Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
Ćwiczenie 4
Temat: KWAS ASKORBINOWY
Część teoretyczna
Kwas L- askorbinowy jak również kwas L- dehydroaskorbinowy są związkami biologicznie
czynnymi, wykazują aktywność witaminy C. Pod względem chemicznym kwas L- askorbinowy jest
laktonem endiolu kwasu 2- okso- L- gulonowego. W organizmie człowieka brakuje aktywności
ostatniego enzymu szlaku syntezy kwasu askorbinowego czyli dehydrogenazy kwasu L-
gulonowego. Awitaminoza wywołana niskim spożyciem witaminy C jest obecnie bardzo rzadka i
występuje najczęściej u alkoholików, osób palących tytoń, ludzi starszych i z
le odżywianych.
Zapotrzebowanie dzienne organizmu człowieka na witaminę C jest o jeden, dwa rzędy wielkości
większe niż na inne witaminy i wynosi od 50- 100 mg.
Kwas askorbinowy występuje naturalnie w wielu owocach i warzywach. Syntetyczny kwas
askorbinowy jest klasyfikowany jako bezpieczny (GRAS - generally recognized as safe) dodatek do
żywności. Dodaje się go do wielu produktów żywnościowych, w których związek ten ma spełniać
wielorakie funkcje (tabela 1).
Tabela 1. Funkcje kwasu askorbinowego (naturalnie obecnego lub wprowadzanego) w żywności
funkcja produkt żywnościowy
niezbędny składnik pokarmowy soki i napoje owocowe, płatki śniadaniowe
jabłka, brzoskwinie, morele, ziemniaki, kalafior,
antyoksydant (kontrola jełczenia oksydacyjnego i/lub
grzyby, oliwki, orzechy, pomidory, masło orzechowe,
ciemnienia enzymatycznego)
frytki, napoje owocowe
oleje roślinne (współdziała z tokoferolami, BHA,
antyoksydant (palmitynian askorbylu)
BHT)
hamowanie korozji puszek napoje bezalkoholowe
zachowanie smaku, zapachu, koloru wina
zapobieganie powstawania czarnych plam krewetki
hamowanie powstawania nitrozoamin bekon
przyspieszanie powstawanie koloru mięsa
bekon, szynka, kiełbasa
peklowanego
polepszacz mąki mąka pszenna stosowana do pieczenia
stabilizowanie koloru w mięsie pakowanym świeża wieprzowina
Kwas askorbinowy występujący naturalnie to kwas L- askorbinowy. Znane są cztery
stereoizomery kwasu askorbinowego (rys.1). Kwas D- askorbinowy posiada 1/10 aktywności kwasu
L- askorbinowego, natomiast kwas izoaskorbinowy (erytorbowy) wykazuje jedynie 1/20
aktywności witaminowej kwasu L- askorbinowego.
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 1 Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
kwas L- askorbinowy kwas D- askorbinowy
kwas D- izoaskorbinowy kwas L- izoaskorbinowy
(D- erytorbowy) (L- erytorbowy)
Rysunek 1.
Charakter kwasowy kwasowi askorbinowemu nadaje wodór grupy hydroksylowej przy węglu
3 (tabela 2).
Tabela 2. Chemiczne i fizyczne właściwości kwasu askorbinowego
związek o silnych właściwościach redukujących, antyoksydant
masa cząsteczkowa: 176
rozpuszczalność w wodzie: 33% w/v w 25oC
słaby kwas: pKa1= 4,2; pKa2= 11,8
Wybrane funkcje kwasu askorbinowego, stosowanego jako dodatek do żywności:
1. Zmiatacz tlenu. Żywność butelkowana lub puszkowana zawiera często trochę tlenu
cząsteczkowego, którego obecność zwykle jest niepożądana (tlen może powodować
jełczenie, utratę barwy). Dodatek kwasu askorbinowego może spowodować usunięcie tego
tlenu (rys. 2)
2. Zmiatacz wolnych rodników. Jon askorbinianowy jest zmiataczem wolnych rodników.
Silnie redukujące właściwości decydują o reaktywności wobec O2-" , H2O2, " OH, rodników
nadtlenkowych i tlenu singletowego. Może też reagować z rodnikiem tokoferylowym i
innymi rodnikami fenylowymi (rys. 3). Kwas askorbinowy działa synergistycznie z
witaminą E i innymi fenolowymi antyoksydantami, takimi jak BHA lub BHT.
3. Kontrola ciemnienia enzymatycznego. Kwas askorbinowy jest związkiem hamującym
proces ciemnienia enzymatycznego. Redukuje chinony powstałe na skutek aktywności
enzymatycznej polifenolooksydazy do wyjściowych fenoli (rys. 4).
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 2 Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
Rysunek 2.
TOH + LOO" LOOH + TO"
AH- + TO" A" + TOH
2 A" + H+ AH- + DHA
(TOH- tokoferol, LOO" - rodnik nadtlenkowy, TO" - rodnik tokoferylowy, AH jon askorbinianowy, A" - rodnik
askorbylow, DHA- kwas dehydroaskorbinowy)
Rysunek 3.
Rysunek 4.
Stabilność kwasu askorbinowego
Kwas askorbinowy jest bardzo stabilnym laktonem. Stabilność tę traci w momencie utlenienia
do kwasu dehydroaskorbinowego. Kwas dehydroaskorbinowy łatwo ulega hydrolizie do kwasu
diketogulonowego, który nie posiada aktywności witaminy C. Dlatego też proces utlenienia kwasu
askorbinowego wpływa degradująco na ten związek.
Degradacja kwasu askorbinowego przebiega wieloma szlakami. Zidentyfikowano przemiany
tlenowe i beztlenowe (rys. 5 ). W przypadku obecności tlenu przeważa ścieżka tlenowa.
Czynnikami, które mogą wpływać na szybkość degradacji są: temperatura, stężenie soli i cukrów,
pH, stężenie tlenu, metale (szczególnie żelazo i miedz
) oraz enzymy.
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 3 Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
-
O
OH
anion kwasu askorbinowego
kwas 2-okso-L-gulonowy (forma enolowa)
HO
O
O
HO
O
HO
HO OH
OH
H
H
HO2
rodnik askorbylowy
HO
AH
O
O
HO
O OH
CO2
HO
H2O
H+
O
O
HO
O
kwas dehydroaskorbinowy
HO
O
O
O2 H2O2
HO
H2O
O
H
O O
H H
HO O
kwas 2,3- dioksogulonowy
H
HO H
O
O2 HO
OH
HO
O OH
HO
H
3-deoksy-L-erytropentozuloza
HO
kwas szczawiowy
2H2O
HO O
O OH
forma 3,4 endiolowa
O
HO
O
H OH
H
HO O
kwas L-treonowy
HO H
HO
H
furfural
HO
HO
CO2
HO
różne produkty w zależności od pH
O
środowiska
H
O O
O
O H
H
kwas furanowy H
O
O O
H OH
kwas 2,5- dihydro-2-furanowy
OH
HO H
OH
L-erytropentozuloza (L- ksylozon)
3-hydroksy 2-piron HO
H
O
H3C
H
O
HO
5-metylo- 4-hydroksy- 3 -(2H) furanon
Rysunek 5.
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 4 Katedra Biotechnologii Żywności
dr
o
ga
b
e
z
t
l
e
n
o
w
a
+
2
O
2
H
O
2
/
H
r
o
t
a
z
i
l
a
t
2
ka
O
n+
M
Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
Część praktyczna
Odczynniki:
roztwory wodne kwasu askorbinowego: 0,5 mg/ cm3
10 mg/ cm3
kwas szczawiowy 0, 25 mol/ dm3
2,6 dichloroindofenol
roztwór siarczanu miedziowego CuSO4"5H2O: 5 g/ 50 cm3
bufor glicynowy 0,1 mol/ dm3 pH 2,0
bufor glicynowy 0,1 mol/ dm3 pH 8,6
HCl 1 mol/ dm3
Materiał roślinny: kapusta biała
1. SPORZ
DZANIE KRZYWEJ WZORCOWEJ
Do 4 kolbek Erlenmayerek wlać 9 cm3 kwasu szczawiowego i 1 cm3 HCl 1 mol/ dm3. Do
poszczególnych kolbek dodać kwas askorbinowy o stężeniu 0,5 mg/ cm3 w ilości: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0
cm3. Tak przygotowane roztwory miareczkować natychmiast 2,6- dichloroindofenolem do
wystąpienia lekko różowego zabarwienia, utrzymującego się przez 30 sekund.
Sporządzić krzywą wzorcową: wykres zależności objętości barwnika zużytego do
miareczkowania do miligramów kwasu askorbinowego.
2. WPA
YW PH NA STABILNOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO
Przygotować dwa roztwory kwasu askorbinowego:
A: 1,0 mg/ cm3 kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm3 pH 2,0
B: 1,0 mg/ cm3 kwasu askorbinowego w buforze glicynowym 0,1 mol/ dm3 pH 8,6
Roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 24h w temperaturze pokojowej.
Oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w roztworach A i B, posługując się procedurą opisaną
w pkt. 1 (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm3 roztworów A i B). Wyniki wyrazić w mg/ cm3
roztworu.
3. WPA
YW TEMPERATURY, PH I JONÓW MIEDZI CU2+ NA STABILNOŚĆ KWASU
ASKORBINOWEGO
Sporządzić po 10 cm3 następujących roztworów:
a) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0
b) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6
c) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 2,0 + CuSO4
d) kwas askorbinowy w buforze glicynowym pH 8,6 + CuSO4
W tym celu do probówek (plastikowe z nakrętką) wlać 1 cm3 kwasu askorbinowego o stężeniu 10
mg/ cm3, 0,5 cm3 CuSO4 (roztwory c i d) i dopełnić odpowiednim buforem do objętości 10 cm3.
Dobrze wymieszać. Probówki umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej, gotować 15 minut, schłodzić.
Posługując się procedurą opisaną w punkcie 1, oznaczyć zawartość kwasu askorbinowego w 1 cm3
każdego roztworu (uwaga: do oznaczenia pobierać 1 cm3 roztworów a i b, 1- 2 cm3 roztworów c i
d).
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 5 Katedra Biotechnologii Żywności
Biochemia Żywności BIOTECHNOLOGIA Ćwiczenie 4
4. WPA
YW GOTOWANIA NA ZAWARTOŚĆ KWASU ASKORBINOWEGO W
KAPUŚCIE
a) zagotować 100 cm3 wody destylowanej w zlewce na 250 cm3. Dodać 5 g pokrojonej,
surowej kapusty i gotować przez 15 minut. Po tym czasie kapustę wyciągnąć z wody,
schłodzić i osuszyć powierzchniowo bibułą. Schłodzić również wodę pozostałą po
gotowaniu i zmierzyć jej objętość.
b) 5 g pokrojonej surowej kapusty umieścić w moz
dzierzu. Dodać 10 cm3 kwasu
szczawiowego, szczyptę piasku i ucierać przez 3 minuty. Po tym czasie dodać kolejne 10
cm3 kwasu szczawiowego i ponownie ucierać. Obliczyć całkowitą objętość ekstraktu,
przyjmując, że surowa i ugotowana kapusta zawiera 92% wody.
c) ekstrakt przefiltrować przez bibułę Whatmana do probówki.
d) przenieść 5 cm3 przesączu do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm3. Dodać 10 cm3 kwasu
szczawiowego i 1 cm3 HCl 1 mol/ dm3. Miareczkować 2,6- dichloroindofenolem, aby
określić zawartość kwasu askorbinowego. Oznaczenia wykonać w dwóch powtórzeniach.
Zawartość kwasu askorbinowego wyrazić w mg/ 100 g kapusty.
e) czynności opisane w pkt. b- d powtórzyć dla kapusty ugotowanej.
f) do kolbki Erlenmeyerki na 50 cm3 przenieść 5- 20 cm3 wody po gotowaniu. Dodać 10 cm3
kwasu szczawiowego i 1 cm3 HCl 1 mol/ dm3. Mareczkować 2,6- dichloroindofenolem.
Oznaczenie wykonać w 2 powtórzeniach. Obliczyć całkowitą zawartość kwasu
askorbinowego w wodzie po gotowaniu.
g) obliczyć jaki procent zawartości kwasu askorbinowego w surowej kapuście stanowi
zawartość tego związku w kapuście ugotowanej i w wodzie po gotowaniu.
Rysunek 6. Reakcja kwasu askorbinowego z 2,6 dichlorofenoloindofenolem
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie 6 Katedra Biotechnologii Żywności