Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi ( Cu+2 ) tworzą dwa wiązania atomami
tlenu grup enolowych oraz cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu
Białka
(rys.2.). Powstały kompleks ma barwę fioletową.
Wykonanie: Do 1 ml 15-krotnie rozcieńczonego roztworem soli fizjologicznej
2.1. Wykrywanie wiązania peptydowego - reakcja biuretowa (Piotrowskiego)
białka jaja kurzego dodać 1 ml 10% NaOH i 20 µl 2% CuSO4. Pojawia się barwa
fioletowa. Doświadczenie porównawcze wykonać z 1% roztworem aminokwasu.
Zasada: Reakcja biuretowa jest charakterystyczna dla wiazań peptydowych przy
czym dają ją zwiazki posiadające w cząsteczce co najmniej dwa takie wiązania.
2.2. Wysalanie i odsalanie białek
Nazwa metody pochodzi od biuretu (dwumocznika), który jest najprostszym
związkiem spełniającym wymieniony wyżej warunek. W środowisku zasadowym
Zasada: Rozpuszczalność białek w wodzie jest określona głównie przez ich
zachodzi tautomeryzacja wiązania peptydowego z utworzeniem formy enolowej
zdolność do hydratacji. Zjawisko to polega na wiązaniu dipoli wodnych z grupami
(rys.1).
polarnymi białka, dzięki czemu cząsteczka białka otacza się płaszczem wodnym.
Obecność niewielkich stężeń soli wpływa dodatnio na rozpuszczalność białek,
natomiast wzrost stężenia soli powoduje wypadanie białek z roztworu - zjawisko
to nosi nazwę "wysalania białka". Działanie wysalające dużych stężeń jonów
polega na ich znacznie większym oddziaływaniu na cząsteczki wody w
rys.1.
porównaniu z siłami wywołującymi uwodnienie cząsteczki białka. Do wysalania
białek używa się soli, które łatwo tworzą wodziany. Sole takie, mające możność
wiązania wody konkurując z białkiem o cząsteczki wody, odbierają cząsteczkom
białek płaszcz wodny, co obniża ich rozpuszczalność i prowadzi do wytracąnia z
roztworu. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym - dodanie czystego
rozpusczalnika powoduje ponowne rozpuszczenie białka. Stężenie soli potrzebne
do wysolenia białka zależy od właściwości danego białka i od pH środowiska.
Białko najłatwiej wysolić w punkcie izoelektrycznym. Różne białka wymagają do
wysolenia różnych stężeń soli i właściwość ta jest wykorzystywana do
frakcjonowania mieszanin białkowych np: białek osocza. Przy 25 % nasyceniu
siarczanem amonu z osocza wysala się fibrynogen, przy nasyceniu 50%
(NH4)2SO4 wysoleniu ulega większość globulin, a do wysolenia albumin i
niektórych dobrze rozpuszczalnych glikoprotein wymagane jest 80% nasycenia
siarczanem amonu.
Wykonanie: Do 3 szklanych probówek nalać po 1,5 ml 33.3% (v/v) roztworu
białka jaja kurzego. Do pierwszej probówki dodać 0,5 ml nasyconego roztworu
siarczanu amonu uzyskując w ten sposób końcowe nasycenie równe 25%, do
drugiej 1,5 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu (końcowe nasycenie 50%),
a do trzeciej 1,5 ml roztworu siarczanu amonu oraz 0,67 g siarczanu amonu in
subst. (końcowe nasycenie 80%). Zawartość drugiej probówki odwirować
rys.2
(wirówka K-24, 10 min, 12 000obr/min). Osad białka zawiesić w 3 ml nasyconego
2.1
roztworu siarczanu amonu i dializować do 2 l soli fizjologicznej (lub wody
próbki taką samą ilość wody dolać po 30 min. Takie samo doświadczenie wykonać
destylowanej). Zaobserwować ponowne rozpuszczanie się białek.
z użyciem 100% acetonu.
2.3. Denaturacja białek
Struktura łańcuchów polipeptydowych w białkach jest stabilizowana poprzez
2.3.3. Działanie kationów i anionów
różnorodne wiązania niekowalencyjne. Do wiązań tych zaliczamy wiązania
Zasada: Białka są substancjami amfoterycznymi. W pH wyższym od punktu
wodorowe, jonowe, oddziaływania hydrofobowe, oddziaływania typu dipol-dipol.
izoelektrycznego białka posiadają ładunek ujemny i mogą reagować z kationami.
Zniszczenie tych wiązań prowadzi do zmiany przestrzennej struktury łańcuchów
Kationy metali alkalicznych tworzą sole dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w
polipeptydowych; proces ten nazywa się denaturacją. W wyniku zniszczenia
wodzie, natomiast kationy metali ciężkich (Pb+ ,Cu+2, Fe+3) dają sole trudno
wiązań stabilizujących strukturę przestrzenną białek, łancuchy polipeptydowe
rozpuszczalne.
przyjmują w roztworze inną konformację a uwolnione grupy funkcyjne
aminokwasów mogą wytworzyć nowe wiązania. Ponieważ różnorodne czynniki
Wykonanie: Do 2 probówek zawierających po 1ml roztworu białka dodać parę
denaturujące wpływają na zerwanie różnych typów wiązań stabilizujących
kropel 2% Pb(CH3COO)2 lub CuSO4.
strukturę białek , dlatego też mechanizm denaturacji może być różny dla różnych
czynników denaturujących. Zdenaturowane białko może nie ulegać wytrąceniu z
Odczynniki: białko jaja kurzego lub inny roztwór białka, 1%roztwór dowolnego
roztworu wówczas, gdy znajduje się w środowisku o pH różnym od jego punktu
aminokwasu, sól fizjologiczna, 10% roztwór NaOH, nasycony roztwór siarczanu
izoelektrycznego.
amonu, siarczan amonu in subst. , 0.9% roztwór NaCl, 5% kwas octowy, NaCl lub
MgSO4 in subst., etanol 95%, aceton 100%, 2% roztwory Pb(CH3COO)2 i
2.3.1. Denaturacja cieplna w punkcie izolektrycznym.
CuSO4.
Zasada: Pod wpływem wzrostu temperatury zwiększają się drgania atomów
połączonych wiązaniami wodorowymi, wskutek czego ulegają one rozerwaniu.
Zakwaszenie roztworu przesuwa stężenie jonów wodorowych do pH
odpowiadającego punktowi izoelektrycznemu białka.
Wykonanie: Do 1 ml 6,7% roztworu białka dodać kroplę roztworu kwasu
octowego i ogrzać do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty osad, który staje się
wyraźny po dodaniu niewielkiej ilości NaCl lub MgS04.
2.3.2. Działanie alkoholu etylowego lub acetonu
Zasada: Rozpuszczalniki organiczne obniżają stałą dielektryczną wody, osłabiają
wiązania hydrofobowe i dezorganizują płaszcz wodny cząsteczek białka.
Krótkotrwałe działanie etanolu powoduje wytrącenie białka, nie denaturując go.
Denaturacja zachodzi przy wyższych stężeniach i dłuższym czasie działania
alkoholu.
Wykonanie: W dwóch probówkach do 1 ml 6.7% roztworu białka dodać 100 µl
95 % alkoholu etylowego (ilość dodawanego etanolu skonsultować z
prowadzącym ćwiczenia). Do jednej próbki natychmiast po obserwacji wytrącenia
się osadu dolać dużą ilość wody, zaobserwować zachowanie się osadu. Do.drugiej
2.2