ROZDZIELCZA CZASOWO DETEKCJA FOSFORESCENCJI
TLENU SINGLETOWEGO
Cel ćwiczenia:
a) Detekcja tlenu singletowego poprzez pomiar charakterystycznej fosforescencji przy
1268 nm.
b) Wyznaczenie stałej szybkości wygaszania tlenu singletowego przez ą-tokoferol
i �-karoten.
c) Pomiar wydajności kwantowej generacji tlenu singletowego przez porfirynę.
Wprowadzenie
W stanie podstawowym cząsteczka tlenu ma dwa elektrony na dwóch orbitalach
antywiążących ; a ich spiny są równoległe.
Całkowity spin S cząsteczki tlenu wynosi zatem � + � = 1, a liczba poziomów energetycznych
(multipletowość) w zewnętrznym polu magnetycznym wynosi 2S + 1 = 3. Oznacza to, że tlen
w stanie podstawowym jest trypletem 3O2 (3Łg-). Większość związków organicznych, z którymi
tlen mógłby reagować w komórkach to związki w stanie singletowym: wszystkie elektrony ich
cząsteczek mają spiny sparowane i wypadkowy spin każdej cząsteczki tych związków równy jest
zeru. Aby cząsteczka tlenu w stanie trypletowym utleniła inną cząsteczkę i uległa
dwuelektronowej redukcji, musiałaby przyjąć od utlenianej cząsteczki dwa elektrony. Zgodnie
z prawami mechaniki kwantowej, oba te elektrony musiałyby mieć równoległe spiny,
antyrównoległe w stosunku do spinów dwóch niesparowanych elektronów na antywiążących
orbitalach ;x* i ;y*. Innymi słowy, wymaga to, by utleniana cząsteczka była również w stanie
trypletowym, bądz
też by nastąpiło odwrócenie spinu jednego z elektronów takiej cząsteczki (co
jest procesem silnie wzbronionym). Dlatego też możliwości reakcji cząsteczki tlenu są
ograniczone; W reakcjach z wieloma cząsteczkami, które mogą ulegać utlenieniu, tlen jest
znacznie mniej reaktywny niż by to wynikało z termodynamiki tych procesów. Tlen
cząsteczkowy staje się o wiele bardziej reaktywny po wzbudzeniu elektronowym do stanu
singletowego (1"g, 3Łg+). Podwyższenie reaktywności tlenu w stanie singletowym wynika
zarówno ze zniesienia zakazu spinowego w reakcjach z cząsteczkami w stanie singletowym, jak
i z nadmiaru energii, którą cząsteczka tlenu singletowego, jako elektronowo wzbudzona posiada.
Poziomy energetyczne tlenu w stanie singletowym wynoszą 92,4 kJ/mol i 159,6 kJ/mol
odpowiednio dla 1"g i 3Łg+ powyżej stanu podstawowego.
W układach biologicznych tlen singletowy (1O2) może być produkowany w wyniku
reakcji kwasu podchlorawego z nadtlenkiem wodoru lub w reakcjach fotouczulanych
(fotosensybilizowanych). W przypadku reakcji fotosensybilizowanych tlen singletowy
generowany jest w procesie transferu energii ze stanu trypletowego wzbudzonej cząsteczki
fotouczulacza (3S) na tlen cząsteczkowy w stanie podstawowym (3O2):
S + h� 1S 3S
3
S + 3O2 S + 1O2
W układach skondensowanych czas życia cząsteczki tlenu w stanie 1"g jest około 104 razy
3
dłuższy niż w stanie Łg+. Dlatego w typowych reakcjach chemicznych z udziałem tlenu
1
singletowego znaczenie będzie miał przede wszystkim stan "g i do cząsteczki tlenu w tym
właśnie stanie odnosi się nazwa  tlen singletowy (1O2). Tak długi czas życia we wzbudzonym
stanie singletowym (10-6 - 10-1 s w zależności od rozpuszczalnika) wynika z reguł wyboru dla
przejść elektronowych według których przejście 1"g 3Łg- jest silnie wzbronione nie tylko ze
względu na to, że jest to przejście międzysystemowe pomiędzy stanami o różnej multipletowości
(przejście singlet tryplet) ale również ze względu na reguły wyboru dotyczące parzystości
i symetrii.
Dezaktywacja tlenu singletowego do stanu podstawowego zachodzi na drodze
promienistej - fosforescencji oraz bezpromienistej - przejścia międzysystemowego
z wydzieleniem ciepła.
1
Fosforescencja O2 3O2 + h� kR[1O2]
1
Dezaktywacja bezpromienista O2 3O2 + ciepło kNR[1O2]
Naturalny czas życia �"0 związany jest ze stałymi szybkości tych obu procesów:
�"0 = (kR + kNR)-1
Fosforescencja tlenu singletowego charakteryzuje się maksimami przy 1270 nm (przejście
na najniższy poziom oscylacyjny (0,0)) i 1580 nm (przejście na pierwszy wzbudzony poziom
oscylacyjny (0,1)). W większości rozpuszczalników dominują przejścia bezpromieniste a kR
silnie zależy od rodzaju rozpuszczalnika a w szczególności od jego polarności. Woda należy do
1
rozpuszczalników, w których kR jest najniższe i tylko jedna cząsteczka O2 na milion ulega
dezaktywacji na drodze fosforescencji. Szybkość dezaktywacji na drodze bezpromienistej
również zależy od rodzaju rozpuszczalnika. W obecności ciężkich atomów wzrasta
prawdopodobieństwo przejścia interkombinacyjnego do stanu podstawowego. Najdłuższe czasy
życia 1O2 obserwuje się w rozpuszczalnikach zawierających atomy chlorowców, natomiast wraz
ze wzrostem liczby atomów wodoru w cząsteczkach rozpuszczalnika �"0 ulega skróceniu.
Najkrótsze wartości �"0 przyjmuje w roztworach zawierających grupy hydroksylowe. I tak,
w wodzie �"0 przyjmuje najniższą wartość, �"0 = 3,3 �s podczas gdy podstawienie atomów
wodoru deuterem powoduje wydłużenie tego czasu życia do około 60 �s, a w przypadku
1
rozpuszczalnika pozbawionego atomów wodoru czas życia O2 jest o kilka rzędów wielkości
większy, np. dla C2F3Cl �"0 = 0,1 s.
Wydajność kwantowa generacji tlenu singletowego Ś1O2 w reakcjach fotouczulanych
zależy od wydajności kwantowej przejścia interkombinacyjnego fotosensybilizatora Śisc a" ŚT
oraz od efektywności transferu energii z cząsteczki fotosensybilizatora w stanie trypletowym na
cząsteczki tlenu w stanie podstawowym fTŁ.
Ś1O2 = fTŁ Śisc
fTŁ określa jaka część stanów trypletowych fotouczulacza ulega dezaktywacji na drodze transferu
energii wzbudzenia na cząsteczki tlenu i może być wyrażona jako stosunek szybkości tego
procesu kTŁ[O2] do sumy szybkości wszystkich procesów prowadzących do dezaktywacji:
0
kTŁ[3O2 ] �T kTŁ[3O2 ]
fTŁ = = �T kTŁ[3O2 ] =
0
kP + kisc + kTŁ[3O2 ] 1 + �T kTŁ[3O2 ]T
gdzie �T i �T0 oznaczają czasy życia stanu trypletowego odpowiednio w obecności i pod
nieobecność tlenu. Widać zatem, że Ś1O2 zależy nie tylko od własności samego fotouczulacza
(Śisc) ale również od lokalnego stężenia tlenu, naturalnego czasu życia trypletu oraz lepkości
ośrodka. Wydajność kwantowa generacji 1O2 osiąga górną granicę Ś1O2 = Śisc o ile w ośrodku
występuje wysokie stężenie tlenu, a stała szybkości kTŁ przyjmuje odpowiednio duże wartości,
tak, żeby w czasie życia stanu trypletowego doszło do jego oddziaływania z tlenem. Jeśli czas
życia stanu trypletowego cząsteczki fotosensybilizatora �T0 jest krótki i znajduje się on w ośrodku
lepkim lub przy małej dostępności tlenu, wówczas generacja tlenu singletowego jest procesem
mało wydajnym.
W przypadku fotosensybilizatorów o wystarczająco długim czasie życia w stanie
singletowym (> 1 ns), tlen cząsteczkowy może wygaszać również stan singletowy na trzy
sposoby:
1
1) Dezaktywacja indukowana tlenem: S + 3O2 S + 3O2;
1
2) Indukowane tlenem przejście interkombinacyjne: S + 3O2 3S + 3O2;
1
3) Transfer energii: S + 3O2 3S + 1O2.
O ile dezaktywacja indukowana tlenem zazwyczaj nie ma większego znaczenia,
oddziaływanie tlenu ze wzbudzonymi stanami singletowymi sensybilizatora prowadzi do
zwiększenia Ś1O2 poprzez: 1) zwiększenie prawdopodobieństwa przejścia interkombinacyjnego
(a zatem zwiększa się populacja cząsteczek fotosensybilizatora w stanie trypletowym), 2) transfer
energii (jeśli tylko przerwa energetyczna pomiędzy wzbudzonym stanem singletowym
i trypletowym cząsteczki fotosensybilizatora jest większa niż 94,6 kJ/mol, czyli niż energia
wzbudzenia tlenu w stanie 1"g). W wyniku transferu energii generowany jest tlen singletowy oraz
stan trypletowy fotosensybilizatora, który może przekazać swoja energię wzbudzenia na następną
cząsteczkę tlenu, a zatem pochłonięcie pojedynczego fotonu może spowodować generację
1
dwóch cząsteczek O2. Gdy w układzie zachodzi wygaszanie stanów singletowych przez tlen,
wówczas Ś1O2 zależy w sposób złożony od stężenia tlenu i może osiągać graniczną wartość
równą 2. Analogicznie jak w przypadku wygaszania stanów trypletowych fotouczulacza można
wprowadzić parametr fSŁ. Ze względu na znacznie krótsze czasy życia stanów singletowych niż
trypletowych, w większości przypadków fSŁ jest znacznie mniejsze niż 1.
Opis metody i jej wybranych zastosowań
Rozdzielcza czasowo detekcja fosforescencji tlenu singletowego w podczerwieni
1
stosowana jest w celu monitorowania fotosensybilizowanej generacji O2 oraz jego zaniku.
Ideowy schemat układu do monitorowania fosforescencji próbki po impulsie lasera
przedstawiony jest na Rys. 1. Próbka zawierająca fotouczulacz oraz tlen w znanym stężeniu
znajduje się w kuwecie fluorescencyjnej. Detektor germanowy ustawiony jest pod kątem 90�
w stosunku do wiązki wzbudzającego promieniowania laserowego. Pomiędzy próbką
a powierzchnią czynną detektora znajdują się odpowiednie filtry mające za zadanie
zminimalizować rozproszone promieniowanie lasera lub fluorescencję próbki. I tak, filtr
krzemowy absorbuje promieniowanie poniżej 1100 nm, natomiast filtr interferencyjny
przepuszcza wąski zakres spektralny promieniowania z maksimum transmisji przy 1270 nm.
Rys. 1. Schemat ideowy (A) oraz uproszczony schemat układu pomiarowego (B) do rozdzielczej czasowo detekcji
1
charakterystycznej fosforescencji O2 przy 1270 nm. P  kuweta fluorescencyjna z próbką; OPO  optyczny
oscylator parametryczny; ; Z- zwierciadła dichroiczne; M/D  mieszacz/podwajacz częstości; FD  fotodioda; F1 
filtr szary do regulacji energii promieniowania i/lub filtr pochłaniający promieniowanie o niepożądanej długości fali;
L  soczewki formujące wiązkę lasera; F2  filtr krzemowy obcinający promieniowanie o < 1100 nm oraz filtr
interferencyjny z maksimum transmisji przy 1270 nm.
Czas życia tlenu singletowego � w danym rozpuszczalniku można wyznaczyć z analizy
kinetyki zaniku intensywności fosforescencji w czasie. W tym celu do danych doświadczalnych
dopasowuje się krzywą eksponencjalną:
I(t) = I0 exp(-kt)
gdzie I0 jest początkową intensywnością fosforescencji ekstrapolowaną do czasu zakończenia
-1
błysku lasera, natomiast k = � jest stałą szybkości zaniku intensywności fosforescencji.
W warunkach gdy w próbce znajduje się dodatkowo substrat Q, reagujący z 1O2 na drodze
reakcji chemicznej lub wygaszania fizycznego, wówczas pomiar obserwowanej szybkości zaniku
fosforescencji (k) w zależności od stężenia substratu pozwala na wyznaczenie stałej szybkości
1
gaszenia kQ będącej sumą stałych szybkości wszystkich oddziaływań substratu z O2 natury
zarówno chemicznej jak i fizycznej:
-1
k([Q]) = � + kQ[Q]
Wydajność kwantową generacji tlenu singletowego Ś1O2 przez badany związek można
wyznaczyć metodą porównawczą przy pomocy detekcji fosforescencji 1O2. W tym celu stosuje
się standard - fotosensybilizator o znanej Ś1O2 w stężeniu odpowiadającym identycznej
absorbancji przy długości fali impulsu wzbudzającego jak próbka ze związkiem o nieznanej
Ś1O2. W ten sposób zapewnia się warunki, w których liczba fotonów pochłoniętych przez
obydwie próbki będzie identyczna. Aby wyznaczyć Ś1O2 przeprowadza się pomiar początkowych
intensywności fosforescencji I0 dla obu próbek przy różnych energiach impulsu wzbudzającego.
Jest to konieczne gdyż w przypadku gdy generowane jest odpowiednio duże stężenie stanów
trypletowych w próbce będą one ulegać dezaktywacji w wyniku oddziaływania tryplet-tryplet, a
co za tym idzie ich czas życia będzie krótszy i mniejsze prawdopodobieństwo transferu energii na
cząsteczkę tlenu. Co więcej, przy większych energiach impulsów może dochodzić do procesów
dwufotonowych. Do obliczeń bierze się pod uwagę jedynie te początkowe intensywności
fosforescencji I0, które w sposób liniowy rosną wraz ze wzrostem energii lasera. Stosunek
nachyleń obu prostych jest równy stosunkowi wydajności kwantowych obu próbek.
Wykonanie ćwiczenia
1. Pomiar stałej szybkości wygaszania tlenu singletowego przez �-karoten i ą-tokoferol
Odczynniki:
Roztwory wyjściowe tetra-fenylo-porfiryny, ą-tokoferolu (cTOC = 5�10-3M) i �-karotenu (cCAR =
5�10-5M) w benzenie.
Materiały:
Kwarcowe kuwety spektrofotometryczne i fluorescencyjne
Pipety i końcówki
Aparatura:
Spektrofotometr diodowy
Układ do detekcji rozdzielczej-czasowo fosforescencji przy 1270 nm
a) Zmierz widma absorpcji roztworów porfiryny, ą-tokoferolu i �-karotenu w benzenie.
b) Wybierz długość fali promieniowania wzbudzającego tak aby absorbancja porfiryny przy tej
długości fali mieściła się w zakresie 0,05-0,20, natomiast wkład absorpcji wygaszaczy był
możliwie najmniejszy.
Długośc fali promieniowania wzbudzającego: ex = ......... nm
Absorbancja porfiryny przy ex w 1 cm kuwecie: A = ............
Początkowa objętość próbki: V0 = .............. �l
c) Zmierz kinetykę powstawania i zaniku luminescencji emitowanej przez próbkę po impulsie
lasera. Dopasuj do punktów pomiarowych zaniku intensywności emisji I w czasie t krzywą
eksponencjalną:
I(t) = I0exp(-kt)
d) Dodaj do próbki ą-tokoferol (np. 1% objętości V0) i powtórz krok c).
e) Powtarzaj pomiary zwiększając za każdym razem stężenie ą-tokoferolu dopóki nie
zaobserwujesz wyraz
nego skrócenia czasu życia fosforescencji 1O2.
f) Powtórz kroki c-e stosując jako wygaszacz �-karoten.
Szybkość zaniku fosforescencji k (s-1)
"VQ VQ
(�l) (�l)
Q a" ą-tokoferol Q a" �-karoten
"VQ  dodana objętość roztworu wygaszacza do próbki
VQ  całkowita objętość roztworu wygaszacza w próbce
cQVQ
[Q] =
V0 + VQ
g) Wyznacz stężenie wygaszaczy w poszczególnych próbkach:
1
h) Narysuj wykresy przedstawiające zależność stałej szybkości zaniku O2 k od stężenia
wygaszaczy [Q]. Do punktów pomiarowych dopasuj prostą i wyznacz nieznane paramtery: � -
naturalny czas życia tlenu singletowego w benzenie; kQ - stałą szybkości oddziaływania tlenu
singletowego z wygaszaczem Q.
k ([Q])= �-1 + kQ [Q]
2. Wyznaczanie wydajności kwantowej generacji tlenu singletowego metodą pośrednią.
Odczynniki:
Roztwory wyjściowe tetra-fenylo-porfiryny (TPP) stosowanej jako standard oraz wybranej
pochodnej porfiryny (PORF) o nieznanej Ś1O2.
Materiały:
Kwarcowe kuwety fluorescencyjne
Pipety i końcówki
Zestaw filtrów szarych wraz z widmami transmisji i danymi liczbowymi
Aparatura:
Spektrofotometr diodowy
Układ do detekcji rozdzielczej-czasowo fosforescencji przy 1270 nm
a) Zmierz widma absorpcji próbek TPP oraz PORF. Dobierz długość fali promieniowania
wzbudzającego ex w ten sposób by absorbancja przy ex była jednakowa dla obu próbek i
mieściła się w zakresie 0,05 - 0,10 (jeśli to konieczne rozcieńcz próbki).
Długość fali promieniowania wzbudzającego: ex = .......... nm
Absorbancja przy ex w 1 cm kuwecie: A = ............
b) Wybierz zestaw 6-10 filtrów pozwalający zmieniać natężenie promieniowania
wzbudzającego w zakresie od kilku do 90% dla wybranej ex.
c) Zbierz kinetyki zaniku fosforescencji emitowanej przez próbki po impulsie lasera przy
różnych energiach impulsu wzbudzajacego dla obu próbek.
d) Dla wszystkich zmierzonych kinetyk dopasuj do punktów pomiarowych zaniku
intensywności emisji I w czasie t krzywą eksponencjalną:
I(t) = I0exp(-kt)
i wyznacz początkową wartość intensywności fosforescencji I0 ekstrapolując krzywą
eksponencjalną do czasu zakończenia błysku lasera. Wyniki wpisz do tabelki.
Energia Początkowa intensywność fosforescencji I0
lasera (V)
(%)
TPP PORF
e) Narysuj wykres zależności I0 od energii impulsu wzbudzającego E(%) dla TPP i PORF. W
obszarze liniowego wzrostu I0(E) dopasuj do puntków doświadczalnych proste i wyznacz
współczynniki ich nachylenia aTPP i aPORF. Oblicz wydajność kwantową generacji tlenu
singletowego przez PORF korzystając ze związku:
ŚPORF = ŚTPP � aPORF/aTPP
gdzie ŚTPP = 0,63 w benzenie w równowadze z powietrzem (Bonnett et al., Photochem.
Photobiol. 48: 271-276, 1988).
Literatura:
Paszyc, S.: "Podstawy fotochemii", PWN, Warszawa, 1992.
Sarna, T.: Udział tlenu singletowego i wolnych rodników w reakcjach fotouczulanych
i zjawiskach fotodynamicznych. Zagadnienia Biofizyki Współczesnej 14(1): 5-30, 1989.
Bartosz, G.: "Druga twarz tlenu" PWN, Warszawa, 1995.