Biotechnologiczne metody
wytwarzania substancji biologicznie
czynnych stosowanych w
kosmetykach
Plan wykładu
1. Wstęp
2. Produkcja wybranych substancji w kulturach
bakteryjnych i roślinnych
3. Podstawy in\
ynierii bioprocesowej
4. Pozyskiwanie mikroorganizmów
Czym jest biotechnologia...?
Połączenie wiedzy i umiejętności z zakresu:
biologii
chemii
fizyki
matematyki
informatyki,
umo\
liwiające wykorzystanie organizmów lub ich
metabolitów do procesów diagnostyczno-produkcyjnych
Biotechnologia przemysłowa
to nowoczesne zastosowanie biotechnologii do
zrównowa\
onego przetwarzania i produkcji substancji
chemicznych
wykorzystuje mikroorganizmy i enzymy do
wytwarzania surowców farmaceutycznych,
spo\
ywczych, tworzyw sztucznych
Co ma wspólnego biotechnologia
z kosmetologiÄ…...?
Niektóre składniki kosmetyków pozyskiwane są z
udziałem komórek organizmów
roślinnych
zwierzęcych
mikroorganizmów (bakterie, wirusy, grzyby)
Najczęściej stosowanymi  producentami są
komórki bakteryjne oraz roślinne kultury
komórkowe i tkankowe
Co wytwarzajÄ… bakterie...
Białka
Aminokwasy
Witaminy
Witaminy
Polisacha-
Alkohole
rydy
...a co rośliny...?
Terpenoidy
Alkaloidy
ZwiÄ…zki
Barwniki
fenolowe
Przeciw-
utleniacze
Strategie biosyntezy substancji
z wykorzystaniem roślin
Biosynteza
Biosynteza de novo Biosynteza w
Biotransformacje (kultury komórkowe warunkach
i tkankowe) naturalnych
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(MONOTERPENY)
są składnikami naturalnych olejków roślinnych
wykazują działanie antyseptyczne, rozgrzewające
zastosowanie: w aromaterapii, składniki kompozycji
zapachowych, perfum
przykłady:
mentol (zapach mięty)
citronelol (ró\
any)
eugenol (goz
dzikowy)
geraniol (bodziszkowy)
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(MONOTERPENY)
Monoterpeny
Acykliczne Monocykliczne Dicykliczne Aromatyczne
gerniol mentol
eugenol
nerol menton borneol
izoeugenol
citral pulegon
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(MONOTERPENY)
Najczęściej stosowana strategia: biotransformacja
Roślina
Substraty Produkty
metabolizujÄ…ca
Kultura zawiesinowa
Citronelol, geraniol,
geraniol, citronelal
nerol
R. centifolia neral, tlenki terpenowe
(intensywny zapach)
(olejek ró\
any)
(ró\
a stulistna)
Kultura zawiesinowa
p-cymen, tymol,
Gamma-terpin T. vulgaris
p-cymen
(tymianek)
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(MONOTERPENY)
Biotransformacja gamma-cymenu w kulturze in vitro
Thymus vulgaris
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(ZWI
ZKI FENOLOWE)
Zastosowanie:
uszczelniające naczynia krwionośne (rutyna)
antyoksydacyjne (hydrochuinon, kwas kawowy)
rozjaśniające skórę (arbutyna)
aromatyzujÄ…ce (wanilina)
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(ZWI
ZKI FENOLOWE)
ZwiÄ…zki fenolowe
jednopierścieniowe dwupierścieniowe wielopierścieniowe
proste fenole,
pochodne flawonoidy garbniki
fenylopropanu
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(ZWI
ZKI FENOLOWE)
Stosowana strategia: biotransformacja
Roślina
Substraty Produkty
metabolizujÄ…ca
Kultura zawiesinowa
Hydrochinon Datura innoxia arbutyna
Bieluń indiański
Kultura immobilizowana
Kwas felurowy wanilina
C. frutescens
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(ZWI
ZKI FENOLOWE)
Biotransformacja kwasu felurowego i waniliny
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(BARWNIKI)
Zastosowanie:
jako substancje barwiÄ…ce preparaty kosmetyczne (szikonina-
barwienie szminek do ust),
antyoksydanty (likopen, karoteny),
regenerujące naskórek (karotenoidy - prekursory wit. A)
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(BARWNIKI)
Barwniki
roślinne
Antocyjany Flawony Karotenoidy Chinony
Glukozydy:
apigenina karoten
cyjanidyny
alizaryna
moreina ksantofile
malwidyny
szikonina
daidzeina likopen
pelargonidyny
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(BARWNIKI)
Warunki/uwagi
Produkt Roślina
(biosynteza de novo)
- kultura zawiesinowa
- bioreaktor typu air-lift
Daucus carota
Karotenoidy - logarytmiczna faza wzrostu
(marchew jadalna)
- system półciągły-wzrost syntezy 7,5
razy
Licopersicon - kultura zawiesinowa
Likopen esculentum - bioregulatory zwiększają syntezę 60
(pomidor) razy
Substancje pozyskiwane z udziałem
komórek roślinnych
(BARWNIKI)
Warunki/uwagi
Produkt Roślina
(biosynteza de novo)
- I barwnik wytwarzany przemysłowo
in vitro (Japonia 1983 r.)
Lithospermum
- system dwuokresowy
Szikonina erythrorhizon
- zastÄ…pienie kultury zawiesinowej
(nawrot)
korzeniami transformowanymi:
wydzielanie barwnika do po\
ywki
Perilla frutescens
(pachnotka zwycz.) - kultura zawiesinowa
Antocyjany
Vitis vinifera - wymagają światła
(winorośl)
Substancje pozyskiwane z udziałem
mikroorganizmów
(GLICEROL)
biosynteza z udziałem mikroorganizmów jest alternatywą dla
glicerolu pozyskiwanego na drodze syntezy chemicznej,
mikroorganizmy: S. cerevisiae (warunki beztlenowe, wydajność:
30  40 g/L),
stosując kontrolowane natlenianie w obecności CO2 wydajność
dochodzi do 230 g/L,
wady: powstawanie innych metabolitów (etanol, kwas octowy,
aldehyd octowy)
Substancje pozyskiwane z udziałem
mikroorganizmów
(Guma ksantanowa)
zastosowanie: jako środek konsystencjotwórczy (np. hydro\
ele)
mikroorganizm: Xanthomonas campestris
synteza 2-etapowa:
I biosynteza ksantanu (warunki tlenowe, glukoza lub sacharoza, składniki
mineralne, AA, NH4+, 25-34 oC, mieszanie)
II wydzielanie biopolimeru (zawartość ksantanu: 10-30 g/L, wymaga
sterylizacji cieczy poreakcyjnej, oddzielenie komórek, wytrącenie
biopolimeru alkoholami)
Substancje pozyskiwane z udziałem
mikroorganizmów
(WITAMINA A)
Podstawowy substrat: karotenoidy
Biosynteza karotenoidów z udziałem:
Rhodotorula gracialis (20-50 mg/kg s.m.)
Chlorophycea sp. (420-480 mg/kg s.m.)
Euglenophyceae sp. (800 mg/kg s.m.)
Blakslea trispora (3000 mg/L)
po\
ywka: skrobia, mÄ…ka sojowa, wyciÄ…g kukurydziany, olej
bawełniany, witaminy, sole mineralne
biomasa jest suszona i ekstrahowana
Substancje pozyskiwane z udziałem
mikroorganizmów
(BIOTYNA)
Biosynteza z udziałem: Bacillus sphericus IFO
Po\
ywka: glicerol (2%), pepton (1%), sole mineralne
Wydajność: 200 mg/L
Adsorpcja Desorpcja
Ciecz
Odwirowanie na węglu z węgla
pofermentacyjna
aktywnym EtOH/NH3 (aq)
Oczyszczanie Odparowanie
chromatograficzne rozpuszczalnika
Podstawy in\
ynierii
bioprocesowej
Biotechnologiczna linia produkcyjna
Przygotowanie mediów technicznych (media hodowalne,
1
powietrze woda, para wodna)
Etap hodowli mikroorganizmów w bioreaktorach
2
Procesy separacji (rozdział komórek od po\
ywki,
3
produktów od medium hodowlanego itp.)
Procesy oczyszczania produktu (wirowanie, chromato-
4
grafia, elektroforeza)
5
Koncentracja pozyskanego produktu, pakowanie
Przygotowanie mediów
technicznych
Procesy jednostkowe
w przygotowaniu mediów technicznych
Sterylizacja Sterylizacja Sterylizacja
po\
ywki powietrza aparatury
Metody sterylizacji
Parowa
Sucha (termiczna)
Mikrofiltracja
Radiacyjna
Sterylizacja
Tlenek etylenu
UV
Formaldehyd
Beta-propiolakton
Kinetyka zabijania
drobnoustrojów
Sterylizacja jest procesem I-rzędu
Nt = N0 exp (-Dt)
lnNt
Nt
t
t
Sterylizacja po\
ywek
Zmiany zachodzÄ…ce podczas
termicznej obróbki po\
ywki:
" karmelizacja cukrów
" denaturacja białek
" inaktywacja witamin
" reakcje Maillarda
" hydroliza polimerów
" zmiany pH
Sterylizacja po\
ywek
TEMPERATURA a CZAS:
Czynniki wpływające na
(sterylizacja parowa)
efektywność sterylizacji:
100 oC 200 min.
" termooporność
120 oC 19 min.
mikroorganizmów
121 oC 15 min.
" poczÄ…tkowe  stÄ™\
enie
drobnoustrojów
135 oC 1 min.
" atenuacja (temp., UV)
" temp. w najzimniejszym
pH a CZAS:
punkcie po\
ywki
(spory B. subtilis, 100 oC)
" czynniki środowiskowe
4,4 2 min.
5,6 7 min.
6,8 11 min.
8,4 9 min.
Sterylizacja powietrza
1. Filtracja mechaniczna (membrany szklane,
celulozowe, nitrocelulozowe)
2. Wyjaławianie cieplne
3. Promieniowanie UV
4. Ultradz
więki
Sterylizacja powietrza
Filtr włóknisty Filtr porowaty Filtr z membraną
głęboki membranowy plisowaną
Sterylizacja aparatury
STERYLIZACJA
W bioreaktorze: Poza bioreaktorem:
" bezpośredni wtrysk " płytowe (UHT)
pary wodnej do cieczy
" typu  rura w rurze
" wÄ™\
ownica
" płaszcz grzejny między
ścianami bioreaktora
Bioreaktory
" urządzenia do prowadzenia procesów biosyntezy
" wykonane najczęściej ze szkła lub stali nierdzewnej
" najczęściej kształtu cylindrycznego
" pojemność: od kilku do kilku milionów litrów
" zapewniają właściwe warunki przebiegu procesu, regulację i
kontrolę wybranych parametrów
Bioreaktory
Wyposa\
enie techniczne:
" kadz

" system mieszania po\
ywki
" system napowietrzania
" system grzania/chłodzenia
" urzÄ…dzenia do gaszenia piany
" urzÄ…dzenia kontrolno-pomiarowe:
" Ciśnienie: manometr
" Obj. po\
ywki: kryzy pomiarowe
" pH: elektroda szklana
" Potencjał redox: elektrody
platynowe
" Przepływ powietrza: rotametr
" StÄ™\
enie tlenu: polarograf
" Temperatura: termopara
" Gęstość komórek: nefelometr,
turbidymetr
" Ciśnienie osmotyczne: osmometr
" StÄ™\
enie cukrów: elektrody
enzymatyczne
Bioreaktory
(typy mieszania)
Sposób Element
Konstrukcje
mieszania mieszajÄ…cy
mieszadło turbinowe,
łopatkowe, śmigłowe,
typowe konstrukcje
kotwicowe
MECHANICZNE
Frings, Effigas,
mieszadło-aerator
Vogel-Bush
bioreaktor fluidalny,
PNEUMATYCZNE bełkotka
air-lift, reaktor ICI
reaktor zanurzeniowo-
HYDRAULICZNE pompa zewnętrzna
strumieniowy
Bioreaktory z mieszaniem
mechanicznym
" konstrukcje praktyczne i
sprawdzone
" wykorzystywane w przemyśle
mikrobiologicznym
" modyfikacje: bioreaktor
Vogel-Busha ( z mieszadłem-
aeratorem)
" stosowane typy mieszadeł:
kotwicowe, śmigłowe,
turbinowe, Å‚opatkowe,
kotwicowo-ramowe, śrubowe,
śrubowo-wstęgowe
Bioreaktory z mieszaniem
pneumatycznym
" prosta konstrukcja
" mo\
liwe du\
e rozmiary
" brak występowania du\
ych
sił ścinających
" stosowane na skalÄ™
laboratoryjnÄ…, pilota\
owÄ…,
przemysłową
" zastosowanie: produkcja
biomasy, metabolitów
wtórnych (np. produkcja
ajmalicyny przez
Catharantus roseus)
Bioreaktory z mieszaniem
dyfuzyjnym
" przeznaczony do hodowli kultur
protoplastów lub sferoplastów
roślinnych, komórek zwierzęcych
" bezpęcherzykowy system
napowietrzajÄ…cy
" specjalna geotkanina umo\
liwia
bezpośrednią dyfuzję tlenu do
medium hodowlanego
" geotkanina jest odporna na adhezjÄ™
komórek
Sposoby prowadzenia hodowli
w bioreaktorach
Sposoby prowadzenia kultur
Okresowa
Okresowo-dolewowa
Ciągła
Kultura okresowa
" jednorazowa inokulacja,
wprowadzenie po\
ywki
" proces biegnie do
wyczerpania substratów
" 4 fazy wzrostu mikrobów:
lag, log, plateau, zamierania
" stosowane w skali
laboratoryjnej i
przemysłowej
" nie wymagajÄ… dodatkowego
oprzyrzÄ…dowania
" wada: zmienność warunków
hodowli (ciśn. osmotyczne)
Kultura okresowo-dolewowa
" w trakcie procesu następuje
stopniowe uzupełnianie składników
od\
ywczych
" poczÄ…tkowo bioreaktor jest
wypełniony w 50 %
" mo\
liwość prowadzenia hodowli
półciągłej
" przez zdecydowaną większość
czasu kultura wzrasta w jednej z
preferowanych faz wzrostu np.
logarytmicznej przy prod. biomasy,
stacjonarnej-podczas produkcji
metabolitów wtórnych
" jest stosowana głównie do
produkcji metabolitów wtórnych
Kultura ciągła
" rozwój komórek
połączony z ciągłą
wymianÄ… po\
ywki
" komórki są w stanie
nieograniczonego
wzrostu
" zu\
yta po\
ywka jest
odbierana
" umo\
liwia uzyskanie
kultury o du\
ej
gęstości
Powiększanie skali procesu
hodowli
" problemy przenoszenia z małej na du\
Ä… skalÄ™,
" powiększanie skali znacznie zmienia parametry hodowli,
" im większy reaktor, tym większe: ciśnienie, procesy
energetyczne, mieszanie,
" badania i pomiary dokonuje się w taki sposób, aby
ekstrapolacja i porównania doprowadziły do wnioskowania
matematycznego
Teoria podobieństwa
TEORIA PODOBIEC
STWA:
" układy uznaje się za podobne, je\
eli kryteria charakteryzujÄ…ce te
układy są równe
" aby powiększyć skalę procesu hodowli, niezbędne jest zachowanie
podobieństw między poszczególnymi etapami wzrastającej skali
" najwa\
niejsze podobieństwa:
- podobieństwo geometryczne bioreaktorów
Wzrost
- podobieństwo warunków mieszania cieczy
trudności
- podobieństwo warunków wymiany masy
realizacji
- podobieństwo biologiczne
Liczby kryterialne
Są to bezwymiarowe wielkości, które określają charakterystyczny
dla danego procesu związek między wielkościami fizycznymi. Jako
minimum przyjmuje się określenie podobieństwa dla tych liczb
kryterialnych, które określają dominujące siły i zjawiska zachodzące
podczas procesu prowadzonego w reaktorze.
Za pomocÄ… liczb kryterialnych mo\
na opisać układ hydromechaniczny
bioreaktora...
Immobilizacja komórek
Techniki immobilizacji Wiązanie komórek
Komórki
kom. modyfikowanych niemodyfikowanych
Wiązanie Uwięzienie Flokulacja Sedymentacja
WiÄ…zanie WiÄ…zanie do
\
ele
poprzeczne nośnika
włókna
adsorpcja
kapsułki
chelatowanie
kowalencyjne
Separacja komórek od podło\
a
hodowlanego
Między płynem hodowlanym a komórkami istnieje niewielka
ró\
nica gęstości sedymentacja zachodzi powoli
Faza Ró\
nica gęstości między fazą stałą
stała a płynem hodowlanym [kg/m3]
Cytoplazma kom. 0-120
Bakterie 70
Dro\
d\
e 90
Komórki zwierzęce 70
Komórki roślinne 50
Strzępki grzybni 10
Separacja komórek od podło\
a
hodowlanego
Flokulacja Wirowanie Filtracja
Oddzielenie
komórek
od roztworu
Jak przyspieszyć proces
sedymentacji?
SEDYMENTACJA
V=d2(Ás-Ác)g/18·
Á Á ·
Á Á ·
Á Á ·
Flokulacja Pole grawitacyjne
Al3+
Wirówki
Fe3+
V=d2(Ás-Ác)2 2rn2/9·
Á Á  ·
Á Á  ·
Á Á  ·
Polikationy
chitozan
Jak przyspieszyć proces
sedymentacji?
V=d2(Ás-Ác)g/18·
Á Á ·
Á Á ·
Á Á ·
Wirówki
W wirówkach g zastąpione jest przez a (przyspieszenie
odśrodkowe)
a = 4 2 r n2



Wzór Stockes a przyjmuje postać:
V=d2 (Ás-Ác) 2 2 r n2/9·
Á Á  ·
Á Á  ·
Á Á  ·
Typ wirówki wartość g
Kliniczne i laboratoryjne 500-1500
Koszowe i filtracyjne 300-1500
Dekantacyjne 1500-4500
Talerzowe 4000-13000
Rurowe 10000-17000
Ultrawirówki >100000
Wirówka filtracyjna
" bęben wymoszczony tkaniną
o ró\
nym stopniu porowatości,
" 3000-5000 obr./min
" wydajność: 50-300 L/min.
" efektywność maleje bo r maleje
" działanie okresowe
" zawiesiny: 2-5%
Wirówka dekantacyjna
ślimakowa
" zawiesina jest podawana wałem
centralnym na ślimak
" ślimak obraca się przeciwnie do
bębna
" komora bębna zwę\
a siÄ™ a
ślimak przesuwa osad
" praca ciągła
" wydajność: 20000 L/h
" osad: 4 t/h
" długość bębna do 10m
" zawiesiny: 2-50%
Wirówka talerzowa (dyskowa)
" samooczyszczajÄ…ca
" napierajÄ…cy osad otwiera  klapkÄ™
" podstawowa wirówka w
przemyśle biotechnologicznym
" 12000 obr./min
" średnica rotora 0,1-1m
" wydajność: 100000 L/h
" system ciągły
" zawiesiny 15%
Wirówka wielokomorowa
" zawiesina przepływa
szeregowo przez komory
" następuje frakcjonowanie
cząsteczek pod względem
rozmiaru
" kłopotliwe usuwanie osadu
" 4500-8500 obr./min.
" wydajność: do 10000 L/h
" działanie okresowe
" dla zawiesin 4-5%
Wirówka rurowa
" długość jest 4-8 krotnością
średnicy
" mała wydajność: 100 L/h
" do 50000 obr./min
" średnica do 1 m
" dla zawiesin do 1%
Filtracja
Siłą motoryczną filtracji jest ró\
nica ciśnień po obu
stronach przegrody
Ró\
nicę ciśnień mo\
e być wywołana przez:
" pompę tłoczącą zawiesinę na filtr (filtracja ciśnieniowa)
" pompę pró\
niowÄ… zasysajÄ…cÄ… supernantant (filtracja
pró\
niowa)
" słup cieczy nad filtrem (filtracja grawitacyjna)
" siłę odśrodkową wytworzoną w wirówce
Filtracja
Typy filtracji
(w zale\
ności od
rodzaju przegrody)
F. WGA

BNA F. POWIERZCHNIOWA F. MEMBRANOWA
Separowane cząstki tworzą W wyniku przepływu wzdłu\

Filtracja zachodzi wewnÄ…trz
warstwÄ™  placek na przegrody filtracyjnej nie
przegrody
powierzchni przegrody tworzy siÄ™ warstwa osadu
Przegrody:
Przegrody:
warstwy ziarniste Przegrody:
czÄ…stki zawieszone
masy porowate membrany z polipropylenu,
estrów celulozy, poliamidu,
ceramiczne
Filtracja
Typy filtracji
(mechanizm działania
przegrody)
SZLAMOWA Z BLOKOWANIEM MIESZANA
PRZEGRODY
Wielkość filtrowanych cząstek Jest kombinacją obu typów
Warstwa osadu tworzy
jest większa od otworów w filtracji
właściwą przegrodę
przegrodzie, następuje
filtracyjnÄ…
blokada kapilar przegrody
(kadz
filtracyjna w browarze,
(klarowanie soków owocowych)
filtracja w dro\
d\
owniach)
Wskazania: du\
a lepkość,
Wskazania: mała lepkość,
rzadka zawiesina
gęsta zawiesina
Filtracja styczna
(mikrofiltracja)
Retentat
Nadawa
Permeat
" membrana charakteryzuje siÄ™ du\
ym oporem przepływu,
" mała przepuszczalność rekompensowana przez rozwiniętą
powierzchniÄ™,
" brak  placka filtracyjnego podczas filtracji
" konieczność stosowania nadciśnienia po stronie nadawa-permeat
" Å›rednica porów przegrody: 0,05-10 µm
" zastosowanie: wstępne oczyszczanie cieczy w przemyśle
botechnologicznym, farmaceutycznym, spo\
ywczym
" retencja bakterii i grzybów
Oddzielanie i oczyszczanie
produktów
Produkty:
" witaminy
" antybiotyki
" białka i polipeptydy
" metabolity mikroorganizmów
" polisacharydy bakteryjne
" alkohole
Odznaczają się ró\
nymi właściwościami fozykochemicznymi oraz mogą być
wydzielane wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowo wymaga to odrębnego,
specyficznego postępowania podczas oczyszczania produktu
Oddzielanie i oczyszczanie
produktów
Gdzie jest produkt?
Roztwór pohodowlany Komórki bakteryjne
Dezintegracja komórek
Odwirowanie ścian
komórkowych
Procesy:
- ekstrakcji
- nano/ultrafiltracja
- precypitacja
- ultrawirowanie
Dezintegracja komórek
Dezintegracja komórek
Homogenizator ciśnieniowy
Pozyskiwanie drobnoustrojów
I. Środowisko naturalne  jako niewyczerpany rezerwuar szczepów
przydatnych do bioprodukcji metabolitów. Izolacja interesującego
nas szczepu wymaga przeprowadzenia odpowiednich procedur
screeningowych
II. Kolekcje placówek naukowych, firm biotechnologicznych, kolekcje
centralne np.:
1) Actinomycetes Culture Collection, ACC, UK
2) American Type Culture Collection (ATCC) Rockwill, USA
3) World Data Center of Microorganism (WDCM), 566 kolekcji,
obejmuje:
- kolekcje międzynarodowe
- kolekcje narodowe
- kolekcje uniwersyteckie
- kolekcje przemysłowe
4) Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, Instytut
Pasteura
5) Instytut Biotechnologii i Przemysłu Spo\
ywczego w Warszawie