© Copyright by $taÅ›
1. DIAGNOSTYKA GRUy
LICY
a. Pobieranie materiału
b. Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testów morfologiczno-biochemicznych
c. Metody chromatograficzne
d. Metody genetyczne
2. DIAGNOSTYKA BAKTERII BEZTLENOWYCH
3. TECHNIKA BARWIENIA METOD
GRAMA:
a. Sposób barwienia
b. Mechanizm barwienia
c. Efekt barwienia Grama
D i a g n o s t y k a g r u z
l i c y
Wydłużone, pałeczkowate, proste lub lekko wygięte bakterie
Prątki to drobnoustroje wolno rosnące, tlenowe, o niezwykłej budowie ściany komórkowej
o Lipidy stanowią 40% masy ściany komórkowej, poza tym znajdują się w niej wielocukry,
nukleoproteidy i frakcje białkowej
Znaczna oporność na działanie kwasów (unikalna budowa ściany prątka, a dokładniej obecność w ich
ścianie kwasu mykolowego)
Z trudnością barwią się metodą Grama
Większość prątków to saprofity występujące w glebie i wodzie oraz jako stała flora ludzi i zwierząt
Choroby wywołane przez prątki nazywa się mykobakteriozami
o Gruz
lica wywołana przez Mycobacterium tuberculosis
o Trąd wywołany przez Mycobacterium laprae
o M. bovis, M. avium-intracellulare, M. kansasi, M. gordonaeÄ… prÄ…tki atypowe
Zakażenie prątkiem gruz
licy może być zlokalizowane w każdym narządzie, ale najczęściej narządem tym
jest: układ oddechowy, przewód pokarmowy, skóra, błony śluzowej
Najczęstszą postacią gruz
licy jest postać płucna
Prątki mogą również wywoływać gruz
licę jelit, skóry, węzłów chłonnych, kości czy opon mózgowo-
rdzeniowych
y
ródłem zakażenia jest osoba prątkująca lub chore zwierzę
Pobieranie materiału
Do diagnostyki mikrobiologicznej w kierunku mykobakteriozy materiałem może być: plwocina, materiały z
płukania oskrzelowego, popłuczyny żołądkowe, płyny wysiękowe, przesięki, płyn mózgowo-rdzeniowy,
mocz, materiał sekrecyjny
Pobranie dużej objętości płynu zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia czynnika chorobotwórczego (w 1
ml płynu może być jedynie kilka prątków)
Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testów morfologiczno-biochemicznych
Plwocina o objętości 10-20 ml ma być pobrana do jałowego naczynia, powinna być odksztuszona rano i
pochodzić  głęboko z płuc ą pobrany materiał przenosi się do płytki Petriegoą wyszukanie ropnych lub
podbarwionych krwią grudek ą przeniesienie ich ezą na szkiełko podstawowe ą przykrycie drugim
szkiełkiem i rozcieranieą uzyskuje się 2 preparatyą wyschnięcie i utrwalenie w płomieniu palnika
o Obecnie rutynowo stosowanÄ… metodÄ… w laboratoriach jest metoda fluorescencyjna (auramina,
rodamina, oranż akrydyny)ą prątki świecą
o Dawniej jedyną metodą barwienia prątków była metoda Ziehl-Neelsena ą prątki na kolor
czerwony, tło na niebieski
ż Wynik ujemny  brak prątków
ż Wynik wątpliwy  1-2 prątki w preparacie
ż Wynik dodatni + - pojedyncze prątki w całym preparacie
ż Wynik dodatni ++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia, obfite
prÄ…tkowanie
- 1 -
© Copyright by $taÅ›
ż Wynik dodatni +++ - liczne prątki w poszczególnych polach widzenia, bardzo obfite
prÄ…tkowanie
Hodowla prątków
o Homogenizacja prątkówą żeby usunąć pozostałą florę i zagęścić
o Rutynowo stosowane podłoże to podłoże Lowensteina-Jensena (masa jajowa + r-r zieleni
malachitowej) innym stosowanym podłożem stałym jest podłoże agarowe Middlebrooka
ż M. tuberculosisą suche, szorstkie, uniesione, żółtobeżowe kolonie o nierównej powierzchni
ż M. bovisą małe, bezbarwne, piramidokształtne kolonie
Identyfikacja
o Tempo wzrostu
o Zdolność do wytwarzania barwnika
o Cechami pozwalającymi na odróżnienie M. tuberculosis od pozostałych prątków są: wytwarzanie
czynnika sznurowego i produkcja niacyny
Inne, nowe, przyspieszone systemy hodowli prątków kwasoodpornych:
o Izotopowy półautomatyczny system do hodowania, różnicowania i oznaczania wrażliwości na leki
ż Do podłoża dodawany kwas palmitynowy znakowany węglem C14 ą prątki, rosnąć
zużywają kwas palmitynowy i wydzielają CO2 znakowany C14ą odczyt na podstawie
przyrostu radioaktywności CO2
o Wzrost na pożywkach Middelbrokaą odczyt wizualny
o PÅ‚ynny system hodowli z odczynnikami fluorescencyjnymi
o Nieizotopowy, w pełni skomputeryzowany system hodowli prątków na podłożach płynnych ą
odczyt na podstawie przyrostu CO2
o System hodowli prątków na pożywce płynnej Kirchnera z dodatkiem surowicy oraz soli
tetrazolowych
Metody chromatograficzne
Skład ilościowy i jakościowy kwasów mykolowych jest charakterystyczny dla poszczególnych gatunków
prątkówą analiza chromatograficzna kwasów tłuszczowych wyizolowanych ze ściany komórkowej
Metody genetyczne
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych
PCRą amplifikacja in vitro wybranych odcinków genomu
D i a g n o s t y k a b a k t e r i i b e z t l e n o w y c h
Tlenowce
Względne beztlenowce  to najliczniejsza grupa bakterii chorobotwórczych dla człowieka, np. E. coli, S.
aureus
Beztlenowce
o Ściśle bezwzględne beztlenowceą nie są zdolne do wzrostu gdy zawartość tlenu w atmosferze
przekracza 0,5% (np. Clostridium haemolyticum)
o Umiarkowane bezwzględne beztlenowceą troszkę większa tolerancja na tlen
Mikroaerofileą wymagają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, jednak jego stężenie powinno
być obniżone (5%) (np. Campylobacter jejuni)
chorobotwórczość beztlenowych laseczek sporujących należących do rodzaju Clostridium
o tężec, zgorzel gazowa, botulizm
izolacja i identyfikacja bakterii niesporujących jest trudniejsza, gdyż są one bardziej wymagające, jeśli
chodzi o warunki hodowli, niż bakterie Clostridium
- 2 -
© Copyright by $taÅ›
Aby umożliwić izolację beztlenowców z materiałów klinicznych muszą być spełnione następujące warunki:
o Pobieranie i przesyłanie materiału musi odbywać się w warunkach beztlenowych lub przy
ograniczonym dostępie tlenu
o Posiew powinien odbywać się pod osłoną gazu obojętnego, bądz
przy krótkotrwałym wystawieniu
na działanie powietrza
o Podłoża używane do hodowli powinny być świeżo przygotowywane lub przechowywane w
warunkach beztlenowych
o Należy zastosować odpowiednią metodę hodowli, która powinna być prowadzona w mieszaninie
gazów obojętnych przy równoczesnej kontroli warunków beztlenowych
o Izolacja kolonii musi być wykonana przy jak najkrótszym wystawieniu na działanie powietrza
Pobieranie i transport materiałów
o Materiał do badań może pochodzić z zakażeń toczących się w zamkniętych jamach ciała, z ropni,
materiałem do badań mogą być też skażone pokarmy
o Próbki z tych miejsc pobiera się przez aspirację, a nie przez wymazy, aby uniknąć skażenia ich przez
bakterie tlenowe.
o Transport
ż Technika otwarta transportu polega na umieszczeniu materiału w szerokiej probówce z
CO2, zamkniętej szczelnie gumowym korkiem
ż Częściej stosowaną i prostszą metodą jest tzw. technika zamknięta ą wprowadzenie
materiału ze strzykawki przez gumowy korek do fiolek wypełnionych wolnym od tlenu
gazem (CO2, N2) i specjalnie przygotowanym podłożem do wzrostu beztlenowców
Preparat bezpośredni
o Po dostarczeniu materiału do laboratorium wykonuje się preparat bezpośredni barwiony metodą
Grama. W preparatach należy zwracać uwagę na:
ż Nieregularnie barwiące się, pleomorficzne, Gram-ujemne pałeczki: Bacteroides
ż Cienkie, ostro zakończone Gram-ujemne pałeczki zawierające często ziarnistości:
Fusobacterium
ż Duże grube i drobne Gram-dodatnie laseczki ze sporami w środku: Clostridium
ż Cienki i nitkowate, bądz
grube maczugowate Gram-dodatnie laseczki: Bifidobacterium,
Corynebacterium, Propionibacterium, Ramibacterium, Catenaebacterium
ż Gram-dodatnie ziarenkowce, tworzące dwoinki lub łańcuszki: Peptococcus,
Peptostreptococcus
ż Drobne Gram-ujemne ziarenkowce: Veillonella
Posiew materiału
o Żeby usunąć tlen z podłoża w którym mają rosnąć należy najprościej zagotować pożywkę, a
następnie ją szybko ochłodzić
o Wprowadzenie materiału do pożywki i przykrycie warstwą jałowej parafiny
o PreferowanÄ… metodÄ… jest hodowla w anaerostatach.
o Obecnie najczęściej stosowane są naczynia, w których atmosferę beztlenową uzyskuje się na
drodze chemicznej
o Podłoża z wysianymi materiałami inkubuje się przez 48 godzin.
o Obecnie polecanym podstawowym podłożem do hodowli bakterii beztlenowych jest półpłynne
podłoże tioglikolanowe wzbogacone witaminą K i heminą
Identyfikacja beztlenowców
o W przybliżonej diagnostyce bakterii beztlenowych posługujemy się skróconymi schematami
identyfikacyjnymi.
o W zasadzie u wszystkich beztlenowców należy dokładnie opisać:
ż wygląd kolonii
ż zachowanie ich w promieniach UV
ż zmiany w podłożu wokół koloni (depresja podłoża, pęknięcia agaru, hemoliza)
ż określić morfologię komórek
ż określić barwliwość wg Grama,
ż zbadać wytwarzanie katalazy
ż zbadać fermentację niektórych węglowodanów
- 3 -
© Copyright by $taÅ›
T e c h n i k a b a r w i e n i a m e t o d Ä… G r a m a :
Sposób barwienia
1. na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść bakterie i po ewentualnym dodaniu płynu fizjologicznego
wykonać rozmaz
2. szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić przez trzykrotne
przesunięcie nad płomieniem palnika
3. utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego
4. odczekać 60 sekund
5. tryskawką delikatnie zmyć barwnik
6. zalać preparat jodyną lub płynem Lugola
7. odczekać 30 sekund
8. ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund
9. spłukać preparat wodą
10. dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund
11. dobrze spłukać preparat wodą i oglądać pod mikroskopem
Mechanizm barwienia
Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.
Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy
złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.
Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w
wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W
rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u
bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik.
Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne  bezbarwne.
Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniając
barwy komórek Gram-dodatnich.
Efekt barwienia Grama
W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być trojakie:
bakterie barwią się na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, określamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +)
bakterie barwią się w kolorze czerwonym, określamy jako Gram-ujemne lub (Gram -)
bakterie nie barwią się w ogóle metodą Grama
- 4 -