Biohydrometalurgia - laboratorium
Ćwiczenie nr 1.
Przygotowanie krzywej wzorcowej do określania stężenia białka w roztworach.
Metoda Lowry’ego.
Wstęp teoretyczny
Metoda Lowry’ego (Lowry i in., 1951) jest wykorzystywana do oznaczania całkowitej ilości białka w badanej próbce. Polega na barwnej reakcji białka z jonami miedzi, w warunkach alkalicznych. Końcowa barwa (niebiesko-fioletowa) roztworu jest wynikiem dwóch reakcji:
a) biuretowej, w której wiązania peptydowe białek reagują z jonami miedzi w warunkach alkalicznych, tworząc jony Cu+; b) jonów miedzi Cu+ z odczynnikiem Folina i Ciocalteua, w wyniku czego następuje redukcja odczynnika fosfomolibdenowolframowego do błękitu molibdenowego przez obecne w białku tyrozynę i tryptofan.
Czułość metody: 0,01-1,0 mg białka/mL.
Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej standardowej stężenia albuminy wołowej w roztworze. Wykres ten pozwoli na wyznaczenie stężenia białka w próbkach jakie otrzymamy w trakcie kolejnych ćwiczeń.
Odczynniki i roztwory
1) Roztwór roboczy Folina-Ciocalteu
2) Odczynnik Lowry’ego
3) Standard białka
Jeśli roztwory nie są przygotowane, proszę postępować wg poniższej instrukcji:
3) Roztwór roboczy Folina i Ciocalteua: należy odmierzyć 18 mL odczynnika Folina i Ciocalteua, przenieść do butelki z ciemnego szkła, następnie dodać 90 mL wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać.
4) Odczynnik Lowry’ego: do butelki z odczynnikiem (proszek) dodać 40 ml wody dejonizowanej. Delikatnie wymieszać, tak aby nie powstało zbyt dużo piany.
5) Standard białka 400 µg/mL: do buteleczki z albuminą wołową dodać 5 mL wody dejonizowanej i dobrze wymieszać.
Wykonanie
W probówkach należy sporządzić wodne roztwory białka, wg Tabeli 1. Próbki dobrze wymieszać przy pomocy urządzenia typu vortex. Następnie do 1 ml przygotowanego wodnego roztworu białka dodać 1 ml odczynnika Lowry’ego, wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu dodać 0,5 ml roztworu roboczego fenolowego odczynnika Folina i Ciocalteua. Dobrze wymieszać (vortex). Próby pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie przenieść roztwory do kuwet i odczytać absorbancję przy 750 nm względem próby kontrolnej, jako odnośnika.
Należy pamiętać o jednoczesnym przygotowaniu próby kontrolnej, w której zamiast roztworu białka stosuje się wodę dejonizowaną (1 mL) oraz te same odczynniki i procedurę, co w pozostałych próbach.
Tabela 1.
Standard białka [mL]
Woda [mL]
Stężenie białka [µg/mL]
0,125
0,875
50
0,250
0,750
100
0,500
0,500
200
0,750
0,250
300
1,000
0
400
Z uzyskanych danych należy wykreślić krzywą zależności Absorbancja = f (stężenie białka).
A. Pawłowska 2011