made by Wój

Wykład 1 Podstawy metodologii w histologii, cyto- i histochemii.

Światło białe według teorii Maxwella jest elektromagnetycznym ruchem falowym. Fale świetlne różnią się od

fal radiowych tylko długością, jedne i drugie rozchodzą się z tą samą prędkością c=3x108m/s. Promienie

Roentgena (X) i gamma przynależą do fal elektromagnetycznych.

Światło widziane w tym zakresie obejmując od 3800A do 7700A jest niewielkim wycinkiem. Z obu tych stron,

rozciąga się światło niewidzialne - podczerwone (IR) 7700A - 3μm i 3 - 100μm (bliska i daleka podczerwień)

i nadfioletowe (UV) 1300 - 3800A oraz 1300 - 100A (bliski i daleki nadfiolet). Podaje to w μm i A pomimo iż

podstawową jednostką w SI jest metr jednak przyjęło się określać te wielkości w μm i A. Oko ludzkie jest

najbardziej wrażliwe na długość ok. 5500A.

Soczewki i ich układy są obarczone szeregiem wad, czyli tzw. aberracjami: chromatyczna, sferyczna

i astygmatyzmem.

Tzw. szkło kronowe i flintowe zmniejsza znacznie wadę chromatyczną.

APERTURA NUMERYCZNA I ZDOLNOŚĆ ROZDZIELCZA MIKROSKOPU:

A= n * sinα

1/d = λ / 2A

d – najmniejsza odległość pomiędzy dwoma obiektami przedmiotu, które w obrazie mikroskopowym mogą być

jeszcze rozróżniane jako oddzielne.

Teoretyczna d dla mikroskopów suchych ok. 0,3 μm dla olejkowo-imersyjnych ok. 0,19 μm

POWIĘKSZENIE MIKROSKOPU:

Powiększenie okularu * powiększenie obiektywu

W badawczym mikroskopie świetlnym powstający obraz jest pozorny, powiększony, odwrócony.

MIKROSKOPY SPECJALNE:

Mikroskop polaryzacyjny

Posiada wbudowane w układ optyczny dwa pryzmaty Nikola lub siatki polaryzacyjne (polaryzator i analizator)

powodujące polaryzację światła (uporządkowanie chaotycznych drgań fal świetlnych w jednakowej

płaszczyźnie).

Obiekty przejrzyste można podzielić na izotropowe, czyli pojedynczo załamujące światło i niewidoczne w tym

mikroskopie oraz anizotropowe (podwójnie załamujące światło) i widoczne jako obiekty na ciemnym tle.

W diagnostyce histopatologicznej wykorzystywany jest do wykrywania złogów skrobiawiczych (amyloidu)

wybarwianych czerwienią Kongo, lipidów

Mikroskop fazowo-kontrastowy

Mikroskop k-f stosowany jest do badania komórek nie zabarwionych z reguły żywych oraz niekiedy do

wzmocnienia ogólnego kontrastu w preparatach zabarwionych słabo lub wybiórczo (np. w metodach

histochemicznych)

Fala świetlna przechodząc przez obiekt może ulec opóźnieniu względem fali przechodzącej obok. Powstanie

różnica faz – przesunięcie fazowe. W materiale biologicznym różnica faz między falami przechodzącymi przez

obiekt i obok obiektu wynosi około ¼ długości fali. Oko ludzkie jednak nie rejestruje tego efektu, tzn. struktury

małe, niewiele różniące się od siebie stopniem pochłaniania światła są w mikroskopie niewidoczne. Różnica ta

może się stać widoczna, jeśli efekt fazowy zostanie zamieniony na amplitudowy. Tę zmianę uzyskuje się dzięki

nałożeniu na siebie (interferencji) fali opóźnionej z nieopóźnioną.

Mikroskop interferencyjno-polaryzacyjny

W mikroskopie z urządzeniem i-p można w ułamkach długości fali świetlnej mierzyć przesunięcia fazowe światła

przechodzącego przez badane struktury co umożliwia określić stężenie substancji w danych obszarach komórki

czyli podać suchą masę materii żywej, tym samym pozwala na określenie wagi komórki lub jej badanego

organella.

1

made by Wój

Mikroskop z optyką Nomarskiego

Jest to przykład mikroskopu ze specjalnym systemem optycznym, będącym modyfikacją mikroskopu

kontrastowo-fazowego i interferencyjnego.

Kontrast różnicowej interferencji Nomarskiego, pozwala na znaczne wzmocnienie kontrastu nie zabarwionych

struktur komórkowych i uzyskanie ich plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu.

Mikroskop z kondensatorem ciemnego pola

Mikroskopowanie w tzw. ciemnym polu umożliwia dostrzeżenie w preparacie drobnych cząsteczek

o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Wykorzystuje się tu zjawisko dyfrakcji (ugięcia)

promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych wymiarach.

Obiekty w tej metodzie są widoczne jako drobne świecące punkty na ciemnym tle.

Metodę ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów obecnych w płynach ustrojowych.

W praktyce - wystarczy opuścić kondensor, który powoduje większe lub mniejsze załamanie światła.

Mikroskop fluorescencyjny

W mikroskopie tym wykorzystano własność niektórych substancji chemicznych polegającą na emitowaniu

światła widzialnego pod wpływem naświetlania promieniami ultrafioletowymi (UV).

System naświetlania preparatu:

- diailuminescencyjny (od dołu)

epiiluminescencyjny (od góry)

Fluorescencja własna (endogenna) np: lipofuscyna, porfiryny, witamina A, chlorofil,

Fluorochromy: oranż akrydyny, fluoresceina, rodamina

Znakowanie materiału metodą immunofluorescencji bezpośredniej (znajduję antygen – przeciwciało

fluorescencyjne) lub pośredniej (wykrywa całe kompleksy).

Mikroskop konfokalny

Służy do warstwowej obserwacji badanych struktur jak i również oglądania obrazów w formacie 3D. Za jego

pomocą można tworzyć obrazy kolejnych warstw o grubości 1-2um. Obserwacje można również prowadzić na

obiektach żywych.

Typy:

- skanujące laserowe mikroskopy konfokalne w których laserowy promień skanuje pole po polu, linia po linii

(d=0,1um)

- mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem

- PAM

Mikroskop elektronowy transmisyjny (TEM) i skaningowy (SEM)

W celu powiększenia obrazu w mikroskopie elektronowym używa się strumienia elektronów. Mikroskopy

elektronowe dzielimy na transmisyjne – elektrony przenikają przez badane struktury oraz skanujące – elektrony

odbijają się od powierzchni struktury, po czym są skanowane.

Elektrony emitowane są pod napięciem 20kV-2MV, przez katodę mikroskopu biegną w próżni wzdłuż soczewek

elektromagnetycznych, będących odpowiednikami soczewek świetlnych. Uzyskany obraz można fotografować

otrzymując elektronogramy.

Zdolność rozdzielcza dla TEM wynosi 0,2-1nm, dla SEM zaś 10nm.

Mikroskop elektronowy - transmisyjny

Pobieranie żywej tkanki —> pobrany fragment tkanki —> docięte fragmenty tkanki przeznaczonej do utrwalenia

—> utrwalenie np. w glutaraldehydzie —> płukanie tkanki w buforze —> kontrastowanie (barwienie) tkanki w

całości (kontrastowanie w bloku) —> odwadnianie w alkoholach o wzrastającym stężeniu —> przepojenie

tkanki niepolimeryzującą żywicą —> zatopienie w żywicy (np. w żywicy epoksydowej jak Epon lub Araldit),

polimeryzacja w 60°C —> gotowy spolimeryzowany bloczek żywicy —> bloczek żywicy w uchwycie docięty do

krojenia —> krojenie ultracienkie za pomocą nożyka szklanego lub diamentowego, nałożenie skrawków na

siateczki miedziane —> kontrastowanie dodatkowe (barwienie) nałożonych skrawków ultracienkich —> skrawki

gotowe do mikroskopowania.

RODZAJE PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH:

• Skrawki - podstawowa forma preparatu histologicznego

• Szlify (np. zębina, szkliwo, kość)

2

made by Wój

• Rozmazy (np. krwi), wymazy (np. z jamy ustnej)

• Rozgnioty (np. śledziona – poszukiwanie określonych komórek)

• Odciski narządowe (np. skóra, oko – badanie obecności grzybów)

• Hodowle komórkowe

TECHNIKA HISTOLOGICZNA - MIKROSKOPIA ŚWIETLNA

1. Pobieranie materiału ok. 1cm, dla mikroskopu elektronowego ok. 1mm.

2. Utrwalanie - szybkie uśmiercanie komórki bez zmiany struktury.

Dobry utrwalacz:

a) szybko przenika w głąb tkanki,

b) szybko koaguluje białka, jednak niezbyt gwałtownie (blokowanie enzymów przed procesami gnilnymi)

c) jest izotoniczny w stosunku do płynów tkankowych.

Utrwalacze proste:

- kwasy mineralne (azotowy HNO , siarkowy H SO , chromowy = trójtlenek chromu Cr O , osmowy =

3

2

4

2

3

czterotlenek osmu OsO ),

4

- kwasy organiczne (mrówkowy HCOOH, octowy CH COOH, trójchlorooctowy CCl COOH, pikrynowy =

3

3

trójnitrofenol)

- inne (alkohol etylowy C H OH, metylowy CH3OH, propylowy CH CH CH OH, aceton CH COCH , formalina

2

5

3

2

2

3

3

CH O, aldehyd szczawiowy OHCCHO), sole metali ciężkich (sublimat = dwuchlorek rtęci HgCl , sole ołowiu

2

2

azotan lub octan, cynku ZnCl ).

2

Utrwalacze złożone:

-utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform, kw. octowy lodowaty),

-utrwalacz Bakera (formalina, chlorek wapnia, woda destylowana),

-utrwalacz Susa (sublimat, chlorek sodu, woda destylowana),

-utrwalacz Zenkera-Helly’ego (dwuchromian potasu, sublimat, kw. octowy lodowaty),

-utrwalacz Buina (kw. pikrynowy, formalina, kw. octowy lodowaty, kw. trichlorooctowy).

3. Odwodnienie utrwalonych tkanek: 50-100% alkohole,

4. Zatapianie w parafinie: płyny pośrednie (np. ksylen, benzen, toluen) > parafina (w metakrylanie dla ME)

5. Krojenie: mikrotomy saneczkowe, korbowe,

6. Nawodnienie: 100-50% alkohole,

7. Barwienie:

metoda progresywna (rozcieńczone barwniki i barwienie w ciągu dłuższego czasu 12-24h) - barwienie czyste

i selektywne,

metoda regresywna (stężone barwniki i krótki okres barwienia) - nierównomierne barwienie, możliwość

przebarwienia i zabarwienia nieswoistego.

hematoksylina (najczęściej stosowana hematoksylina Meyera lub Ehrlicha), wyciąg z amerykańskiego drzewa

ERYTROXYLON CAMPECHIANUM - barwienie jąder komórkowych (czyli substancji kwaśnych)

ęozyna (barwienie kwaśne, cytoplazmatyczne)

8. Odwodnienie: 50-100% alkohole ew. płyny pośrednie

9. Zatapianie preparatu na stałe: syropy, żele np. glicerożelatyna (glicerol + żelatyna), żywice np. balsam

kanadyjski.

ROŻNE RODZAJE BARWIENIA

Barwienie metachromatyczne

Szczególnym rodzajem barwienia jest barwienie metachromatyczne, polegające na tym, że barwione struktury

zostają zabarwione innym kolorem niż kolor barwnika użytego do barwienia. Ze zjawiskiem metachromazji ma

się do czynienia np. przy barwieniu mukopolisacharydów w chrząstce - siarczanu chondroityny, albo komórek

tucznych, których ziarnistości barwią się metachromatycznie ze względu na zawartość heparyny.

Do barwienia metachromatycznego używa się błękitu toluidyny; który daje różowofioletowe zabarwienie

struktur metachromatycznych. Jest to spowodowane tym, barwnik ten układa się na zabarwionych

metachromatycznie cząsteczkach w sposób uporządkowany, w skutek czego powstają dimery inaczej

absorbujące widmo światła białego niż monomer.

3

made by Wój

Barwienie polichromatyczne

Do barwień stosowanych najczęściej w diagnostyce hematologicznej należy barwienie polichromatyczne

mieszaniną barwników zasadowych i kwaśnych. Barwienie takie dokonuje się też w diagnostyce wymazów

komórkowych z różnych błon śluzowych.

Barwienie przyżyciowe: błękit metylenowy, błękit toluidyny, błękit Nilu.

1. Hematoksylina żelazista i Pikrofuksyna:

Jądro – brązowe

Cytoplazma – żółta

Kolagen – czerwony

2. Azokarmin i Błękit anilinowy (Mallory)

Jądro - czerwone

Cytoplazma - szkarłatna

Kolagen - niebieski

3. Hematoksylina i Oranż G-Erythrosyna (H and OGE)

Jądro – szkarłatne

Cytoplazma - różowa

Kolagen – pomarańczowy

4. Hematoksylina i Eozyna (H & E)

Jądro - szkarłatne

Cytoplazma - różowa

Kolagen – różowy

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE - MROŻENIOWA

Techniki mrożeniowe polegają na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie.

Zalety: są krótkotrwałe (gdy zależy nam na czasie), zachowują wszystkie składniki w materiale biologicznym

(tłuszcze obojętne), procedura przebiega w niskiej temperaturze co zapobiega denaturacji białek.

Materiał zamraża się:

- wciekłych gazach: azot (-196°C), hel (-269°C), freon, izopropan

- za pomocą zestalonego dwutlenku węgla - tzw. „suchy lód" (-78,5°C)

Krioprojekcja polega na przepojeniu materiału roztworem sacharozy (15-30%) lub gliceryny (15-30%) lub DMSO

(10%) w celu uniknięcia krystalizacji wody podczas zamarzania.

Materiał zamrożony kroi się w:

- mikrotomie mrożeniowym,

- kriostacie

Liofilizacja - proces suszenia zamrożonego materiału biologicznego w próżni oraz w obniżonej temperaturze na

drodze sublimacji wody. Metoda ta pozwala na zachowanie w tkance wszystkich substancji chemicznych.

BADANIE HISTOHEMICZNE

Za pomocą reakcji histochemicznych można identyfikować kwasy nukleinowe, wielocukry, tłuszczowce,

z mniejszą dokładnością białka, a także barwniki i niektóre składniki nieorganiczne.

Przed wykazaniem różnic w składzie chemicznym komórek leżących obok siebie lub zmian wywołanych

działającymi na nie czynnikami, reakcje te mogą stanowić wskaźnik stanu czynnościowego komórki.

W nielicznych tylko przypadkach reakcje histochemiczne mogą stanowić również podstawę do obliczeń ilości

badanej substancji. Obliczenia takie opierają się na prostej zależności między ilością barwnego produktu reakcji

a stężeniem badanej substancji w tkance. Ilość produktu reakcji warunkuje z kolei stopień pochłaniania

monochromatyczngo światła, o odpowiednio dobranej długości fali, przepuszczonego przez zabarwiony obszar

tkanki.

4

made by Wój

BIAŁKA I AMINOKWASY

Niestety jak dotąd nie ma pewnych i swoistych odczynników histochemicznych na poszczególne białka

i aminokwasy. Stosowana dość powszechnie (i w zasadzie jedyna) metoda bromofenolowa (z użyciem rtęci lub

bez niej) pozwala jedynie na ogólne zorientowanie się w „zawartości" białek w komórce, bez możliwości

rozróżnienia czy chodzi o białka złożone czy proste, nie mówiąc już o rozróżnieniu białka prostego (np. albuminy

czy globuliny) bądź rodzaju białka występującego w połączeniach (kompleksach) z innymi związkami (np.

glikoproteidy czy lipoproteidy).

WĘGLOWODANY

W celu uwidocznienia umiejscowienia wielocukrów w komórkach i tkankach stosuje się metodę, w której używa

się kwas nadjodowy i odczynnik Schiffa. czyli tzw. metoda p. a. S. Ogólną podstawą tej metody jest względnie

swoiste rozrywanie wiązania miedzy atomami węgla (C-C) w cząsteczce glikogenu i utlenianiu związku z tymi

węglami grup 1,2 glikolowych (CHOH - CHOH) na grupy aldehydowe (CHO-CHO). Powstały stad dwualdehyd

łączy sie z Ieukofuksyną odczynnika Schiffa dając trwałe purpurowoczerwone zabarwienie. W związku z tym, że

tego rodzaju grupy 1,2 glikolowe występują w innych związkach, a ponadto kwas nadjodowy utlenia również do

grup aldehydowych grupy 1,2 glikoaminowe, alkiloaminowe i ketonowe innych niż wielocukry związków –

w każdym przypadku przed wykonaniem zasadniczego odczynu przeprowadza się na drugim (sąsiednim)

skrawku kontrolne trawienie enzymatyczne roztworem diastazy swoiście rozkładającej tylko glikogen.

LIPIDY

Technika parafinowa, w której stosuje się utrwalacze bądź płyny pośrednie będące „naturalnymi

rozpuszczalnikami" dla tłuszczów (alkohole, benzen, ksylen itp.) nie stosuje się prawie zupełnie. Ze stosowanych

metod histochemicznych na lipidy najczęściej używanymi w praktyce są metody oparte o tzw. barwniki

Iipidowe, do których należy Sudan (II, III, IV, Black B) i czerwień oleista (Oil Red O) barwiące przede wszystkim

lipidy zapachowe metaboliczne. Spośród innych metod histochemicznych na lipidy należy również wymienić

barwienie z użyciem Błękitu Nilu oraz barwienie czterotlenkiem osmu (OsO ). Metoda z czterotlenkiem osmu

4

jest szczególnie przydatna do orientacyjnego rozróżnienia lipidów w mikroskopie elektronowym, gdzie związek

ten jest jednocześnie często stosowanym utrwalaczem.

Specjalne techniki badawcze - Węglowodany i Lipidy:

- Reakcja p.a.S.- wykrywa obojętne wielocukry zawierające pierścień heksozowy.

W pierwszym etapie materiał poddaje się utlenianiu w kwasie nadjodowym co prowadzi do przekształcenia

grup glikolowych w aldehydowe, a następnie grupy aldehydowe uwidacznia się odczynnikiem Schiffa.

- Barwienie Sudanem III - ujawnia lipidy. Podstawą tej reakcji jest niska rozpuszczalność barwnika w wodzie

natomiast wysoka w tłuszczach. Podstawą tej reakcji są głównie właściwości fizyczne barwnika a nie chemiczne.

Specjalne techniki badawcze - Kwasy Nukleinowe:

- Reakcja Feulgena - jest to dwuetapowa reakcja służąca do wykrywania DNA. W pierwszym etapie tkanki

poddaje się hydrolizie w 1M kwasie solnym co powoduje pęknięcie pierścienia pentozowego deoksyrybozy

i wytworzenie grupy aldehydowej. W drugim etapie powstałe grupy aldehydowe uwidaczniają się odczynnikiem

Schiffa.

- Metoda Bracheta - służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale za pomocą

mieszaniny zieleni metylenowej (DNA) i pironiny (RNA). Efektem reakcji jest zabarwienie jąderka na czerwono

i zielonofioletowa chromatyna jądrowa.

BADANIE CYTOENZYMOLOGICZNE

Reakcje histochemiczne przeprowadza się na skrawkach kriostatowych lub parafinowych, rzadziej na

niewielkich fragmentach tkanek (głównie w technice cytochemicznej i do mikroskopowania elektronowego),

skrawki poddaje się inkubacji w środowisku zawierającym odczynnik reagujący wybiórczo z poszukiwaną

substancją. Ostateczny produkt reakcji, w celu uwidocznienia go w tkance, musi być nierozpuszczalny i barwny,

lub elektronowo gęsty, w przypadku oglądania materiału w mikroskopie elektronowym.

Reakcja histoenzymatyczna prosta:

substrat»»enzym»»produkt barwny

Reakcja enzymatyczna złożona (metoda jonowymienników chemicznych):

substrat»»enzym»»produkt»»reakcja wiązania»»barwnik

5

made by Wój

Reakcja histoenzymatyczna powinna:

- Być reakcją szybką aby uniknąć błędów wywołanych dyfuzją produktów.

- Dawać - jako produkt niekrystaliczny - drobnoziarnisty strąt.

Wytworzony strąt nie powinien rozpuszczać się w płynie inkubacyjnym oraz wykazywać możliwie duży molowy

współczynnik ekstynkcji aby zapewnić wysokie nasilone barwy. Ilość powstającego strątu powinna być możliwie

ściśle skorelowana z aktywnością badanego enzymu.

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE - REAKCJA GOMORIEGO

Reakcja Gomoriego (reakcja precypitacji z kationami metali), służy do wykrywania hydrolaz.

1. Reakcja polega na wstępnym rozszczepieniu substratu przez wykrywany w tkankach enzym.

2. Następnie po wytrąceniu jednej ze składowych rozszczepionego substratu jonami metali (Ca2+, Pb2+, Cu2+,

Ba2+, Co2+)

3. Powstaje nierozpuszczalna sól.

4. Większość z tych soli jest widoczna w mikroskopie elektronowym, natomiast do celów mikroskopii

świetlnej czasami należy przeprowadzić dodatkową reakcje barwną.

Fosfataza zasadowa Fosfataza kwaśna

Tkanka (enzym) + substrat (glicerofosforan)

Bufor weronalowy Bufor octanowy

pH 9,2 – 9,4 pH 5,0 – 5,3

Ca2+

Pb2+

Mg2+ (aktywator)

Hydroliza

CaHP0 - Strąty niewidoczne - PbHP0

4

4

Co2+

(sole

kobaltu)

CoHP0

4

----- (NH ) S -----

4 2

x

(wielosiarczek amonu)

CoS PbS

(czarne) ------------ barwne strąty --------------- (brązowe)

w miejscach aktywności

odpowiedniego enzymu

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE – TPP-AZA, DB, FK

1. Tiaminowa pirofosfataza (marker struktury Golgiego) - odczyn „kontrastuje" układ cystern i wakuoli, który

jest intensywny w komórkach wydzielniczych i nerwowych. W miejscu lokalizacji enzymu stwierdza się

intensywne czarne strąty siarczku ołowiu.

2. Dehydrogenaza burszvnianowa - marker wewnętrznej błony mitochondrialnej. DB odcina od substratu (soli

sodowej kwasu bursztynowego) atomy wodoru, które następnie łączą się z solą tetrazolową Nitro TB dając

barwne złogi formazanu.

3. Fosfataza kwaśna - marker lizosomów. W komórkach wątroby lizosomy układają się głównie w biegunach

żółciowych.

6

made by Wój

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: IMMUNOHISTOCHEMIA

Jest to metoda badawcza polegająca na wykrywaniu w komórkach i tkankach substancji o charakterze

antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał.

Antygen - jest to substancja zdolna do wywołania produkcji swoistych przeciwciał przez system immunologiczny

organizmu (immunogenność) i zdolna do swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i tworzenia z nimi

kompleksów (antygenowość).

Przeciwciało - białko należące do klasy immunoglobulin wytwarzane przez system immunologiczny i mające

zdolność do swoistego wiązania antygenu. Przeciwciała mogą być poliklonalne i monoklonalne. Przeciwciało

znakuje się fluorochromami enzymatycznie, ferrytyną lub złotem koloidalnym.

Podstawowe typy reakcji immunohistochemicznych:

- bezpośrednia (antygen-znakowane przeciwciało),

-pośrednia (antygen- nie znakowane przeciwciało - znakowana antyglobulina)

-z mostkami immunoglobulinowymi i kompleksami enzym - antyenzym (antygen – przeciwciało – antyglobulina

- kompleks enzym/antyenzym).

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: AUTORADIOGRAFIA

Autoradiografia jest metodą badawczą umożliwiającą lokalizację izotopów promieniotwórczych lub

znakowanych nimi substancji w komórkach lub tkankach. Podana In vivo substancje promieniotwórcze (3H, 14C,

82P, 131J) zostają włączone w normalny ciąg procesów metabolicznych. Po przygotowaniu preparatu

mikroskopowego w sposób typowy pokrywa się je żelem zawierającym AgBr. Promieniowanie powoduje rozpad

tej soli i pojawienie się metalicznego srebra, które po wywołaniu i utrwaleniu można obserwować

w mikroskopie.

Metoda ta pozwala na śledzenie dynamiki procesów metabolicznych w komórkach i tkankach.

SPECJALNE TECHNIKI BADAWCZE: CYTOFOTOMETRIA PRZEPŁYWOWA

Jest to technika pomiarów właściwości fizycznych i chemicznych komórek z zastosowaniem przyrządu, który

w krótkim czasie (paru minut) może przebadać dużą populację komórek, liczoną w milionach. Badane komórki

muszą być zawieszone w płynnym środowisku jako zawiesina oddzielnych komórek. Komórki używane do tych

badań są uprzednio zabarwione, barwnikami fluorescencyjnymi. Istnieje cała grupa odczynników

fluorescencyjnych, które swoiście wiążą się z takimi składnikami komórki jak DNA czy RNA, czy powierzchnia

komórki.

W chwili przepływu przez rejon pomiaru komórka przechodzi przez wąski promień światła (zazwyczaj lasera

argonowego), który:

- ulega rozproszeniu zależnemu od wielkości, kształtu lub właściwości optycznych komórki,

- wzbudza fluorescencję substancji chemicznych, którymi komórka była uprzednio znakowana.

Odczyty w każdej komórce są następnie liczone i analizowane statystycznie przez komputer.

Metoda ta pozwala na przebadanie w krótkim czasie wielu parametrów, bada duża liczbę komórek.

MIKROCHIRURGIA

Zabiegi mikrochirurgiczne polegają na wykonaniu zabiegów na pojedynczych komórkach pod kontrolą

mikroskopu. Narzędziami są mikroigły, mikroskalpele i mikropipety wykonywane w mikrokuźni. Przyrządy te

poruszane są za pomocą mikromanipulatora, który tak redukuje zakres ruchów ręki, że narzędzia można

prowadzić w polu widzenia mikroskopu.

Dzięki zastosowaniu tej techniki można usuwać z komórki jądra, można też wprowadzić w miejsce usuniętego

jądra komórkowego inne, pochodzące z innej komórki. Przekonano się tą metodą, że jądro zróżnicowanej

komórki nabłonka jelita wprowadzone do komórki jajowej, po pobudzeniu jej do rozwoju, może dać początek

całemu normalnemu organizmowi.

Mikromanipulatorem można wprowadzać substancje wstrzykując je bezpośrednio do komórki i omijając ich

działanie na receptory błonowe komórki.

Narzędziem mikromanipulatora może być skoncentrowana wiązka promieniowania UV lub promieniowania

laserowego. Za pomocą wiązek światła można selektywnie niszczyć w komórce wybrane obszary komórki lub jej

narządy.

HODOWLA CYTO-, HISTO- I ORGANOTYPOWA

Hodowla jest to utrzymanie oddzielonych od organizmu komórek, tkanek a nawet narządów w warunkach

sztucznych (In vitro) przez okres dłuższy niż 24 godziny.

7

made by Wój

Inkubacja - jw. poniżej 24 godzin.

Hodowlę prowadzi się na pożywkach (naturalnych lub sztucznych). Komórkę lub tkankę można hodować albo

przez zanurzenie całkowite w pożywce albo przez jej powierzchni.

Wyróżniamy:

- hodowlę komórek (nie wytwarzających wyżej zorganizowanych struktur): w kilkunastu przypadkach na świecie

prowadzi się hodowle komórek jajowych kobiet – doprowadza In vitro do zapłodnienia, hoduje się zarodek

ludzki ok. 43 godziny i po uzyskaniu stadium poprzedzającego wszczepienie zarodka do błony śluzowej

(endometrium) wprowadza się do macicy. Zabiegi te wykonywane są ze wskazań lekarskich i powtarzane, aż do

uzyskania ciąży.

- hodowlę tkanek

- hodowlę organotypową (zarówno embrionalnych zawiązków narządów lub całych bądź fragmentów narządów

pobranych z dojrzałego organizmu.

ILOŚCIOWA ANALIZA OBRAZÓW MIKROSKOPOWYCH:

Jest to zobiektywizowany opis obrazów mikroskopowych zarówno z mikroskopów świetlnych jak

i elektronowych czyli techniki pomiarowe, które pozwalają na numeryczny opis obrazów mikroskopowych,

a następnie na ocenę tych pomiarów metodami statystycznymi.

LIZOSOMY

Oznacznikami (markerami) enzymatycznymi dla lizosomów (zaliczanych do organelli komórkowych) są

następujące enzymy: fosfataza kwaśna, rybonukleaza, dezoksyrybonukleaza II, katepsyny i beta – glikuronidaza

Wszystkie te enzymy wykrywane są w lizosomach tak metodami biochemicznymi jak i histochemicznymi.

APARAT GOLGIEGO

Enzymatycznym markerem dla aparatu Golgiego jest tiaminowa pirofosfataza. Wykrywanie odczynu

histochemicznego na ten enzym tak dokładnie „konturuje” układ beleczek i wakuoli aparatu Golgiego, że

z powodzeniem zastąpić może dotychczas stosowane wybarwienie tej organelli metodami histologicznymi

opartymi na srebrzeniu.

CHONDRIOM KOMÓRKOWY

Enzymatycznym markerem dla chondriomu komórkowego biorącego (ze względu właśnie na enzymy w nim

zawarte) bezpośredni udział w procesach oksydoredukcyjnych i w tlenowej fosforylacji są odpowiednio

dehydrogenaza kwasu bursztynowego i adenozynotrójfosfataza mitochondrialna.

Teoretycznie, oznacznikami enzymatycznymi dla tej organelli mogą być prawie wszystkie enzymy biorące udział

w tych przemianach (m.in. prawie wszystkie enzymy wchodzące w tzw. cykl Krebsa), praktycznie metodami

histochemicznymi wykrywane jest kilkanaście, a wśród nich najczęściej w tym celu stosowane są właśnie

metody na wyżej wymienione enzymy.

Podstawa odczynu histochemicznego metody Nachlasa i współpracownika na dehydrogenazę kwasu

bursztynowego jest odłączenie przez enzym (dehydrogenazę) z substratu (sól sodowa kwasu bursztynowego)

dwóch atomów wodoru, które łączą się z solą tetrazolową Nitro BT dają produkt końcowy w postaci barwnych

złogów formazanu w miejscach występowania (aktywności) tego enzymu.

„Konturowanie" chondriomu komórkowego przez dehydrogenazę jest wyjątkowo precyzyjne ze względu na

umiejscowienie enzymu na błonach bądź w samych błonach tej organelli.

Istnieją tez możliwości barwienia mitochondriów zielenią Janusową lub hematoksyliną żelazistą.

8