwciała u dorosłych wskazują na kontakt pierwotny z antygenem lub
reaktywacją zakażenia bezobjawowego. Czterokrotne lub większe obniżenie
stężenia przeciwciał IgG , IgA wskazuje na przebyte zakażenie , bez
możliwości określenia czasu. Przeciwciała skierowane wobec licznych
antygenów wirusowych pozostają w organizmie przez miesiące , a nawet lata .
Wielokrotne badania serologiczne , najmniej dwóch próbek surowic , w okresie
2-3 tygodni , majÄ… zatem znaczenie diagnostyczne.
Do wykrywania obecności przeciwciał w surowicy stosowane są testy tj.:
- test neutralizacji (NT)
- wiązanie dopełniacza (CF)
- immunofluorescencji pośredniej (HF)
- zahamowanie hemaglutynacji (IH)
- metody immunoenzymatyczne (EIA)
CHEMIOTERAPIA ZAKAŻEC
WIRUSOWYCH.
Istniejecie wiele leków, które odpowiadałyby kryteriom
chemioterapeutyków przeciwwirusowych. Oznacza to, że chemioterapeutyk
przeciwwirusowy powinien wykazywać hamujące (wirostatyczne) działanie na
swoiste funkcje wirusa, bez oddziaływania na metabolizm komórki gospodarza,
w której się namnaża. Zastosowanie w lecznictwie znalazły preparaty skuteczne
w zakażeniach wywołanych wirusami z rodziny Herpesviridae, Retroviridae
oraz u chorych z ciężkimi postaciami wirusowego zapalenia wątroby, rzadziej
grypą czy innymi zakażeniami. Spośród naturalnych substancji o działaniu
przeciwwirusowym zastosowanie terapeutyczne znalazły interferony. Hamują
one syntezę białek wirusowych. Uzyskanie drogą inżynierii genetycznej
interferonów rekombinowanych stworzyło możliwość ich zastosowania
praktycznego u chorych z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B
i C. Od lat 80, w zwiÄ…zku z pojawieniem siÄ™ problemu AIDS, prace nad nowymi
lekami przeciwwirusowymi koncentrowały się nad preparatami skutecznymi w
leczeniu zakażeń retrowirusowych. Obecnie stosowane, syntetyczne związki
przeciwwirusowe, ze względu na ich mechanizm działania można podzielić na:
I. Hamujące proces odpłaszczania i uwalniania genomu do cytoplazmy
(amantadyna i rymantadyna).
II. Hamujące wirusową polimerazę DNA, enzym który umożliwia przyłączenie
kolejnych nukleozydów, czyli reakcję polimeryzacji (widarabina,
idoksyurydyna, triflurydyna, cidofowir). ZwiÄ…zki te sÄ… analogami naturalnych
nukleozydów, które wbudowują się do łańcucha DNA, uniemożliwiając dalszą
syntezÄ™ kwasu nukleinowego. MajÄ… czasem groz
ne działania niepożądane, gdyż
mogą wbudowywać się także do DNA komórki gospodarza. Niektóre z nich
można stosować tylko miejscowo.
III. Analogi nukleozydów aktywowane przez wirus (acyklowir, walacyklowir,
pencyklowir, famcyklowir, gancyklowir)  sÄ… pochodnymi guanozyny. Ich
mechanizm działania jest podobny do acyklowiru, różnią się biodostępnością i
znajdują zastosowanie w leczeniu zakażeń herpeswirusowych.
IV. Inhibitory rewertazy HIV  hamujÄ…ce odwrotnÄ… transkryptazÄ™, enzym
kluczowy w procesie replikacji wirusa, przepisujÄ…cy informacjÄ™ zawartÄ… w RNA
na komplementarną nić DNA. Związki należące do tej grupy ze względu na
strukturÄ™ chemicznÄ… dzieli siÄ™ na nukleozydowe (np. zidowudyna, zalcytabina,
stawudyna, lamiwudyna, didanozyna) i nienukleozydowe (np. delawirydyna,
efawirenz, newirapina).
V. Inhibitory proteaz (np. amprenawir, indinawir, nelfinawir, sakwinawir,
ritonawir). Ta grupa leków blokuje miejsce aktywne enzymu, który jest
niezbędny w procesie dojrzewania i formowania cząstek wirusa HIV.
Unieczynnienie tego enzymu zatrzymuje proces namnażania wirusa w komórce.
VI. Związki o szerokim zakresie działania (rybawiryna, foskarnet)  hamują
polimerazy wirusowe, a przez to namnażanie zarówno DNA, jak i RNA
wirusów m.in. grypy, paragrypy, bunyawirusów, arenawirusów, retrowirusów,
adenowirusów.
VII. Związki hamujące uwalnianie potomnych wirionów (zanamiwir i
oseltamiwir)  to niedawno odkryte selektywne inhibitory neuraminidazy wirusa
grypy typu A i B. Stosuje się także z dobrym skutkiem, szczególnie w
przypadkach osób zakażonych HIV, a ostatnio HBV i HCV, leczenie skojarzone
kilkoma lekami. Terapia HAART (ang. highly active anti retroviral therapy)
polega na podawaniu zazwyczaj 3 leków antyretrowirusowych o różnych
mechanizmach działania. Celem terapii HAART jest maksymalne obniżenie
poziomu wirusa we krwi, ochrona lub odbudowa układu immunologicznego,
poprawa jakości życia chorych, opóz
nienie wystąpienia AIDS i wydłużenie
czasu życia zakażonych. Całkowita eradykacja HIV przy obecnych
możliwościach chemioterapii nie jest możliwa.
Największą grupę przebadanych związków stanowią inhibitory syntezy kwasów
nukleinowych, będące analogami nukleozydów. Odpowiedniki nukleozydów
mogą hamować funkcje enzymów uczestniczących w metabolizmie puryn lub
pirymidyn, polimerazy biorącej udział w replikacji kwasu nukleinowego, lub
mogą blokować syntezę kwasów nukleinowych poprzez wbudowanie się do
czÄ…steczki kwasu.
W lecznictwie znalazły praktyczne zastosowanie tylko:
- idoksurydyna
- widarabina
- triflurydyna
- rybawiryna
- acyklowir
- gancyklowir
- zydowudyna
Z wyjątkiem acyklowiru, gancyklowiru i zydowudyny analogi nukleozydów są
inhibitorami niespecyficznymi komórkowej i wirusowej replikacji. Tylko w.w.
związki charakteryzują się selektywnym działaniem wobec enzymów
wirusowych.
Idoksurydyna- analog tymidyny działa na Hermes- i poxvirusy. Nie działa
wybiórczo. Mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy DNA.
Stosowany miejscowo w pryszczkowym zapaleniu rogówki.
Widarabina- działa na wirus opryszczki, Epsteina-Barr, ospy wietrznej, HBV.
Działanie polega na inhibicji syntezy DNA wirusa. Możliwość stosowania
doustnego.
Triflurydyna- Działa na HSV 1 i 2, CMV, działa też na komórki gospodarza.
Mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy DNA. Stosowany w
opryszczkowym zapaleniu rogówki.
Rybawiryna stosowany w ciężkich zakażeniach wirusem RSV, wirusem HCV
(w połączeniu z interferonami alfa-2) i w innych infekcjach wirusowych.
Rybawiryna jest analogiem nukleozydów purynowych. Jej działanie polega na
hamowaniu replikacji RNA i DNA niektórych wirusów, takich jak:
" myksowirusy
" paramyksowirusy
" arenawirusy
" retrowirusy
" adenowirusy
" flawiwirusy
" niektóre pokswirusy
Lek stosowany jest w leczeniu przewlekłej formy wirusowego zapalenia
wątroby typu C w połączeniu z interferonem alfa-2a lub alfa-2b oraz z
peginterferonem alfa-2a lub alfa-2b (peginterferony to inaczej interferony
pegylowane czyli z dołączoną cząsteczką glikolu polietylenowego]). Lek należy
zawsze łączyć z interferonem, ponieważ rybawiryna podawana w monoterapii u
chorych zakażonych HCV jest nieskuteczna. Ponadto rybawirynę stosuje się
podając wziewnie w ciężkich zakażeniach wirusem RSV u dzieci.
Acyklowir
Jest kompetytywnym inhibitorem polimerazy DNA-wirusa HSV
(opryszczki) i wirusa półpaśca (VZV). W komórkach zakażonych wirusem jest
aktywowany przez enzym wirusowy  kinazÄ™ tymidynowÄ…, ulega fosforylacji do
monofosforanu, z którego pod wpływem enzymów komórki powstaje
trójfosforan. Hamuje on wybiórczo nukleotydylotransferazę DNA- wirusa
zapobiegając jego namnażaniu. Wykazuje również słabsze działanie wobec
wirusów nie kodujących kinazy tymidynowej tj. EBV i CMV. Wśród wirusów
opryszczki spotyka się szczepy oporne na acyklowir, dotyczy to szczepów
mutantów niesyntetyzujących własnej kinazy tymidynowej. Lek wchłania się
dobrze z nabłonka rogówki, błony śluzowej nosa i z przewodu pokarmowego.
Podawany może być miejscowo, doustnie i dożylnie.
Gancyklowir
Swoisty inhibitor polimerazy wirusa cytomegalii (CMV). Wykazuje
również skuteczność w leczeniu zakażeń przewodu pokarmowego, zapalenia
płuc oraz objawów mononukleozy zakaz
nej. Ze względu na wysoką toksyczność
( hamowanie funkcji szpiku) zastosowanie w.w. leku jest ograniczone do
przypadków zagrażających życiu.
Zydowudyna
Jest odpowiednikiem tymidyny, który ulega fosforylacji w zakażonych i
nie zakażonych komórkach do trójfosforanu tj. aktywnej zydowudyny. W takiej
postaci jest wbudowana za pomocą odwrotnej transkryptazy (rewertazy), gdyż
silnie i selektywnie neutralizuje wirusową rewertazę. Mimo dużej toksyczności
lek stosowany jest w leczeniu HIV.
W leczeniu zakażeń wirusowych oraz innych chorób, zwłaszcza u
pacjentów z immunosupresją, mają zastosowanie także różne leki o
właściwościach immunomodulujących. Duże nadzieje wiązane są z
wykorzystaniem rekombinowanych interferonów i innych cytokin oraz
przeciwciał monoklinalnych swoistych dla antygenów wirusowych, receptorów
komórkowych lub inhibitorów indukowanych przez wirusy.
Zakażenia herpeswirusowe Zakażenia układu oddechowego Wirusowe zapalenia wątroby
Preparat Zastosowanie Preparat Zastosowanie Preparat Zastosowanie
Idoksyurydyn HSV  Amantadyna Wirus grypy Lamiwudyna Wirus
a zapalenie typu A zapalenia
rogówki (tylko wątroby typu B
miejscowo)
Triflurydyna HSV 
zapalenie Rymantadyna Wirus grypy Rybawiryna Wirus
rogówki (tylko typu A zapalenia
miejscowo) wÄ…troby typu C
Widarabina HSV 
zapalenie Rybawiryna Wirus grypy Interferon Wirus
rogówki (tylko typu A i B, zapalenia
miejscowo), wirus RS wÄ…troby typu B
i C
Acyklowir Zakażenia Zanamiwir
wywołane przez Wirus grypy
HSV i VZV typu A i B
Walacyklowir Zakażenia
wywołane przez
HSV i VZV
Zakażenia
Pencyklowir wywołane przez
HSV i VZV
Gancyklowir Zakażenia
wywołane przez
CMV
Zakażenia
Foskarnet wywołane przez
CMV
Zakażenia
Cidofowir wywołane przez
CMV, a także
HSV, VZV,
EBV