Ćwiczenie: Mikrobiologiczne badania ilościowe
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda tamponowa:
Stosowana do oceny zanieczyszczenia mikrobiologicznego duŜych powierzchni:
kadzie fermentacyjne,
beczki,
kontenery
oraz powierzchni wewnętrznych:
przewodów, zaworów, uszczelek.
Materiał pobiera się przecierając jałowym tamponem z waty lub gazy
powierzchnię przeznaczoną do badania, tampony do probówki z jałowym płynem, dokładne wytrząsanie, zawiesina z materiałem wysiewana na odpowiednie
podłoŜe.
Pobieranie materiału z powierzchni płaskich: jałowy szablon np. z drutu lub blachy w postaci kwadratu/ prostokąta o znanej powierzchni (25 lub 100 cm2).
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda wypłukiwania:
Do oceny czystości opakowań szklanych lub metalowych.
Wewnętrzne powierzchnie naczynia opłukuje się przez wytrząsanie określoną
ilością jałowego płynu fizjologicznego lub wody destylowanej. Zawiesina do
dalszych badań.
Pobór materiału i przygotowanie do posiewu -Metoda odciskowa:
Stosowana przy ocenie czystości materiałów opakowaniowych, korków, wieczek
lub innych małych powierzchni.
Badany materiał przyciska się do powierzchni zestalonego podłoŜa agarowego.
Po określonym okresie inkubacji w odpowiedniej temperaturze określa się
obecność kolonii mikroorganizmów.
Kontrola powierzchni moŜe być wykonywana specjalnymi przyrządami:
Płytki kontaktowe z podłoŜem stałym, np. RODAC, Envirocheck
Plastikowe ramki wypełnione podłoŜem stałym, np. Hygicult, Envirocheck
Pobieranie próbek Ŝywności do badań
Pobieranie płynów:
Soki, mleko, wodę itp. - jałową pipetą do jałowej butelki, kolbki lub
probówki
w ilości ¾ objętości naczynia
szczelnie zakorkować.
przed posiewem dokładnie wytrząsnąć próbkę
Pobieranie past
Galaretki, przeciery, pasztety itp.- jałową łopatką w ilości 20 – 50 g
do wyjałowionej i wytarowanej kolbki o pojemności 200 cm3
rozcieńczyć przed posiewem określoną ilością rozcieńczalnika
(rozcieńczenie 1 : 10 lub 1 : 100).
Pobieranie produktów o konsystencji stałej
Mięso, wędliny, podroby, sery itp.-jałowym skalpelem i wyjałowioną
pincetą ok. 200 g próbki
osobno z warstw powierzchniowych i z głębszych
wycinki do płytek Petriego lub kolbek z korkiem.
Pobrać próbkę (na ogół o masie 10, 20 lub 25 g) i zhomogenizować
dodać do 90 lub 180 g jałowego rozcieńczalnika (rozcieńczenie 1 : 10), a
następnie przygotować do posiewu
Posiew ilościowy
1. Przygotowanie kolejnych rozcieńczeń.
OdwaŜyć lub odmierzyć określoną ilość produktu (np. 1 g lub 1 cm3; 10 g),
rozdrobnić
umieścić w naczyniu i zalać 9 lub 90 cm3 roztworu rozcieńczalnika.
wymieszać- uzyskuje się rozcieńczenie wyjściowe 10-1 (1:10).
Kolejne rozcieńczenie 10-2 (1:100) sporządza się przenosząc 1 cm3
zawiesiny do kolejnej probówki z 9 cm3 rozcieńczalnika.
2.Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów metodą zalewową:
Na dwie płytki Petriego przenieść po 1 ml z badanego rozcieńczenia (np.
10-1)
Na dwie kolejne płytki przenieść po 1 ml z kolejnego rozcieńczenia, itd., itp.
Płytki zalać upłynnioną, schłodzoną do ok. 45oC poŜywką (np. agar
odŜywczy).
Wymieszać i pozostawić do zestalenia.
Po zestaleniu inkubować obrócone do góry dnem w temp. 30oC przez 72
godz.
3. Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów metodą posiewu
powierzchniowego:
Na gotowe płytki z zastygłym podłoŜem agarowym przenieść po 0,1 ml z
odpowiedniego rozcieńczenia
Rozprowadzić równomiernie po powierzchni jałową, szklaną bagietką
Wstawić do cieplarki i inkubować j.w.
4. Obliczanie ogólnej liczby drobnoustrojów:
Do liczenia wybrać płytki, na których nie więcej niŜ 300 kolonii
Z dwóch rozcieńczeń następujących po sobie
Przynajmniej jedna z 4 płytek powinna zawierać nie mniej niŜ 15 kolonii
Wzór:
ΣC
L = (n + 0,1n ) d
1
2
ΣC- suma kolonii na wszystkich płytkach wybranych do liczenia
n1 – liczba płytek brana pod uwagę przy niŜszym rozcieńczeniu
n2 - liczba płytek brana pod uwagę przy niŜszym rozcieńczeniu
d- wskaźnik rozcieńczenia odpowiadający pierwszemu (niŜszemu) rozcieńczeniu Otrzymaną liczbę zaokrąglić do 2 cyfr znaczących.
Wynik powinien być wyraŜony jako liczba pomiędzy 1,0 a 9,9 pomnoŜona przez
10x, gdzie x jest wykładnikiem potęgi.
Jeśli na płytkach wyrosło mniej niŜ 15 kolonii naleŜy obliczyć średnią
arytmetyczną z liczby kolonii i podać wynik:
- dla liczby bakterii w 1 ml:
L1= m
- dla liczby bakterii w 1 g:
L2=m x 1/d
m= średnia arytmetyczna liczby kolonii
d-stopień rozcieńczenia wyjściowej zawiesiny (10-1)
Jeśli dwie płytki posiane bezpośrednio z wyjściowej zawiesiny nie zawierają w ogóle Ŝadnej kolonii to ynik podać jako:
mniej niŜ 1 drobnoustrój w 1 ml (dla płynnej próbki)
mniej niŜ 10 drobnoustrojów w 1 g (dla stałej próbki)
Oznaczanie najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojów (NPL)
Metoda statystyczna
Próba 5 lub 3 probówkowa
Przygotować 3 rzędy po 5 lub po 3 probówki w kaŜdym
Do pierwszego rzędu posiać do kaŜdej probówki po 10 ml z podstawowego
rozcieńczenia, do następnego po 1 ml a do ostatniego po 0,1 ml
Po inkubacji ocenić w ilu probówkach z kaŜdego rzędu jest wzrost
NPL drobnoustrojów w 100 ml/ g próbki odczytuje się ze specjalnych tabel
Sosowane do oznaczania tylko niektórych grup bakterii, które występują w
badanej Ŝywności w niewielkich ilościach lub takich drobnoustrojów,
których hodowla metodą płytkową jest niemoŜliwa lub utrudniona.
Najczęściej oznaczenie pałeczek grupy coli, E. coli, bakterii beztlenowych, itp
Stosuje się poŜywkę selektywną,
Zasada oznaczania:
Posiew próbki i jej kilku (minimum trzech kolejnych) rozcieńczeń do
poŜywek selektywnych w próbówkach, w trzech równoległych
powtórzeniach.
Inkubacja.
Po inkubacji dla kaŜdego posianego rozcieńczenia zapisuje się liczbę prób dodatnich (w których stwierdzono objawy wzrostu bakterii);
do odczytu wybiera się 3 kolejne rozcieńczenia;
z zapisanych dla nich sekwencji trzech liczb (próby dodatnie) odczytuje się ze specjalnych tabel wskaźnik NPL, którego wartość mnoŜy się przez:
współczynnik pierwszego z 3 rozcieńczeń wybranych do odczytu – w ten
sposób uzyskuje się artość NPL w 1 cm3 lub 1 g.
Oznaczanie liczby drobnoustrojów metodą sączenia przez filtr membranowy:
Dla prób o niewielkiej liczbie drobnoustrojów (np. napoje, woda
wodociągowa)
przesączenie badanej próbki (np. objętości 100 cm3) przez sączek
membranowy,
połoŜenie sączka na podłoŜu stałym
inkubacja
policzenie kolonii wyrosłych na powierzchni sączka.
Oznaczanie miana drobnoustrojów:
Miano jest to najmniejsza objętość badanego materiału, w którym znajduje
się przynajmniej jedna Ŝywa komórka badanej bakterii.
Oznaczenie miana słuŜy do określenia stopnia zanieczyszczenia badanego
materiału.
Miano coli ( miano pałeczek okręŜnicy) to najmniejsza objętość badanego
materiału, w której stwierdza się jeszcze obecność E. coli
Określanie miana coli świadczy o zanieczyszczeniu Ŝywności kałem.
Badanie wykorzystuje właściwość fermentacji laktozy z wytworzeniem
kwasu i gazu w temperaturze 44°C.
Pobraną próbkę rozcieńcza się w poŜywce zawierającej laktozę (jako
substrat) i zieleń brylantynową (jako wskaźnik kwasowości).
Oznaczenie przeprowadza się w probówkach z rurkami Durhama (małe
probówki słuŜące do łapania wydzielanego gazu).
Po dobowej inkubacji moŜna odczytywać wyniki.
Bioluminescencja- pomiar ATP:
Termin bioluminescencja pochodzi od greckiego słowa „bios” –Ŝycie i
łacińskiego słowa „lumen” – światło.
Metoda oparta jest na wykrywaniu ATP (adenozyno-trójfosforan).
ATP występuje we wszystkich Ŝywych komórkach, gdzie pełni funkcję
nośnika energii
Podczas hydrolizy ATP wydzielana jest duŜa ilość energii swobodnej, która mierzona jako emisja kwantów światła wydzielanych w czasie reakcji.
Zjawisko to chemiluminescencja, której szczególnym przypadkiem jest
bioluminescencja
Bioluminescencja to proces enzymatyczny,
następuje utlenienie lucyferyny przy udziale enzymu lucyferazy w
obecności jonów magnezu.
Reakcji towarzyszy impuls świetlny, którego natęŜenie jest skorelowane z
ilością ATP.
Zjawisko zostało wykorzystane do kontroli stanu higienicznego linii
produkcyjnych i urządzeń technologicznych -kontrola skuteczności
procesu mycia i dezynfekcji.
pozwala na jednoznaczne stwierdzenie obecności Ŝywych komórek na
badanych powierzchniach
Wysoki poziom ATP wskazuje na niską skuteczność procesu mycia i
dezynfekcji