Katedra Biotechnologii w Ochronie Środowiska Wydział Ochrony Środowiska i Rybactwa UWM w Olsztynie Przewodnik do ćwiczeń z Genetyki dla studentów II roku kierunku Ochrona Środowiska Sławomir Ciesielski Dariusz Kaczmarczyk Mirosław Auczyński Małgorzata Jankun Paweł Woznicki www.genetics.wustl.edu/ Olsztyn 2013 1 Ćwiczenia z przedmiotu Genetyka " Państwo studenci przychodzą na zajęcia przygotowani teoretycznie oraz wyposażeni w przybory do pisania, kalkulator oraz w przypadku ćwiczeń laboratoryjnych w białe fartuchy, " podczas każdego ćwiczenia może się odbyć sprawdzian z wiadomości dotyczących poprzedniego i bieżącego ćwiczenia, " zaliczenie ćwiczeń musi zakończyć się przed letnią sesją egzaminacyjną. Kierownik przedmiotu: dr hab. Sławomir Ciesielski Katedra Biotechnologii w Ochronie Środowiska ul. Słoneczna 45G telefon: (+48) 895234119 e-mail: slavcm@uwm.edu.pl Prowadzący ćwiczenia: dr inż. Dariusz Kaczmarczyk Katedra Biotechnologii w Ochronie Środowiska ul. Słoneczna 45G telefon : (+48) 895234144 e-mail: d.kaczmarczyk@uwm.edu.pl 2 Szczegółowy program ćwiczeń Ćwiczenie 1. Wprowadzenie: regulamin ćwiczeń i zasady zaliczania, plan ćwiczeń, literatura do ćwiczeń z przedmiotu. Podstawy dziedziczenia: I i II prawo Mendla. Ćwiczenie 2. Efekt plejotropowy genu. Geny letalne i subletalne na przykładzie dziedziczenia kształtu płetw mieczyka Xiphophorus helleri - rozwiązywanie zadań, teoretyczne przykłady krzyżówek pomiędzy osobnikami o różnych fenotypach. Ćwiczenie 3. Chromosomy płci. Dziedziczenie cech sprzężonych z płcią rozwiązywanie zadań. Ćwiczenie 4. Allele wielokrotne na przykładzie systemu grup krwi ABO u człowieka. Czynnik Rh a konflikt serologiczny. Ćwiczenie 5. Częstość występowania alleli i genotypów. Prawo Hardy-Weinberga. Ćwiczenie 6. Efektywna liczebność populacji i współczynnik inbredu rozwiązywanie zadań rachunkowych. Ćwiczenie 7. Genetyka muszki owocowej (Drosophila melanogaster). Wykorzystanie programu komputerowego DrosophiLab (sala komputerowa). Ćwiczenie 8. Geny autosomalne i sprzężone z płcią. Drosophila melanogaster jako obiekt badań genetycznych (laboratorium). Ćwiczenie 9. Modele doboru naturalnego w populacjach - symulacje komputerowe dotyczące zmian frekwencji alleli w populacji pod wpływem doboru naturalnego (sala komputerowa). Ćwiczenie 10. Analiza wyników hodowli muszki owocowej (ćwiczenie 8). Genotyp a środowisko: wpływ zagęszczenia populacji na masę ciała Drosophila melanogaster - zakładanie hodowli muszki owocowej (laboratorium). Ćwiczenie 11. Zastosowania badań polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w genetyce przeprowadzenie rozdziału produktu PCR w żelu agarozowym. Ćwiczenie 12. Dystans genetyczny. Analiza prążków uzyskanych w wyniku trawienia restrykcyjnego (wykorzystanie wyników z poprzedniego ćwiczenia). (laboratorium). Ćwiczenie 13. Kolokwium. Ćwiczenie 14. Wpływ zagęszczenia populacji na masę ciała Drosophila melanogaster- zamknięcie doświadczenia. Analiza wyników przy pomocy testu t-Studenta i wnioski (laboratorium). Ćwiczenie 15. Niepełna dominacja i addycja dwu loci genowych. Prawo Hardy'ego- Weinberga dla dwuch loci genowych. Zaliczenie ćwiczeń. 3 Ćwiczenie 1 Ćwiczenie 1. Podstawy dziedziczenia. Prawa Mendla I prawo Mendla Prawo czystości gamet: podczas tworzenia gamet u organizmów diploidalnych allele oddzielają się i w gametach występują pojedynczo Rodzice P AA x aa Gamety G A a Pokolenie 1. F1 Aa x Aa Gamety G A, a A,a Pokolenie 2. F2 Szachownica genetyczna (Punneta) A a A AA Aa a Aa aa I Prawo Mendla, dominacja pełna i kodominacja zadania Czarna barwa nasion u fasoli dominuje nad białą. Po skrzyżowaniu roślin o czarnych nasionach z roślinami białonasiennymi otrzymano tylko czarne nasiona. Jaką barwę nasion będzie miało potomstwo roślin otrzymanych w wyniku krzyżowania dwóch czarnonasiennych osobników F1? Żółta barwa nasion grochu dominuje nad barwą zieloną. Rośliny homozygotyczne o żółtej barwie nasion skrzyżowano z roślinami o nasionach zielonych, następnie rośliny z pokolenia F1 powtórnie skrzyżowano z: a) zielononasienną formą rodzicielską b) żółtonasienną formą rodzicielską Proszę podać genotypy i fenotypy potomstwa uzyskane po krzyżowaniu a i b. 4 Ćwiczenie 1 Skrzyżowano roślinę lwiej paszczy o kwiatach czerwonych z rośliną o kwiatach białych. W pokoleniu F1 wszystkie rośliny miały kwiaty różowe. Jak będzie wyglądało pokolenie F2 (powstałe ze skrzyżowania dwóch roślin różniących się z kwiatami z pokolenia F1)? Molinezja (Poecilia sphenops) wykazuje polimorfizm genetyczny pod względem kształtu płetw. W locus L odpowiedzialnym za kształt płetw molinezji znajdują się 2 allele L i l. Niepełna dominacja L nad I sprawia, że 3 genotypom odpowiadają 3 fenotypy przedstawione na rysunku: fenotyp genotyp A II B LI C LL Skrzyżowano molinezję o fenotypie A z osobnikiem o fenotypie C. W pokoleniu F1 wszystkie ryby miały fenotyp B. Jakie będą proporcje fenotypów w pokoleniu F2? Normalne ubarwienie u karpia dominuje nad ubarwieniem błękitnym. Skrzyżowano rybę normalnie ubarwioną z błękitną. W pokoleniu F1 wszystkie karpie były normalnie ubarwione. Jakich fenotypów można spodziewać się w pokoleniu F2? Jak sprawdzić, czy normalnie ubarwiony karp jest homozygotą czy heterozygotą? Skrzyżowano pstrąga tęczowego o ubarwieniu złocistym z osobnikiem o ubarwieniu normalnym. W pokoleniu F1 otrzymano 100% ryb o ubarwieniu pośrednim (tzw palomino). Jakie będą proporcje fenotypów w pokoleniu F2? 5 Ćwiczenie 1 II prawo Mendla Prawo niezależnego dziedziczenia cech: cechy warunkowane przez różne pary genów dziedziczą się niezależnie i mogą tworzyć dowolne połączenia u osobników potomnych. P AABB x aabb G AB ab F1 AaBb x AaBb G AB, aB, ab, Ab AB, aB, ab, Ab F2 AB aB ab Ab AB AABB AaBB AaBb AABb aB AaBB aaBB aaBb AaBb ab AaBb aaBb aabb Aabb Ab AABb AaBb Aabb AAbb Zadania Długa sierść kotów perskich jest uwarunkowana genem recesywnym (p) w stosunku do allelu krótkiej sierści kotów syjamskich (P), zaś czarne umaszczenie persów uwarunkowane jest allelem dominującym (B) w stosunku do genu kawowego umaszczenia syjamczyków (b). Podaj możliwe genotypy syjamczyków i persów. Skrzyżowano homozygotycznego persa z homozygotycznymsyjamczykiem. Jak będzie wyglądało pokolenie F1 i F2? Brązowa barwa oczu człowieka (B), dominuje nad niebieską (b), praworęczność nad leworęcznością. Brązowooki, praworęczny mężczyzna poślubia niebieskooką, praworęczną kobietę. Ich pierwsze dziecko jest niebieskookie i leworęczne. Jeśli urodzą się inne dzieci, jakie cechy ( z wymienionych) ujawnią się? Wyjaśnij genotypy rodziców i dzieci. 6 Ćwiczenie 1 Wiadomości wymagane na tym ćwiczeniu można odnalezć w następujących podręcznikach: 1. W. Gajewski. Genetyka ogólna i molekularna. PWN Warszawa, 1980, str. 125- 135 2. B. Rodkiewicz i G. Kerszman. Zarys genetyki. PWN Warszawa, 1987. str. 27- 40. 3. J. Maciejowski i J. Zięba. Genetyka i ogólna hodowla zwierząt. Tom 1.PWN Warszawa, 1972 str. 129-164. 4. B. Nowicki. Genetyka i metody doskonalenia zwierząt. PWR i L Warszawa, 1985. str. 30-40. 5. P.C. Winter, G.I. Hickey, H.L. Fletcher. Krótkie wykłady, genetyka. PWN Warszawa, 2001. str. 139-149. 6. A. Sadakierska-Chudy, G. Dąbrowska, A. Goc. Genetyka ogólna. Wydawnictwo Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Toruń 2004. 7 Ćwiczenie 2 Ćwiczenie 2. Efekt pleiotropowy genu. Geny letalne i subletalne na przykładzie mieczyka (Xiphophorus helleri). Mieczyk (Xiphophorus helleri) jest rybą akwariową pochodzącą z tropikalnych regionów Ameryki Południowej i Środkowej oraz Meksyku. Ta niewielka, jajożyworodna ryba wykazuje ogromny polimorfizm ubarwienia i pokroju ciała. Oprócz form krótkopłetwych w akwariach spotykane są również formy długopłetwe. Jedna z tych form charakteryzuje się wydłużoną płetwą grzbietową (mieczyk żaglopłetwy, mieczyk Simpsona). Druga forma posiada wszystkie płetwy wydłużone, przy czym charakterystyczne jest wydłużenie skrajnych promieni płetwy ogonowej oraz pierwszych promieni płetwy grzbietowej (tzw. mieczyk lirogon lub widlak). Kształt płetw mieczyka jest determinowany przez dwie pary alleli w dwu nie sprzężonych i niezależnych loci genowych. Obie powyżej opisane mutacje mają charakter dominujący i obniżają przeżywalność, odporność na choroby, tempo wzrostu i płodność mieczyków w stanie heterozygotycznym (efekt subletalny). Zmutowane dominujące allele w stanie homozygotycznym (w każdym z dwu loci niezależnie) uniemożliwiają przeżycie organizmu już w fazie embrionalnej (efekt letalny). Zjawisko, w którym jeden locus genowy decyduje o kilku cechach (np. kształt płetw i tempo wzrostu, barwa kwiatów-i barwa nasion, biała barwa sierści, czerwone oczy oraz nieostre widzenie) nazywamy pleiotropią lub efektem pleiotropowym. Geny o charakterze letalnym i subletalnym zazwyczaj wykazują silną pleiotropię w organizmie. Jeżeli pierwszy locus oznaczymy literą S (Simpson) a drugi L (lirogon), to osobnik o fenotypie dzikim (krótkopłetwy) będzie podwójną homozygotą recesywną o genotypie ssll. Mieczyk Simpsona będzie miał genotyp Ssll, natomiast lirogon ssLl. Wszystkie mieczyki o genotypie SS lub LL będą zamierały w trakcie rozwoju embrionalnego. Fenotyp podwójnej heterozygoty SsLI (mieczyk welonowy) przedstawia się następująco: wszystkie płetwy silnie wydłużone, płetwa grzbietowa w kształcie żagla (jak u formy Simpson), płetwa ogonowa wydłużona równomiernie (tak skrajne jak i środkowe promienie płetwy ogonowej wydłużone). Zadanie Badana populacja mieczyka składa się z 16 osobników krótkopłetwych, 14 żaglopłetwych, 4 lirogonów i 15 welonowych. Ryby te są potomstwem jednej pary: samica lirogon x samiec żaglopłetwy. 8 Ćwiczenie 2 a) oblicz frekwencje alleli S i s oraz L i I, b) Jaki będzie rezultat krzyżówek mieczyka: krótkopłetwy x welonowy, welonowy x welonowy, lirogon x lirogon, krótkopłetwy x żaglopłetwy 9 Ćwiczenie 2 10 Ćwiczenie 2 Ćwiczenie 2. Chromosomy płci. Dziedziczenie cech sprzężonych z płcią. Cechami sprzężonymi z płcią nazywamy cechy zależne od genów mających loci w chromosomie płci X. Chromosom X różni się od wszystkich pozostałych (autosomów) tym, że u jednej z płci nie ma swojego homologa. Innym chromosomem płci występującym u ssaków jest chromosom Y. Różni się on od chromosomu X kształtem, długością i, co najważniejsze, z reguły nie zawiera loci odpowiadających tym, które spotykamy w chromosomie X. Płeć charakteryzująca się dwoma różnymi chromosomami XY lub tylko jednym X nazywamy płcią heterogametyczną. Powstają bowiem u niej dwojakiego rodzaju gamety w równych ilościach: 50% z chromosomem X i 50% z Y. Pleć przeciwna do omówionej jest nazywana homogametyczną, ma dwa takie same chromosomy płci (np. XX) i dlatego wszystkie wytwarzane przez nią gamety zawierają po jednym tym samym chromosomie płci (np. X). U zwierząt płci heterogametycznej wszystkie cechy sprzężone z płcią zależą od jednego tylko genu, a nie jak u płci homogametycznej od pary genów. Rozpatrzmy taką cechę na przykładzie hemofilii u psów. Hemofilia wywołana jest recesywnym genem h. Dominujący gen tej pary H daje normalną krzepliwość krwi. Tak więc, wszystkie możliwe fenotypy i genotypy spotykane u psów możemy zapisać odpowiednimi symbolami w dwojaki sposób. zdrowe nosiciele chore samice HH Hh hh samce H0 h0 U ssaków i większości owadów samice są płcią homogametyczną XX, a samce heterogametyczną XY. Natomiast u ptaków i niektórych motyli samice mają tylko jeden chromosom X a samce XX. Jak wynika z tych wyjaśnień gamety wytwarzane przez zwierzęta płci heterogametycznej są dwojakiego rodzaju i od tego, która z nich wezmie udział w wytworzeniu (podczas procesu zapłodnienia) zygoty zależy płeć zwierzęcia. U ssaków, samce otrzymują chromosom X wyłącznie od swojej matki, u ptaków jest odwrotnie - samice otrzymują chromosom płci X.-tylko od ojca. a wraz z nim geny kodujące cechy sprzężone z płcią. Autosomalne cechy pozostające pod wpływem płci często są nazywane cechami związanymi z płcią. Wynika to stąd, że zwierzęta heterozygotyczne ze względu na te 11 Ćwiczenie 2 cechy mają mimo jednakowego genotypu różne fenotypy zależnie od płci. Na przykład, jeżeli gen bezrożności określimy symbolem B. a rogatości b - to u pewnych ras owiec zwierzęta BB będą bezrożne niezależnie od płci, zwierzęta bb - rogate, natomiast heterozygoty Bb samce będą rogate, a Bb samice - bezrożne. Tak więc, ten sam genotyp może dawać różne efekty fenotypowe zależnie od płci osobnika. 12 Ćwiczenie 3 Ćwiczenie 3. Geny autosomalne i sprzężone z płcią rozwiązywanie zadań Cechami sprzężonymi z płcią nazywamy cechy zależne od genów mających loci w chromosomie płci X. Chromosom X różni się od wszystkich pozostałych autosomów) tym, że u jednej z płci nie ma swojego homologa. Innym chromosomem płci występującym u ssaków jest chromosom Y. Różni się on od chromosomu X kształtem, długością i, co najważniejsze, z reguły nie zawiera loci odpowiadających tym, które spotykamy w chromosomie X. Płeć charakteryzująca się dwoma różnymi chromosomami XY lub tylko jednym Xnazywamy płcią heterogametyczną. Powstają bowiem u niej dwojakiego rodzaju gamety wrównych ilościach: 50% z chromosomem X i 50% z Y. Pleć przeciwna do omówionej jest nazywana homogametyczną, ma dwa takie same chromosomy płci (np. XX) i dlatego wszystkie wytwarzane przez nią gamety zawierają po jednym tym samym chromosomie płci (np. X). U zwierząt płci heterogametycznej wszystkie cechy sprzężone z płcią zależą od jednego tylko genu, a nie jak u płci homogametycznej od pary genów. Rozpatrzmy taką cechę na przykładzie hemofilii u psów. Hemofilia wywołana jest recesywnym genem h. Dominujący gen tej pary H daje normalną krzepliwość krwi. Tak więc, wszystkie możliwe fenotypy i genotypy spotykane u psów możemy zapisać odpowiednimi symbolami w dwojaki sposób. zdrowe nosiciele chore samice HH Hh hh samce H0 h0 U ssaków i większości owadów samice są płcią homogametyczną XX, a samce heterogametyczną XY. Natomiast u ptaków i niektórych motyli samice mają tylko jedenchromosom X a samce XX. Jak wynika z tych wyjaśnień gamety wytwarzane przez zwierzętapłci heterogametycznej są dwojakiego rodzaju i od tego, która z nich wezmie udział w wytworzeniu (podczas procesu zapłodnienia) zygoty zależy płeć zwierzęcia. U ssaków, samce otrzymują chromosom X wyłącznie od swojej matki, u ptaków jest odwrotnie samice otrzymują chromosom płci X.-tylko od ojca. a wraz z nim geny kodujące cechy sprzężone z płcią. 13 Ćwiczenie 3 Autosomalne cechy pozostające pod wpływem płci często są nazywane cechami związanymi z płcią. Wynika to stąd, że zwierzęta heterozygotyczne ze względu na te cechy mają mimo jednakowego genotypu różne fenotypy zależnie od płci. Na przykład, jeżeli gen bezrożności określimy symbolem B. a rogatości b - to u pewnych ras owiec zwierzęta BB będą bezrożne niezależnie od płci, zwierzęta bb - rogate, natomiast heterozygoty Bb samce będą rogate, a Bb samice - bezrożne. Tak więc, ten sam genotyp może dawać różne efekty fenotypowe zależnie od płci osobnika. 14 Ćwiczenie 4 Ćwiczenie 4. Allele wielokrotne na przykładzie sytemu grup krwi ABO u człowieka. Czynnik RH a konflikt serologiczny. Rozwiązywanie zadań rachunkowych: obliczanie frekwencji alleli w populacji na podstawie częstości poszczególnych grup krwi. A. Allele wielokrotne na przykładzie sytemu grup krwi ABO u człowieka. Czynnik RH a konflikt serologiczny. Mechanizm dziedziczenia grup krwi u człowieka Dziedziczenie grup krwi w systemie ABO u człowieka zależy od występowania kombinacji dwu z trzech alleli w jednym locus genowym. Dwa allele IA oraz IB są dominujące wobec trzeciego allelu i. Pomiędzy dominującymi allelami IA i IB występuje zjawisko kodominacji (współdominacji). Polega to na jednoczesnej ekspresji obu tych alleli w heterozygocie. Produktem ekspresji allelu IA jest antygen A obecny w błonie komórkowej erytrocytu. Produktem ekspresji allelu IB jest antygen B. Allel recesywny i jest odpowiedzialny za brak antygenu w błonie komórkowej erytrocytu. Osoby z grupa krwi A posiadają antygen A w błonie komórkowej erytrocytu, oraz przeciwciała (izoaglutyniny) anty-B, skierowane przeciw antygenowi B. Osoby z grupa krwi B posiadają antygen B oraz izoaglutyniny anty-A. Osoby z grupa AB posiadają oba antygeny w błonie erytrocytu i żadnych izoaglutynin w osoczu. Osoby z grupa krwi 0 posiadają izoaglutyniny anty-A i anty-B w osoczu, nie posiadają natomiast żadnych antygenów w błonie erytrocytu. Osoby z grupa krwi A mogą mieć genotypy: IAIA oraz IAi osoby z grupa B: IBIB oraz IBi osoby z grupa AB - tylko IAIB a osoby z grupa 0 tylko ii. W ten sposób sześć różnych genotypów ( 3 homo- i 3 heterozygotyczne) daje w efekcie 4 fenotypy. Dzieje się tak na skutek pełnej dominacji alleli IA oraz IB nad allelem i w odpowiednich genotypach heterozygotycznych. W genotypie heterozygotycznym IAIB występuje zjawisko kodominacji (jednoczesne występowanie obu antygenów w błonie erytrocytu. Występowanie czynnika Rh zależy od układu zależy pary alleli jednym locus genowym. W tym locus występują dwa allele: D oraz d. Występuje pełna dominacja D nad d. Genotypy DD i Dd będą wiec miały wspólny fenotyp (Rh+), natomiast homozygota recesywna dd będzie miała fenotyp Rh-(brak czynnika Rh). Występowanie konfliktu serologicznego wiąże się z odpowiedzią immunologiczną 15 Ćwiczenie 4 organizmu matki o fenotypie Rh- przeciwko krwinkom czerwonym dziecka o fenotypie Rh+. W takiej sytuacji następuje indukcja syntezy specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi Rh w erytrocytach dziecka, gdyż czynnik ten jest rozpoznawany w organizmie matki jako obcy antygen). W trakcie ciąży wzrost koncentracji przeciwciał przeciwko czynnikowi RH we krwi matki przebiega stopniowo, niemniej pierwsze dziecko rodzi się zwykle bez większych komplikacji. Poziom przeciwciał przeciw czynnikowi Rh we krwi matki o genotypie dd po przebytej ciąży jest już podwyższony (organizm nabył odporność" na oby antygen - czynnik Rh, podobnie jak to ma miejsce w przypadku wytwarzania się odporność naturalnej po przebytej chorobie). Przy kolejnej ciąży dojdzie do szybkiego dalszego wzrostu koncentracji przeciwciał i w rezultacie nastąpi odpowiedz immunologiczna organizmu matki, polegająca na niszczeniu krwinek dziecka posiadającego czynnik Rh w błonie erytrocytu (genotyp Dd). Osoby z grupą krwi Rh- stanowią 15% całej populacji, natomiast osoby z grupą krwi Rh+ stanowią 85% populacji. 16 Ćwiczenie 5 Ćwiczenie 5. Model Hardy ego-Weinberga (H-W). Svmulowanie losowego kojarzenia gamet w populacji panmiktvcznei. Stosowanie testu 2 (chi2) do określenia czy obserwacje potwierdzają prawo H-W. Proces analizy zmienności genetycznej składa się: - ze zbadania jednego lub więcej typów markerów genetycznych, - ilościowego wyrażenia frekwencji fenotypów, - wywnioskowania na tej podstawie frekwencji genotypów kodujących zbadane fenotypy. Następnie potrzebny jest określony model, który powiąże ze sobą frekwencje genotypów z frekwencjami alleli i umożliwi wyciagnięcie wniosków na temat procesów, oddziałujących na badaną populację. Użyteczność modelu polega na tym, iż pozwala on zidentyfikować kluczowe obserwacje (lub eksperymenty) które należy poczynić, aby lepiej zrozumieć stan obecny populacji oraz zaradzić ewentualnym kłopotom. Najpowszechniej stosowanym modelem, wiążącym frekwencje genotypów z frekwencjami alleli, jest model opracowany niezależnie przez G.H. Hardy'ego (1908) oraz W. Weinberga (1908). Model Hardy'ego-Weinberga opiera się na kilku ważnych założeniach: - liczebność populacji jest wielka i stała w kolejnych pokoleniach, - kojarzenie się osobników jest losowe (populacja jest panmiktyczna, albo bardzo dobrze wymieszana), - organizmy są diploidalne, - pokolenia nie zazębiają się, - rozród odbywa się drogą płciową, - wpływy mutacji, migracji i selekcji są zaniedbywalne. W przypadku autosomalnych (tych, które nie są ulokowane na chromosomach płci) loci genowych o dwóch allelach, model Hardy'ego-Weinberga przyjmuje postać: (p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1 17 Ćwiczenie 5 gdzie p to frekwencja częstszego allelu A podczas gdy q jest frekwencją rzadziej występującego allelu a, natomiast p +q = 1. Proporcje genotypów będą odpowiadały rozwinięciu dwumianu (p + q)2. AA Aa aa p2 2pq q2 Model Hardy'ego-Weinberga zakłada, że jeśli zostaną spełnione ww. założenia, to frekwencje alleli i genotypów w populacji nie będą się zmieniały z pokolenia na pokolenie. Zgodnie z tym założeniem, model może być stosowany do przewidywania frekwencji genotypów na podstawie obecnej frekwencji alleli. Zastosowania modelu Hardy'ego-Weinberga dostarczają podstawy do oceny sił ewolucyjnych, wpływających na wachlarz genotypów w populacji. Jeśli stwierdzamy że obserwowane frekwencje genotypów są inne niż frekwencje przewidywane przez model, można stawiać hipotezy co do przyczyn tych odchyleń. Idąc dalej, można zaplanować nowe obserwacje lub eksperymenty, których celem będzie wyjaśnienie procesów, które spowodowały różnice między obserwowanymi i przewidywanymi frekwencjami alleli w populacji. Rozumowanie takie opiera się na przypuszczeniu, iż w rezultacie rozmaitych mechanizmów ekologicznych jedno lub więcej założeń modelu nie jest spełnione w przypadku obserwowanej populacji. Jednym z założeń modelu Hardy'ego-Weinberga jest losowe kojarzenie się osobników w procesie rozrodu. To założenie często nie jest spełniane wskutek najrozmaitszych zachowań rozrodczych. Wybiórcze krzyżowanie się osobników to wybór partnera rozrodczego na podstawie jego fenotypu. Dodatnie krzyżowanie wybiórcze występuje wtedy. gdy osobniki krzyżują się z podobnymi do siebie częściej niż gdyby było to wyłącznie dziełem przypadku. Inbreeding to krzyżowanie się ze sobą osobników spokrewnionych, co stanowi szczególny przypadek pozytywnego krzyżowania się wybiórczego. Negatywne wybiórcze kojarzenie się występuje wówczas, gdy częściej niż wynikałoby to z przypadku osobniki krzyżują się z partnerami niepodobnymi do siebie fenotypowo jak w przypadku "korzyści rzadkich samców" [rare-male advantage] Drosophila). Genetyczny podział populacji gatunku jest również odmianą krzyżowania wybiórczego, w którym na pulę genową gatunku składają się pule genowe grupy subpopulacji (stad), których osobniki krzyżują się panmiktycznie w ramach subpopulacji (stad). W niektórych przypadkach wpływ doboru naturalnego na frekwencje genotypów 18 Ćwiczenie 5 nie jest zaniedbywalny. Dobrze znanym przykładem u człowieka jest korzystne dostosowanie heterozygot w locus B-hemoglobiny, kiedy to genotyp +s (odporny na malarię, nie anemiczny) jest lepiej dostosowany niż ++ (podatny na malarię) i genotyp ss (cierpi na anemię związaną z sierpowatością erytrocytów). Złamanie założeń prawa Hardy'ego-Weinberga może wyniknąć z rozmaitych innych mechanizmów ekologicznych. W rzeczywistości, model Hardy'ego-Weinberga jest dość odporny na niewielkie odstępstwa od jego założeń, co czyni go użytecznym w zastosowaniach praktycznych. Trzeba jednak zaznaczyć, iż jeśli obserwowane frekwencje genotypowe spełniają oczekiwania Hardy'ego-Weinberga, to nie musi to koniecznie oznaczać że wszystkie założenia modelu są spełnione. Symulowanie losowego kojarzenia gamet w populacji panmiktvcznej. Stosowanie testu 2 (chi2) do określenia czy obserwacje potwierdzają spodziewania H-W Populację określamy jako pamniktyczną, jeżeli kojarzenia należących do niej osobników zachodzą całkowicie losowo. Rozkład genotypów w populacji zależy od wielu czynników. W najprostszym przypadku może on być losowy i bezpośrednio wynikać z frekwencji występujących w tej populacji alleli. Załóżmy, że populacja spełnia następujące warunki: 1. organizmy są diploidalne, 2. rozmnażają się płciowo, 3. pokolenia nie zachodzą na siebie, 4. osobniki kojarzą się losowo (populacja jest panmiktyczna), 5. populacja jest bardzo duża, 6. nie ma migracji, 7. nie ma mutacji, 8. dobór naturalny nie wpływa na badany locus. Populacja będzie spełniała te warunki także wtedy, gdy czynniki wymienione w pkt. 6, 7 i 8 będą się równoważyć. W takich warunkach proporcje genotypów, dla locus o dwu allelach A i a, których frekwencje wynoszą odpowiednio p i q, (przy czym p + q = 1), będą odpowiadały rozwinięciu dwumianu (p + q)2. 19 Ćwiczenie 5 Powyższe stwierdzenie jest zwane prawem Hardy'ego i Weinberga. Prawo to mówi, że jeśli zostaną spełnione założenia 1-8, to frekwencje alleli i genotypów w populacji nie będą się zmieniały z pokolenia na pokolenie; dla dwu alleli frekwencje genotypów będą odpowiadały rozwinięciu dwumianu (p + q)2. Każdy ze studentów losuje dwie. "gamety" z locus A i dwie z locus B, następnie każdy odczytuje swój "genotyp". Jakie są liczebności poszczególnych genotypów w locus A a jakie w locus B? Jakie są oczekiwane liczebności tych genotypów z równania Hardy'ego i Weinberga? Czy frekwencje obserwowane odpowiadają oczekiwanym - sprawdzenie za pomocą testu chi-kwadrat. Test 2 stosuje się do określania, czy obserwowane liczby osobników o danych genotypach są takie same, jakich spodziewalibyśmy się na podstawie H-W (to znaczy, czy spełniają oczekiwania H-W, otrzymane wartości z obu (obserwowane i oczekiwane) kolumn podstawiamy do wzoru i obliczamy według modelu (Obs - Exp)2 2 = " Exp gdzie: Obs to liczba obserwowanych osobników o określonym fenotypie Exp to liczba oczekiwanych osobników o określonym fenotypie suma (Ł) będzie zawierała 3 składniki - odpowiednio dla trzech genotypów w każdym z badanych loci genowych (oddzielnie AA, Aa i aa oraz BB, Bb i bb). Liczba stopni swobody, związana z tą wielkością 2 , równa się liczbie klas danych (w tym przykładzie trzy klasy, czyli liczby AA, Aa oraz aa) minus jeden, minus liczba parametrów oszacowanych na podstawie danych (w tym przykładzie jeden parametr, p, oszacowano na podstawie danych), czyli 3 - 1 - 1 = 1. Zauważmy, że stopień swobody nie jest pomniejszany z powodu oszacowania na podstawie danych wielkości parametru q, gdyż kiedy już oszacowaliśmy p. wówczas q można otrzymać z zależności q = 1 - p. Przy jednym stopniu swobody otrzymana wyżej wartość 2 jest wysoce istotna (P < 0,01). Wartość krytyczna statystyki 2 na poziomie istotności a = 0,05 wynosi w tym przypadku 3,84 20 Ćwiczenie 5 Obliczanie frekwencji alleli w locus przy pełnej dominacji. Rozpatrujemy dwie cechy: 1. barwa oczu: brązowe. piwne lub zielone - genotyp M lub Aa niebieskie lub szare - genotyp aa 2. ucho: wolny koniec - genotyp BB lub Sb, przyrośnięty koniec - genotyp bb. Każdy ze studentów określa genotyp sąsiada (na podstawie jego fenotypu) jako Ax lub aa oraz Bx lub bb.(gdzie x oznacza dowolny allel z danego locus). Zauważmy. że tylko homozygoty recesywne są wyróżnialne (dotyczy to obu badanych loci genowych). Obliczamy udział homozygot recesywnych (dla każdej cechy oddzielnie) w całej grupie studenckiej. Dodajemy również w miarę możliwości wyniki z grup poprzednich, aby zwiększyć liczebność próby i zminimalizować błąd statystyczny. Przykładowo, jeżeli liczba homozygot w locus A wynosiła 5 na 20 osób, to frekwencja homozygot recesywnych w próbie wynosi 5/20 czyli 0.25. Z równania Hardy'ego i Weinberga wiemy. że frekwencja homozygot recesywnych w populacji wynosi q2, a zatem frekwencja allelu recesywnego q = "q2 = 0,5. Frekwencja allelu dominującego wynosi zaś p = 1-q = 0,5 Mamy już frekwencje alleli A i a (p i q) oraz B i b (p i q ). Możemy teraz 1 1 obliczyć, jaki procent w populacji stanowią heterozygoty - nosiciele cech recesywnych. Obliczamy to ze wzoru: liczba heterozygot Aa = 2pq liczba heterozygot Bb = 2p q . 1 1 Każdy ze studentów, szczególnie potencjalnych heterozygot w badanych loci przypomni sobie jak wyglądają wspomniane cechy u jego rodziców i rodzeństwa, a następnie wyciągnie wnioski co do swojego genotypu w loci A i B. 21 Ćwiczenie 6 Ćwiczenie 6. Efektywna wielkość populacji i współczynnik inbredu rozwiązywanie zadań. Efektywna wielkość populacji: 4Nm * N f Ne = Nm + N f gdzie: Nm- liczba samców, Nf- liczba samic Współczynnik inbredu: Ft = 1 - (1- 0,5Ne )t gdzie: F - współczynnik inbredu, t - liczba pokoleń, Ne - efektywna wielkość populacji AA po2 +PoqoFt Aa 2poqo -2poqoFt aa qo2 +PoqoFt Im wyższa wartość współczynnika inbredu tym szybciej wzrasta nadwyżka homozygot w populacji. Inbred nie ma wpływu na frekwencje alleli A i a, natomiast ma znaczny wpływ na frekwencje poszczególnych genotypów AA, Aa, i aa. Zadania 1) Oblicz efektywną wielkość populacji, w której jest: a) 150 samic i 50 samców, b) 180 samic i 20 samców, c) 280 samic i 20 samców, d) 380 samic i 20 samców, e) 170 samic i 30 samców. 2) Oblicz efektywną wielkość populacji złożonej z 10 kur i 1 koguta. 3) Efektywna wielkość pewnej populacji wynosi 20. Frekwencje alleli A i a wynoszą odpowiednio 0,6 i 0,4. 22 Ćwiczenie 6 4) Oblicz współczynnik inbredu oraz frekwencje genotypów w tej populacji w dziesiątym pokoleniu. Oblicz to samo dla populacji liczącej 1000 samic i 1000 samców. 23 Ćwiczenie 7 Ćwiczenie 7. Genetyka muszki owocowej (Drosophila melanogaster). Wykorzystanie programu komputerowego drosophiLab. DrosophiLab (autor programu: Hannes Jensen) I Konstrukcja prostego eksperymentu Przewodnik ten pozwala na przeprowadzenie prostego eksperymentu, w którym analizowane będzie dziedziczenie pojedynczego genu (vg vestigial vings) odpowiedzialnego za mutację polegającą na redukcji skrzydeł u D. melanogaster. Do eksperymentu wybieramy rodziców, którzy są heterozygotami pod względem tego genu. Jako, że rodzice nie wykazują żadnej obecności tej mutacji możemy się spodziewać, iż 25% pokolenia potomnego (F1) będzie posiadało zredukowane skrzydła (co ilustruje poniższy diagram) Krok 1. Uruchom program DrosophiLab i wybierz File> New Experiment. Wpisz nazwę eksperymentu mutacja vg a nazwę generacji zostaw bez zmian P1 . Kliknij na ikonę Male (samiec) i w oknie dialogowym wybierz vgmale.fly. Zrób te same czynności wybierając samicę (Female vgfemale.fly). Kliknij prawym przyciskiem myszy na białe pole opisane jako Counting jar (naczynie do zliczania muszek) i wybierz Add jar (dodaj naczynie) wpisując jednocześnie nazwę naczynia forma dzika . Dodaj jeszcze jedno naczynie i nazwij je jako forma vg . Kliknij OK żeby przejść do drugiego kroku. 24 Ćwiczenie 7 Krok 2. Kolejny etap to rozpoczęcie eksperymentu z wybranymi rodzicami. Osobniki te ukazane są w formie małych ikon oznaczonych jako P1. Aby obejrzeć wybrane muszki należy przeciągnąć je przy pomocy myszki na pole oznaczone Microscope. Oglądane osobniki można powiększyć poprzez przeciągnięcie w dół suwaka znajdującego się po prawej stronie pola obserwacyjnego. Ponadto, oglądane muszki można obrócić w dowolnym kierunku przytrzymując klawisz ctrl na klawiaturze. Aby usunąć muszkę spod mikroskopu należy kliknąć Empty microscope. Należy zwrócić uwagę, iż obydwie muszki posiadają normalne skrzydła. Aby zatwierdzić muszkę jako rodzica kliknąć na set as parent. Wybór muszki na rodzica jest potwierdzany przez różowe zabarwienie ikony muszki. Z górnego paska dialogowego wybierz Experiment>New generation. Wprowadz liczbę potomstwa Number of offspring (tym razem niech to będzie 20) i upewnij się, że poniżej zaznaczona jest opcja Icons (ikony). Inne możliwości pokazania wyników 25 Ćwiczenie 7 to Tabela (Table) lub wykres (Chart). Przejdz do kolejnego kroku poprzez kliknięcie OK. Krok 3. Potomstwo wybranych rodziców (w formie małych ikon) powinno znajdować się w oknie oznaczonym jako F1. Każdą potomną muszkę przeciągnij przy pomocy myszki pod mikroskop i sprawdz czy posiada ona normalne skrzydła czy też zredukowane. Muszki z normalnymi skrzydłami bezpośrednio spod mikroskopu przeciągnij do naczynia forma dzika natomiast muszki ze zredukowanymi skrzydłami przenieś do naczynia forma vg . Ile jest much z efektem mutacji vg a ile powinno być? II Eksperyment. Dziedziczenie cech recesywnych. Krok 1. Utwórz muszki o podanym poniżej genotypie przy pomocy Edytora Chromosomów: Tools>Chromosome Editor. Samiec (zaznacz opcję Male!): (w+) (vg+/vg+), zapisz (File>Save) w katalogu Flies (C:/Program Files\Drosohilab/Flies) jako dzikisamiec.fly . Samica (zaznacz opcję Female!): (w/w) (vg/vg), zapisz jako bialookasamica.fly. Krok 2. 26 Ćwiczenie 7 Utwórz nowy eksperyment (File>New Experiment) i wybierz samca (dzikisamiec.fly) i samicę (bialookasamica.fly). Potwierdz poprzez kliknięcie OK. Krok 3. Sprawdz pod mikroskopem czy wybrałeś odpowiednie osobniki, jeśli tak to zatwierdz je jako rodziców. Kontynuuj pracę Experiment>New generation, wpisz liczbę osobników potomnych (100), zaznacz format wyniku jako ikony (opcja Icone) i kliknij OK. Krok 4. Przeanalizuj wyniki, dodaj trzy naczynia do liczenia muszek (Experiment>Add counting jar), i nazwij je kolejno: białe oczy, czerwone oczy, bez skrzydeł. Ile osobników ma czerwone oczy (forma dzika), ile osobników ma białe oczy a ile powstało osobników ze zredukowanymi skrzydłami? Wyjaśnij otrzymane wyniki. Jakie genotypy i jakie fenotypy powinny posiadać osobniki potomne? Krok 5. Powtórz krok 2 i 3, Z potomstwa otrzymanego w krok 4, wybierz po jednym osobniku z czerwonymi oczami (forma dzika) oraz białymi oczami, wskaż je jako osobniki rodzicielskie. Utwórz pokolenie F2 (Experiment>New Generation). Wpisz liczbę osobników potomnych (100), wyniki utwórz w formie tabeli (opcja Table). Jakich genotypów i jakich fenotypów możemy się spodziewać? Jaki jest empiryczny stosunek otrzymanych fenotypów? Wykaz skrótów oznaczę fenotypów używanych przez program DrosophiLab w (white eyes) białe oczy rb (ruby eyes) rubinowe oczy t (tan body) żółtobrązowe ciało B (bar eyes) ograniczona wielkość oczu al (aristaless antena) urzęsione czułki Cy (curly wings) podwinięte skrzydła 27 Ćwiczenie 7 b (black body) czarne ciało p (purple eyes) purpurowe oczy vg (vestigial vings) zredukowane skrzydła L (lobe eyes) oczy ograniczone c (curved wings) zakrzywione skrzydła jv (javelin bristles) odstające rzęski se (sepia eyes) oczy w kolorze sepii th (thread arista) nitkowate czułki cu (curly wings) podwinięte skrzydła, jednocześnie czarne ciało sr (striped body) prążkowane ciało ci (cubitus interruptus veins) największe skrzydła poprzerywane, mniejsze w zaniku sv (shaven bristles) rzęski krótkie lub w zaniku 28 Ćwiczenie 8 Ćwiczenie 8. Geny autosomalne i sprzężone z płcią. Drosophila melanogaster jako obiekt badań genetycznych Przygotowanie hodowli Do próbówki wsypać 1 g IDM (Instant Drosophila Medium) (3,5-3,7ml objętości). Dodać 5 ml wody destylowanej. UWAGA! Ścianki próbówki muszą pozostać suche. Wszystkie naczynia muszą być całkowicie suche. Oznakuj probówki swoimi inicjałami, datą i zaznacz, jakie muchy tam hodujesz (gdzie Mel oznacza Drosophila melanogaster - czyli muszka owocowa): " Mel + (dzikie), " Mel Vg (bezskrzydłe), " Mel W (białookie), " Mel W/Vg (białookie, bezskrzydle). Jeżeli wykonujesz krzyżówki zaznacz w opisie płeć poszczególnych użytych osobników. Usypianie much przy użyciu anestetyku Fly Nap. Preparat Fly Nap to nowoczesny anestetyk stosowany do usypiania much. W przeciwieństwie wcześniej stosowanych środków jak: CO chloroform, jest on 2 , nieszkodliwy dla owadów. Jego użycie nie wpływa na przeżywalność larw, poczwarek i osobników dorosłych. Muchy uśpione preparatem Fly Nap pozostają w stanie narkozy przez okres 1-1,5 godziny. Jego prawidłowe zastosowanie uzależnione jest jednak od przestrzegania poniższej instrukcji. Przy usypianiu much anestetykiem Fly Nap można także skorzystać z rysunku zamieszczonego na sąsiedniej stronie. 1. Proszę przygotować: a. butelkę z preparatem Fly Nap i dozownik do preparatu Fly Nap, b. czarne pudełko na dozownik Fly Nap, c. płytkę szklaną (szalka Petriego), d. próbówki z rozrobioną pożywką wraz z korkiem, e. pędzelek. 2. Odkręcić butelkę z preparatem Fly Nap i umocz końcówkę dozownika Fly Nap w preparacie. Po umoczeniu końcówki dozownika DOKAADNIE ZAKRCIĆ 29 Ćwiczenie 8 butelkę! 3. Strząsnąć delikatnie muchy na dno próbówki. 4. Odsunąć częściowo korek próbówki i umieść dozownik poniżej korka (czynność tą trzeba wykonać szybko aby muchy nie uciekły z próbówki). 5. Ułożyć próbówkę z dozownikiem na stole w pozycji horyzontalnej. 6. Pozostawić dozownik Fly Nap pod korkiem próbówki na czas 8-iu minut. 7. Gdy muchy przestaną się ruszać usunąć jednocześnie korek i dozownik Fly Nap. Następnie dozownik umieścić w czarnym pudełku. 8. Wysypać muchy na szalkę Petriego. 9. Z pośród much znajdujących się w szalce wybrać interesujące nas osobniki. Selekcję much dokonujemy przy użyciu pędzelka. 10. Przy użyciu pędzelka przenieść wyselekcjonowane osobniki do nowej próbówki. 11. Zatkać próbówkę i pozostawić ją w pozycji horyzontalnej. 30 Ćwiczenie 8 Odróżnianie płci u Drosophila melcmogaster 1. Samice są nieco większe od samców. 2. Samice maja, prążkowany odwłok, szeroki i zaostrzony na końcu do składania jaj (Rys. 1). 3. Koniec odwłoka samca jest okrągły i prawie czarny w porównaniu do prążków samicy (Rys.2). U młodych muszek me widać tak wyraznej różnicy. 4. U samców na pierwszej parze odnóży znajdują. się tzw. sex combs - szereg gęstych czarnych szczecinek (Rys.3). Bierzemy pod uwagę dwie cechy muszki owocowej wykazujące zmienność 31 Ćwiczenie 8 " barwa oczu - biała (w) lub czerwona (+) " skrzydła - normalne (+) lub zredukowane (vg). Należy określić, które z tych cech sa dominujące, a które recesywne oraz ktore są autosomalne, a które sprzężone z płcią. W tym celu każda podgrupa wykona 2 różne krzyżówki miedzy osobnikami z różnych linii hodowlanych muszki. Przy analizowaniu wyników należy uwzględnić fakt, iż niektóre samice mogły zostać zapłodnione już w hodowli macierzystej, (jeżeli przebywały w niej dłużej niż 8 godzin od momentu opuszczenia poczwarki). Część potomstwa takiej samicy ( z jaj złożonych najwcześniej) nie będzie rezultatem założonej przez nas krzyżówki. Tej części potomstwa nie uwzględniamy w naszej analizie. W każdej podgrupie (połowa grupy) zakładane są dwie uzupełniające się krzyżówki: bialooka bezskrzydła samica (Mel w/vg) z samcem o fenotypie dzikim (Mel +) (czerwone oczy i normalne skrzydła) oraz krzyżówka odwrotna. Trzecia hodowla będzie założona wyłącznie z muszek dzikich w liczbie: 3 samce i 3 samice. 32 Ćwiczenie 9 Ćwiczenie 9. Modele doboru naturalnego w populacjach - symulacje komputerowe dotyczące zmian frekwencji alleli w populacji pod wpływem doboru naturalnego. Współczynnik reprodukcji (R): R = FxP, gdzie F oznacza liczbę potomków przypadających na jednego osobnika rodzicielskiego a P to prawdopodobieństwo przeżycia potomka do wieku reprodukcyjnego. Wartość przystosowawcza genotypu: jest to stosunek współczynnika reprodukcji danego genotypu do współczynnika reprodukcji najkorzystniejszego genoypu: W = R/Rmax. Dobór przeciw homozygotom recesywnym: (np. melanizm przemysłowy Biston betularia na obszarach zanieczyszczonych). W = W = 1, W = 1-s "q = -pq2s/1-sq2 AA Aa aa p,q frekwencje alleli A i a "q zmiana frekwencji allelu a Dobór przeciw homozygotom dominującym i heterozygotom: (np. forma nie-melanistyczna motyla Biston betularia na obszarach nie zanieczyszczonych) W = W = 1-s, W = 1 "q = -pq2s/1-ps(1+q) AA Aa aa Dobór przeciw obu homozygotom: (np. anemia sierpowata u człowieka na obszarach malarycznych) W = 1, W = 1 s , W = 1 - s Aa AA AA aa aa Dobór przeciw heterozygotom: W = 1, W = 1 + s Waa = 1 + s Aa AA AA, aa "q = pq(qsaa-ps )/1+p2s +q2s "q=0 punkt równowagi AA AA aa nietrwałej, przy niewielkim odchyleniu występuje tendencja do jego pogłębienia (dodatnie sprzężenie zwrotne). Dwa punkty równowagi trwałej: q=1, p=0 oraz q=0, p=1. POPULUS Celem ćwiczeń jest analiza wpływu naturalnej selekcji, dryfu genetycznego, 33 Ćwiczenie 9 migracji, mutacji oraz ich kombinacji na częstość występowania alleli w populacji. W ćwiczeniu analizowana będzie populacja myszy. Kolor sierści myszy kontrolowany jest przez jeden gen posiadający dwa allele. W przypadku tej cechy występuje nie pełna dominacja: homozygoty dominujące (AA) posiadają sierść koloru czarnego, heterozygoty (Aa) posiadają sierść koloru szarego a homozygoty recesywne (aa) mają sierść koloru białego. Zakłada się, że myszy żyją na wyspie bez drapieżnika. Frekwencja obu alleli jest identyczna, chyba że podane jest inaczej. Symulacja I Na bardzo dużą, odizolowana populację myszy, swobodnie się krzyżujących nie działają żadne czynniki mutagenne. Jeśli na wyspę przedostanie się drapieżnik (np. mysz) bardziej zagrożone są białe myszy. Celem symulacji jest określenie kierunku ewolucji wobec działania powyższego czynnika selekcyjnego. 1. Uruchom program Populus i przejdz do Model > Natural selections. Wybierz Selection on Diallelic Autosomal Locus. 2. Zaznacz opcję genotypic frequencies vs. t. 3. Wybierz Fitness (przystosowanie) i określ je dla każdego genotypu: AA przystosowanie 1.0 Aa przystosowanie 1.0 aa przystosowanie 0.7 4. Wybierz jedną początkową frekwencję (One Initial Frequency) i wpisz 0.5. Ustaw liczbę generacji (Generations) na 130. 5. Naciśnij View. 6. Odpowiedz na następujące pytania: a) Określ linie dotyczące poszczególnych genotypów. Jak należy je interpretować? b) Jeśli przystosowanie genotypów AA i Aa jest takie same dlaczego frekwencja genotypu AA wzrasta a genotypu Aa obniża się? c) Jeśli genotyp aa jest "zły" dlaczego nie zanikł zupełnie? Wróć do Plot Options i zaznacz "p vs. t". Pozwoli to zbadać jak zmienia się frekwencja allelu A (p) w czasie. Co można zaobserwować? 34 Ćwiczenie 9 d) Zmień początkową frekwencję allelu A na 0.1 i zaznacz ponownie genotypic frequencies vs. t (pozostaw resztę bez zmian). Przypuszczamy, iż ilość białych myszy (genotyp aa) przewyższała ilość ciemnych myszy na wyspie przed przybyciem drapieżnika. Dlaczego linia genotypu aa obniżyła się tak szybko. Dlaczego frekwencja genotypu Aa początkowo wzrastała a potem się obniżyła? e) Jakie wnioski dotyczące działania selekcji można wyciągnąć na podstawie przeprowadzonych symulacji. Symulacja II Symulacji poddana będzie ta sama, duża, odizolowana, swobodnie krzyżująca się populacja myszy, w której nie występują żadne mutacje wpływające na kolor ich sierści. Najbardziej narażone na działanie drapieżnika są osobniki białe, potem czarne a na końcu szare. Wybierz opcję Selection on a Diallelic Autosomal Locus ustawiając resztę opcji jak w poprzedniej symulacji (initial frequency 0.5) Przystosowanie (Fitness) ustaw w następujący sposób: AA - 0.9 Aa - 1.0 aa - 0.7 Jakie są główne różnice między wynikami tej a poprzedniej symulacji ? Symulacja III W niniejszej symulacji ta sama odizolowana populacja myszy, swobodnie krzyżująca się ma niewielką liczebność. Brakuje mutacji wpływających na kolor sierści nie ma też różnic w przeżywalności różnych form barwnych. 1. Wybierz model Mendelian Genetics i Genetic Drift . Wybierz zakładkę Monte Carlo i ustaw opcję w następujący sposób: a) Runtime = 3N generations b) Loci = 6 35 Ćwiczenie 9 c) Initial frequency = 0.5 d) Population size = 500 2. Naciśnij View. Linia każdego koloru oznacza przypadkowo wybrany allel genomu myszy. Allele te są niezależne od siebie i nie wpływają one na przeżywalność. 3. Przeprowadz 18 prób (Iterate): sześć dla populacji 500 osobników, sześć dla populacji 50 osobników i sześć dla populacji liczącej 5 osobników. 4. Dla każdej próby zanotuj następujące informacje: a) Wielkość populacji (Population size - N) b) Liczbę generacji do momentu osiągnięcia frekwencji równej 1 lub zero przez pierwszy z alleli (Fixation) c) Kolor allelu który jako pierwszy osiągnął frekwencję 1 lub zero d) W ilu przypadkach doszło najpierw do osiągnięcia frekwencji 0 a w ilu przypadkach frekwencji 1 5. Odpowiedz na następujące pytania: a) Czy we wszystkich próbach frekwencje alleli przebiegały w ten sam sposób? Dlaczego tak, dlaczego nie? b) Czy frekwencje poszczególnych alleli wyglądały tak samo w różnych próbach? Dlaczego tak, dlaczego nie? c) Jak duże były różnice w czasie osiągnięcia przez pierwszy allel frekwencji 1 lub zero? d) Jeśli allele te nie są związane z selekcją to dlaczego zmienia się ich frekwencja? e) Bardzo często uważa się dryft genetyczny związany jest tylko z małymi populacjami. Jednakże ma on również wpływ na duże populacje ale wpływa na nie w sposób mniej zauważalny. f) Symulacja ta pokazuje zmianę frekwencji alleli w czasie. Czy można powiedzieć, że w taki sposób przebiega ewolucja? g) Czy można przewidzieć dla danej populacji kiedy dojdzie do utraty konkretnego allelu? Symulacja IV 36 Ćwiczenie 9 Dryf genetyczny a selekcja. W rzeczywistości dryf genetyczny i selekcja działają zazwyczaj jednocześnie, są one dwoma najważniejszymi czynnikami ewolucyjnymi. W omawianej populacji myszy wraz z przybyciem na wyspę drapieżnika selekcja działa przeciwko białym myszom (aa), jednakże nie jest to cecha letalna - myszy białych jest o 10% mniej niż ciemnych. 1. W opcji Mendelian Genetics zaznacz Drift and Selection. Wprowadz dane: a) N = 500, p = 0.1, Generations = 500 b) AA = 1.0 Aa = 1.0 aa = 0.9 2. Zanim sprawdzisz wynik rozważ: jeśli nie działa dryf genetyczny czy allel a zostanie wyparty z populacji? 3. Naciśnij View i zobacz co stanie się po 500 generacjach. Przeprowadz 5 symulacji obserwując za każdym wyniki. Jaki jest wynik? Czy za każdym razem wyniki były takie same? Dlaczego wartość allelu A osiągnęła 1? 4. Selekcja (obecność drapieżnika) spowodowała że frekwencja allelu A wzrosła. Jednakże jak widać było w symulacji pierwszej linia wzrostu frekwencji tego allelu nie jest prosta. Wzrost jest bardzo niejednorodny - jest to wynikiem działania dryfu genetycznego. 5. Teraz zmień wielkość populacji na 50 i naciśnij View. Co się dzieje w mniejszej populacji? 6. Przeprowadz 5 symulacji. Czy otrzymane wyniki podobne są do tych, które były uzyskane dla większej populacji. 7. Gdy wielkość populacji wynosiła 500 bez wątpienia można było zauważyć, że frekwencja allelu A wzrastała do momentu przekroczenia wartości 1. Najprawdopodobniej sytuacja powtórzyła się, gdy wielkość populacji wynosiła 50. 8. Czy populacja myszy na wyspie ewoluowała? Jeśli tak to jakie były mechanizmy tej ewolucji? 9. Co otrzymane wyniki mogą powiedzieć o działaniu dryfu genetycznego i selekcji w małej i dużej populacji? 37 Ćwiczenie 10 Ćwiczenie 10. Analiza wyników hodowli muszki owocowej (ćwiczenie 8). Genotyp a środowisko: wpływ zagęszczenia populacji na masę ciała Drosophila melanogaster - zakładanie hodowli muszki owocowej A. Analiza wyników krzyżówek z ćwiczenia 8. a) Geny autosomalne i sprzężone z płcią. Analiza wyników doświadczenia 1. Usypiamy muchy i rozdzielamy według płci. 2. Analizujemy fenotyp uzyskanych w pokoleniu F1 samców i samic. 3. Ustalamy, do której z rubryk tabeli z ćwiczenia 3 pasują otrzymane wyniki. 4. Wyciągamy wnioski na temat mechanizmu dziedziczenia badanych dwu cech u muszki owocowej. B. Genotyp a środowisko. Wpływ zagęszczenia populacji na masę ciała muszki owocowej (Drosophila melanogaster). Założenie doświadczenia Każda podgrupa zakłada 3 hodowle (każda para po 1, o wyższym lub niższym zagęszczeniu much) " 2 samce + 2 samice (6 hodowli w całej grupie) (zagęszczenie 1) " 6 samców + 6 samic (6 hodowli w całej grupie) (zagęszczenie 2) Po 48h muchy rodzicielskie zostaną usunięte z próbówek przez osobę prowadząca ćwiczenia. Wszystkie muchy potomne uzyskane po 2 tygodniach będą należały do pokolenia F1. 38 Ćwiczenie 11 Ćwiczenie 11. Zastosowania badań polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w genetyce przeprowadzenie rozdziału produktu PCR w żelu agarozowym. Przeprowadzony zostanie rozdział fragmentów DNA zawierających mikrosatelity OMM 1007, OMM 1008, OMM 1036 i OMM 1037, amplifikowane uprzednio techniką PCR. Rozdział produktu PCR zostanie przeprowadzony w żelu agarozowym o stężeniu 1,5%. WYKONANIE ĆWICZENIA Przygotowane żelu agarozowego. Uwaga wszystkie poniższe prace należy wykonać w rękawiczkach lateksowych. 1. Włącz wagę elektroniczną wskazaną prze prowadzącego ćwiczenia. 2. Umieść kolbę Erlenmeyer-a o pojemności 250 ml na wadze i wytaruj wagę. 3. Za pomocą łyżeczki wsyp do kolby 1,5g agarowy. 4. Za pomocą cylindra z napisem TBE odmierz 100 ml buforu 1X TBE i wlej do kolby. 5. Umieść magnes w kolbie. 6. Włącz mieszadło elektromagnetyczne wskazane przez prowadzącego ćwiczenia, postaw kolbę na mieszadle. 7. Ustaw częstotliwość mieszania na 450 obr /min i mieszaj przez 1 minutę. 8. Ustaw pokrętło prędkości mieszania na 0 i przenieś kolbę do kuchenki mikrofalowej. 9. Zagotuj zawartość kolby. W momencie osiągnięcia temperatury wrzenia natychmiast wyłącz kuchenkę. Nie wolno dopuścić do wykipienia zawartości kolby! 10. Załóż rękawicę kuchenną, wyciągnij kolbę z mikrofalówki, postaw na stole pod wyciągiem, ustaw temperaturę płyty mieszadła elektromagnetycznego na o 150 C. 39 Ćwiczenie 11 11. Prowadzący doda do kolby 5l bromku etydyny. Uwaga: bromek etydyny jest bardzo silnym mutagenem! Niebezpieczny jest kontakt ze skórą oraz wdychanie oparów. 12. Kolbę trzeba przykryć folia aluminiową (niebezpieczeństwo oparów bromku etydyny!). 13. Ustaw kolbę na mieszadle elektromagnetycznym, mieszaj 5 minut częstotliwością 450 rpm w takcie mieszania przygotuj sanki do wylania żelu zgodnie ze wskazówkami prowadzącego. 14. Wyłącz mieszadło elektromagnetyczne, pokrętło temperatury płyty ustaw na 0. Przygotowanie rozdziału elektroforetycznego. 1. Jeśli w kolbie żel zastygł, konieczne będzie jego roztopienie. Zdejmij aluminiową folię z szyjki kolby. Wstaw kolbę do mikrofalówki i podgrzewaj ją do momentu osiągnięcia przez żel temperatury wrzenia. Pamiętaj! Nie wolno dopuścić do wykipienia zawartości kolby! W trakcie ogrzewania musisz stale kontrolować jej zawartość. Bądz gotowy do natychmiastowego wyłączenia mikrofalówki momencie zagotowania się żelu. 2. Prowadzący ćwiczenia przygotuje sanki i wleje do nich odpowiednią objętość przygotowanego żelu. Pamiętaj! Żel agarozowym o stężeniu 1,5% potrzebuje około 15 minut do zastygnięcia. Przygotowanie i naniesienie próbek do żelu oraz przeprowadzenie elektroforezy odcinków DNA zawierających fragmenty mikrosatelitarne. 1. Prowadzący ćwiczenia odmierzy za pomocą pipety automatycznej po 1l buforu obciążającego dla każdej przygotowywanej próbki. Następnie do pierwszej kropli doda 0,3l wzorca masowego oraz 5l wody dejonizowanej. 2. Dodaj do pozostałych kropli buforu obciążającego 5l roztworu z próbek przyniesionych przez prowadzącego. Zmień końcówkę pipety w momencie gdy zakończysz sporządzanie próbek pierwszego spośród badanych fragmentów mikrosatelitarnych. 3. Wstaw sanki do aparatu wskazanego przez prowadzącego. Nanieś próbki do studzienek w żelu agarozowym. 40 Ćwiczenie 11 4. Prowadzący dobierze parametry napięcia i natężania prądu zasilającego aparat do elektroforezy oraz czas trwania elektroforezy. 5. Aby rozpocząć elektroforezę naciśnij przycisk "run" na zasilaczu. W trakcie trwania elektroforezy wysłuchaj uważnie prezentacji prowadzącego ćwiczenia na temat zastosowania badań polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w genetyce ryb. Wizualizacja i interpretacja uzyskanych wyników. 1. Po zakończeniu elektroforezy prowadzący przeniesie sanki z żelem na transiluminator, uruchomi komputer i program Kodak 1D Image Software. Przy użyciu podłączonej do komputera kamery i drukarki wykona odbitkę fotograficzną otrzymanego elektroforogramu. 2. Na postawie wzorca masowego i zostanie przeprowadzone szacowanie długości zamplifikowanych fragmentów DNA. 3. Porównaj długość zamplifikowanych fragmentów i wyciągnij wnioski dotyczące różnic długości analizowanych fragmentów. 41 Ćwiczenie 12 Ćwiczenie 12. Obliczanie dystansu genetycznego z zastosowaniem modelu: wariancji średnich rozmiarów alleli (2) zadania rachunkowe Model wariancji kwadratów średnich rozmiarów alleli został opracowany przez roku Goldstein i in. (1995) jest stosowany do obliczeń dystansu genetycznego istniejącego pomiędzy populacjami. Model ten umożliwia precyzyjne obliczenie dystansu genetycznego istniejącego pomiędzy próbami o różnej liczebności. gdzie: - wariancja r - Średni rozmiar alleli w badanym locus mierzony (2)= "( - y )2 x liczbą powtórzeń motywu podstawowego j x - populacja x, y populacja y Przykładowa frekwencja występowania alleli w locus mikrosatelitarnym w populacjach X i Y Rozmiar Frekwencja allelu Rozmiar allelu allelu (r.m.) (bp.) populacja X populacja Y 98 49 0,24 0,06 102 51 0,08 0,14 106 53 0,32 0,01 110 55 0,14 0,32 114 57 0,18 0,20 118 59 0,04 0,12 126 63 0 0,15 Rozmiar każdego allelu mnożymy przez jego frekwencję odpowiednio dla populacji X i Y. stąd: 49 * 0,24 = 11,76 i 49 * 0,06 = 2,94 42 Ćwiczenie 12 następnie podstawiając do wzoru r (2)= - y )2 "(x j otrzymujemy: 2 ( ) = ((11,76 + 4,08 +16,96 + 7,7 +10,26 + 2,36) - (2,94 + 7,14 + 0,53 +17,6 +11,4 + 7,08 + 9,45))2 czyli 2 = 9,12 Zadanie 1. Na podstawie frekwencji alleli tabeli frekwencji alleli Oblicz dystans genetyczny istniejący pomiędzy następującymi populacjami przy wykorzystaniu modelu wariancji kwadratów średnich rozmiarów alleli. A). Rozmiar Frekwencja allelu Rozmiar allelu allelu (bp.) (r.m.) populacja X populacja Z 98 49 0,24 0,23 102 51 0,08 0,10 106 53 0,32 0,36 110 55 0,14 0,14 114 57 0,18 0,16 118 59 0,04 0,01 43 Ćwiczenie 12 B). Rozmiar Frekwencja allelu Rozmiar allelu allelu (bp.) (r.m.) populacja Z populacja Y 98 49 0,23 0,06 102 51 0,10 0,14 106 53 0,36 0,16 110 55 0,14 0,32 114 57 0,16 0,20 118 59 0,01 0 126 63 0 0,12 Zadanie 2. Umieść w odpowiednich miejscach dendrogramu populacje X, Y i Z. Uzasadnij swoją decyzję. Jak można zinterpretować uzyskane wyniki? 44 Ćwiczenie 12 Literatura Goldstein D.B., Ruiz Linares A., Cavalli-Sforza L.L, Feldman M.W. 1995. An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics, 139: 463-471. 45 Ćwiczenie 13 Ćwiczenie 13. Kolokwium. Na kolokwium obowiązują wiadomości z ćwiczeń 1 12. ] 46 Ćwiczenie 15 Ćwiczenie 14. Genotyp a środowisko. Wpływ zagęszczenia populacji na masę ciała muszki owocowej (Drosophilamelanogaster) - weryfikacja hipotezy przy pomocy testu t-Studenta wnioski. PRZEPROWADZENIE ĆWICZENIA Po 2 tygodniach w każdej grupie doświadczalnej oddzielnie: -muchy usypiamy i rozdzielamy według płci, -liczymy samce i samice, -ważymy oddzielnie samce i samice w ramach grupy doświadczalnej, -obliczmy średnia masę w próbie samców i samic dzieląc całkowitą masę próby przez liczbę much w próbie. Jeżeli średnia masa muchy będzie mniejsza niż 0,5 mg lub większa niż 2 mg, powtórzyć ważenie. Zanotować uzyskane dane w zeszycie. Wszystkie obliczenia prowadzimy oddzielnie dla samców i samic, ponieważ średnia masa samców jest o około 20% niższa niż samic. ZADANIE Porównaj testem t-Studenta masę ciała samic z najmniejszego i największego zagęszczenia. podgrupa zagęszczenie 2+2 zagęszczenie 6+6 samce samice samce samice 1 2 3 47 Ćwiczenie 15 4 Wartość statystyki t obliczoną przez nas porównujemy z krytyczna wartością z tabeli ,,poziom istotności dla testu dwustronnego dla poziomu istotności 0,05. Liczba stopni swobody df=N1+N2-2, gdzie N1 i N2 to liczby powtórzeń, odpowiednio dla zagęszczenia 1 (2+2) i 2 (6+6) X1, X2 - średnie arytmetyczne X1 - X 2 t = Sx Sx - błąd standardowy Błąd standardowy obliczamy ze wzoru: S1 S2 Sx = + N1 N2 gdzie S1 i S2 to wariancje, odpowiednio dla zagęszczenia 1 (2+2) oraz 2 (6+6). Aby obliczyć Sx musimy mieć najpierw S1 i S2 (wariancje). Obliczamy je ze wzoru: 2 X - ( X )2 / N " " S = N -1 Gdy obliczymy wariancję S1 i S2, wstawiamy je do wzoru na błąd standardowy (N1 i N2 są liczbami powtórzeń w każdym zagęszczeniu). Obliczamy każdą wariancję oddzielnie wstawiając dla S1 odpowiednio X1 i N1 a dla S2 - X2 oraz N2. Gdy obliczymy Sx, wstawiamy do wzoru na t i obliczamy wartość statystyki t. Znajdujemy w tabeli wartość krytyczna.: Liczba stopni swobody df = N1+ N2 -2. Poziom istotności dla testu dwustronnego ą = 0,05 Następnie możemy zweryfikować hipotezę zerowa, która brzmi: HO = ,,Brak jest istotnych różnic pomiędzy średnimi masami ciała osobników żyjących w różnych zagęszczeniach". Jeżeli obliczona przez nas wartość statystyki t jest niższa od wartości krytycznej, to: Nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy zerowej. 48 Ćwiczenie 15 Jeżeli obliczona wartość t jest wyższa od krytycznej to: Hipotezę zerowa należy odrzucić na rzecz hipotezy alternatywnej, która brzmi: ,,Występują istotne różnice pomiędzy średnimi masami ciała osobników żyjących w różnych zagęszczeniach". 49 Ćwiczenie 15 Ćwiczenie 15. Niepełna dominacja i addycja dwu loci genowych. Prawo Hardy'ego-Weinberga dla dwu loci genowych Molinezja (Poecilia sphenops) wykazuje polimorfizm genetyczny pod względem ubarwienia ciała oraz kształtu płetw. W locus L odpowiedzialnym za kształt płetw molinezji znajdują się 2 allele L i l. Niepełna dominacja L nad 1 sprawia, ze 3 genotypom odpowiadają 3 fenotypy przedstawione na rysunku: fenotyp genotyp A ll B Ll C LL Frekwencje poszczególnych alleli (p i q) w populacji obliczamy korzystając z danych doświadczalnych (obserwowane częstości fenotypów). W przypadku cechy kształtu płetw: 2nLL + nlL p = 2N P = f(L); q = r(l) gdzie f to frekwencja allelu. gdzie: nLL, nLl to liczba osobników o odpowiednim genotypie i odpowiadającym mu fenotypie, N to liczba badanych osobników. Frekwencję allelu recesywnego (q) oblicza się z zależności p + q = 1 Równanie Hardy-Weinberga dla pary alleli w pojedynczym locus przyjmuje postać 50 Ćwiczenie 15 (p+q)2 =1, co po rozwinięciu daje: p2 + 2pq + q2 = 1 gdzie p = frekwencja allelu A natomiast q = frekwencja allelu a Trzy wyrażenia z lewej strony równania odpowiadają oczekiwanym proporcjom poszczególnych (3) fenotypów molinezji w badanej populacji (odpowiednio: p2 homozygot LL, 2pq heterozygot i q2 homozygot ll). Po pomnożeniu każdego z tych wyrażeń przez N (liczba badanych osobników) otrzymamy odpowiednio oczekiwane liczby osobników każdego fenotypu wynikające z równania Hardy- Weinberga, ktore zapisujemy w prawej kolumnie. W lewej kolumnie zapisujemy rzeczywiste (obserwowane) liczby osobników o określonych fenotypach. Następnie otrzymane wartości z obu kolumn podstawiamy do wzoru i obliczmy według modelu 2 (chi-kwadrat). - Exp)2 2 = "(ObsExp gdzie: Obs to liczba obserwowanych osobników o określonym fenotypie Exp to liczba oczekiwanych osobników o określonym fenotypie (w tym przypadku suma Z będzie zawierała 3 składniki) Wartość krytyczna statystyki y1 na poziomie istotności a = 0,05 wynosi w tym przypadku 3,84 (liczba stopni swobody: K - l - s = 3-1-1 = 1) P + q= 1 stad p -zmienna niezależna: p + (1 - p) = 1, albo q -zmienna niezależna: q + (1-q) = 1 Jeżeli obliczona wartość statystyki przekroczy wartość krytyczną (3,84) to istnieją podstawy do odrzucenia hipotezy zerowej (ze populacja molinezji znajduje się w równowadze Hardy- Weiberga) na rzecz hipotezy alternatywnej. W takim przypadku należy zastanowić się nad przyczynami takiej struktury genetycznej populacji. Jakie czynniki mogły to wywołać? Zadanie przykładowe Za ubarwienie ciała odpowiadają dwie pary alleli w dwu loci genowych. Fenotyp każdego osobnika jest sumą oddziaływania alleli zlokalizowanych w locus M i N. Takie współoddziaływanie dwóch lub więcej loci genowych nazywamy addycją. W każdym z dwu loci (M i N) występują u Poecilia sphenops po 2 allele, odpowiednio: M 51 Ćwiczenie 15 i m oraz N i n. Dominujące allele M i N warunkują melanistyczne (czarne) ubarwienie ryb, natomiast allele recesywne m i n (allele dzikie) warunkują srebrnoszare ubarwienie ciała ryb. Fenotyp każdego osobnika zależy od liczby alleli dominujących (M i N) w obu loci genowych odpowiedzialnych za barwę ciała (liczba ta może wynosić 0,1, 2, 3 lub 4). 9 możliwych kombinacji genotypów daje w efekcie 5 fenotypów: mmnn fenotyp I Mmnn fenotyp II mmNn MMnn MmNn fenotyp III mmNN MMNn fenotyp IV MmNN MMNN fenotyp V Ubarwienie ryb zmienia się także wraz z wiekiem. Im ryby są starsze tym bardziej ujawnia się ubarwienie melanistyczne. U bardzo młodych osobników fenotypy I II nie różnią się od siebie -ryby są jednolicie srebrzystoszare. U dojrzałych ryb w starszym wieku bardzo trudno odróżnić fenotypy IV i V - ryby te są jednolicie czarne. Najlepsze do analizowania zmienności genetycznej ubarwienia są osobniki 2-4 centymetrowe. Ryby tej wielkości dają się podzielić wyraznie na 5 różnych fenotypów (w zależności od natężenia ubarwienia melanistycznego). " Fenotyp I ryby jednolicie srebrzystoszare (niezależnie od wieku). Fenotyp II ryby srebrzystoszare z mniej lub bardziej licznymi czarnymi plamami na ciele (z wiekiem ich przybywa). " Fenotyp III ryby o ciele czarnym z mniej lub bardziej licznymi rozjaśnieniami (z wiekiem ich ubywa). Tęczówka oka i brzuch srebrzyste przez całe życie. " Fenotyp IV ryby prawie całkowicie czarne, prześwitujące rozjaśnienia głownie w 52 Ćwiczenie 15 tęczówce oka i dolnej części pokryw skrzelowych (z wiekiem zanikające i trudno zauważalne). " Fenotyp V ryby całkowicie czarne (niezależnie od wieku). W przypadku opisanej wyżej addycji 2 loci u molinezji przyjmujemy: p - frekwencja alleli M i N (łącznie) q - frekwencja alleli m i n (łącznie) w "podwójnym" locus MN W przypadku cechy melanizmu frekwencja alleli M + N (p) wynosi zatem: nV + 0,75nIV + 0,5nIII + 0,25nII p = N gdzie n to liczba osobników o fenotypie i w badanej populacji ryb. i N to liczba badanych osobników. W tej sytuacji równanie Hardy-Weinberga przyjmuje postać: [(P + q)2]2 = 1 czyli (P + q)4 = 1 gdzie: P = f(M + N) (frekwencja łączna alleli M i N) q = f(m + n) p + q = 1 po rozwinięciu otrzymujemy równanie: p4 + 4p3q + 6p2q2 + 4pq3 + q4 = 1 Pięć wyrażeń z lewej strony równania odpowiada oczekiwanym proporcjom poszczególnych fenotypów molinezji w badanej populacji. Po pomnożeniu każdego z tych wyrażeń przez N (liczba badanych osobników) otrzymamy odpowiednio oczekiwane liczby osobników każdego fenotypu wynikające z równania Hardy- Weinberga, które zapisujemy w prawej kolumnie. Po przeliczeniu ryb znajdujących się w akwariach, w lewej kolumnie zapisujemy rzeczywiste (obserwowane) liczby osobników o określonych fenotypach. Następnie otrzymane wartości z obu kolumn podstawiamy do wzoru i obliczmy według modelu 2 - Exp)2 2 = "(ObsExp 53 Tablice gdzie: Obs to liczba obserwowanych osobników o określonym fenotypie Exp to liczba oczekiwanych osobników o określonym fenotypie (w tym przypadku suma będzie zawierała 5 składników). Wartość krytyczna statystyki 2 na poziomie istotności a = 0,05 wynosi w tym przypadku = 7,81 (liczba stopni swobody: K l - s = 5 - 1 - 1 = 3) p + q= 1 stad p -zmienna niezależna: p + (1 - p) = 1, albo q -zmienna niezależna: q + (1 - q) = 1 Jeżeli obliczona wartość statystyki 2 przekroczy wartość krytyczną (7,81) to istnieją podstawy do odrzucenia hipotezy zerowej (ze populacja molinezji znajduje się w równowadze Hardy-Weiberga) na rzecz hipotezy alternatywnej. W takim przypadku należy zastanowić się nad przyczynami takiej struktury genetycznej populacji. Jakie czynniki mogły to wywołać? 54 Tablice Załącznik A Tablica wartości t Stopnie swobody Prawdopodobieństwo 0.5 0.1 0.05 0.02 0.01 0.001 1 1,00 6,31 12,71 31,82 63,66 63,70 2 0,82 2,92 4,30 6,96 9,92 31,60 3 0,77 2,35 3,18 4,54 5,84 12,90 4 0,74 2,13 2,78 3,75 4,60 8,61 5 0,73 2,02 2,57 3,36 4,03 6,86 6 0,72 1,94 2,45 3,14 3,71 5,96 7 0,71 1,90 2,36 3,00 3,50 5,40 8 0,71 1,86 2,31 2,90 3,36 5,04 9 0,70 1,83 2,26 2,82 3,25 4,78 10 0,70 1,81 2,23 2,76 3,17 4,59 11 0,70 1,80 2,20 2,72 3,11 4,44 12 0,70 1,78 2,08 2,68 3,06 4,32 13 0,69 1,77 2,16 2,65 3,01 4,22 14 0,69 1,76 2,14 2,62 2,98 4,14 15 0,69 1,75 2,13 2,60 2,95 4,07 16 0,69 1,75 2,12 2,58 2,92 4,02 17 0,69 1,74 2,11 2,57 2,90 3,96 18 0,69 1,73 2,10 2,55 2,88 3,92 19 0,69 1,73 2,09 2,54 2,86 3,88 20 0,69 1,72 2,09 2,53 2,84 3,85 21 0,69 1,72 2,08 2,52 2,83 3,82 22 0,69 1,72 2,07 2,51 2,82 3,79 23 0,69 1,71 2,07 2,50 2,81 3,77 24 0,69 1,71 2,06 2,49 2,80 3,74 25 0,68 1,71 2,06 2,48 2,79 3,72 26 0,68 1,71 2,06 2,48 2,78 3,71 27 0,68 1,70 2,05 2,47 2,77 3,69 28 0,68 1,70 2,05 2,47 2,76 3,67 29 0,68 1,70 2,04 2,46 2,76 3,66 30 0,68 1,70 2,04 2,46 2,75 3,65 35 0,68 1,69 2,03 2,44 2,72 3,59 40 0,68 1,68 2,02 2,42 2,71 3,55 45 0,68 1,68 2,02 2,41 2,69 3,52 50 0,68 1,68 2,01 2,40 2,68 3,50 60 0,68 1,67 2,00 2,39 2,66 3,46 70 0,68 1,67 2,00 2,38 2,65 3,44 80 0,68 1,66 1,99 2,38 2,64 3,42 90 0,68 1,66 1,99 2,37 2,63 3,40 100 0,68 1,66 1,98 2,36 2,63 3,39 120 0,68 1,66 1,98 2,36 2,62 3,37 150 0,68 1,66 1,98 2,35 2,61 3,36 200 0,68 1,65 1,97 2,35 2,60 3,34 300 0,68 1,65 1,97 2,34 2,59 3,32 400 0,68 1,65 1,97 2,34 2,59 3,32 500 0,67 1,65 1,96 2,33 2,59 3,31 1000 0,67 1,65 1,96 2,33 2,58 3,30 55 Tablice Załącznik B 2 Tablica wartości chi-kwadrat ( ) Stopnie Prawdopodobieństwo swobody 0,99 0,95 0,5 0,25 0,1 0,05 0,025 0,01 0,005 1 - - 0,45 1,32 2,71 3,84 5,02 6,63 7,88 2 0,02 0,10 1,39 2,77 4,61 5,99 7,38 9,21 10,60 3 0,11 0,35 2,37 4,11 6,25 7,81 9,35 11,34 12,84 4 0,30 0,71 3,36 5,39 7,78 9,49 11,14 13,28 14,86 5 0,55 1,15 4,35 6,63 9,24 11,07 12,83 15,09 16,75 6 0,87 1,64 5,35 7,84 10,64 12,59 14,45 16,81 18,55 7 1,24 2,17 6,35 9,04 12,02 14,07 16,01 18,48 20,28 8 1,65 2,73 7,34 10,22 13,36 15,51 17,53 20,09 21,96 9 2,09 3,33 8,34 11,39 14,68 16,92 19,02 21,67 23,59 10 2,56 3,94 9,34 12,55 15,99 18,31 20,48 23,21 25,19 11 3,05 4,57 10,34 13,70 17,28 19,68 21,92 24,72 26,76 12 3,57 5,23 11,34 14,85 18,55 21,03 23,34 26,22 28,30 13 4,11 5,89 12,34 15,98 19,81 22,36 24,74 27,69 29,82 14 4,66 6,57 13,34 17,12 21,06 23,68 26,12 29,14 31,32 15 5,23 7,26 14,34 18,25 22,31 25,00 27,49 30,58 32,80 16 5,81 7,96 15,34 19,37 23,54 26,30 28,85 32,00 34,27 17 6,41 8,67 16,34 20,49 24,77 27,59 30,19 33,41 35,72 18 7,01 9,39 17,34 21,60 25,99 28,87 31,53 34,81 37,16 19 7,63 10,12 18,34 22,72 27,20 30,14 32,85 36,19 38,58 20 8,26 10,85 19,34 23,83 28,41 31,41 34,17 37,57 40,00 21 8,90 11,59 20,34 24,93 29,62 32,67 35,48 38,93 41,40 22 9,54 12,34 21,34 26,04 30,81 33,92 36,78 40,29 42,80 23 10,20 13,09 22,34 27,14 32,01 35,17 38,08 41,64 44,18 24 10,86 13,85 23,34 28,24 33,20 36,42 39,36 42,98 45,56 25 11,52 14,61 24,34 29,34 34,38 37,65 40,65 44,31 46,93 26 12,20 15,38 25,34 30,43 35,56 38,89 41,92 45,64 48,29 27 12,88 16,15 26,34 31,53 36,74 40,11 43,19 46,96 49,64 28 13,56 16,93 27,34 32,62 37,92 41,34 44,46 48,28 50,99 29 14,26 17,71 28,34 33,71 39,09 42,56 45,72 49,59 52,34 30 14,95 18,49 29,34 34,80 40,26 43,77 46,98 50,89 53,67 40 22,16 26,51 39,34 45,62 51,80 55,76 59,34 63,69 66,77 50 29,71 34,76 49,33 56,33 63,17 67,50 71,42 76,15 79,49 60 37,48 43,19 59,33 66,98 74,40 79,08 83,30 88,38 91,95 70 45,44 51,74 69,33 77,58 85,53 90,53 95,02 100,42 104,22 80 53,54 60,39 79,33 88,13 96,58 101,88 106,63 112,33 116,32 90 61,75 69,13 89,33 98,64 107,56 113,14 118,14 124,12 128,30 100 70,06 77,93 99,33 109,14 118,50 124,34 129,56 135,81 140,17 56