WYSOKOSPRAWNA
CHROMATOGRAFIA
CIECZOWA
materiały do ćwiczeń seminaryjno-
laboratoryjnych
Materiały zebrała i przygotowała do druku:
dr in\
. Agata Kot-Wasik, Katedra Chemii Analitycznej, Politechnika Gdańska
Ś
SPIS TRE CI
Ć
wiczenie 1
Przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy  przygotowanie fazy
ruchomej, instalacja kolumny; zasady postępowania dla efektywnego
stosowania aparatu.
Dr in\
. A. Kot-Wasik
Ć
wiczenie 2
Dobór warunków rozdzielania w układzie faz odwróconych.
Dr in\
. B. Makuch, mgr in\
. J. Wilga
Ć
wiczenie 3
Rozwiązywanie problemów chromatograficznych  problemy związane z
dozowaniem próbki, kolumną, detektorem, pompą.
Prof. dr hab. in\
. M. Kamiński, mgr in\
. E. Gilgenast,
mgr in\
. G. Romanik
Ć
wiczenie 4
Analiza ilościowa związków w próbkach.
Dr in\
. A. Kot-Wasik
ĆWICZENIE 1
PRZYGOTOWANIE CHROMATOGRAFU CIECZOWEGO DO PRACY 
PRZYGOTOWANIE FAZY RUCHOMEJ, INSTALACJA KOLUMNY; ZASADY
POST
POWANIA DLA EFEKTYWNEGO STOSOWANIA APARATU.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przygotowanie chromatografu cieczowego do pracy. Przygotowanie aparatu
obejmuje przygotowanie fazy ruchomej, instalację kolumny chromatograficznej, przygotowanie detektora
i stabilizaja warunków chromatograficznych.
Schemat blokowy chromatografu cieczowego, którego elementy poddawane będą omówieniu i
przygotowaniu do pracy analitycznej przedstawiono na Rysunku.
Nastrzyk
Pompa
Detektor
Kolumna
Termostat
Rejestrator
Faza
ruchoma
Schemat blokowy chromatografu cieczowego
W celu przygotowania aparatu do pracy nale\
y:
1. przygotować fazę ruchomą,
2. zainstalować kolumnę chromatograficzną,
3. przygotować detektor ,
4. przygotować wzorzec i próbkę do analizy,
5. ustabilizować warunki chromatograficzne,
6. zdiagnozować ewentualne problemy chromatograficzne.
ad.1 Fazą ruchomą w chromatografii cieczowej są pojedyncze rozpuszczalniki lub ich dwu- lub więcej
składnikowe mieszaniny. Faza ruchoma, która zostaje wprowadzona do kolumny to eluent, który
bezwzględnie musi być pozbawiony rozpuszczonego w cieczy powietrza (zaprezentowane zostaną ró\
ne
sposoby usuwania powietrza z fazy ruchomej: odgazowanie pró\
niowe, helem lub za pomocą
ultradzwięków). Rodzaj i stosunek ilościowy mieszaniny rozpuszczalników w fazie ruchomej ma bardzo
du\
y wpływ na proces chromatografowania. Omówione zostaną sposoby przygotowania faz ruchomych
składających się z dwóch (lub więcej) składników, zawierające dodatki (kwasy nieorganiczne, organiczne
i bufory). Przedstawiony zostanie sposób wymiany eluentu. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, \
e cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji  inject .
Je\
eli, eluent poprzedni i następny wzajemnie się nie mieszają, a szczególnie gdy stosowane są roztwory
buforowe, lub eluenty zawierające substancje będące w stanie czystym fazą stałą, nale\
y upewnić się, \
e
kolejna ciecz pompowana przez aparat nie spowoduje wytrącenia się stałego osadu wewnątrz
chromatografu, ani powstania emulsji. W takich przypadkach nale\
y zastosować ciecz pośrednią, o której
wiadomo, \
e jest dobrym rozpuszczalnikiem składników poprzedniego i następnego eluentu, np. wodę
destylowaną, gdy ma być stosowany bufor zawierający sole nieorganiczne, albo tetrahydrofuran, aceton
lub dioksan, gdy poprzedni i następny eluent są cieczami bez dodatku substancji stałych, ale wzajemnie
się nie mieszają. Pomocne mo\
e być wprowadzenie strzykawką poprzedniego eluentu do następnego
zawartego w probówce w celu sprawdzenia czy nie powstaje osad lub emulsja;
Zawsze nale\
y ka\
dą ze stosowanych cieczy pośrednich przepłukać tak\
e kanał odniesienia detektora,
gdy detektor taki kanał posiada (np. w przypadku detektora refraktometrycznego);
Podstawowy problem związany z fazą ruchomą w HPLC: ciśnienie wskazywane przez wyświetlacz na
płycie czołowej pompy waha się więcej ni\
+/- 2 bary, a jednocześnie widać okresowe zasysanie małych
banieczek z przewodu ssawnego do pompy. Przyczyna: zapowietrzony eluent, albo eluent o zbyt
wysokiej prę\
ności par, albo/i zatkany zanieczyszczeniami filtr ssawny pompy. (Uwaga! Eluent przed
u\
yciem musi być przefiltrowany przez filtr 0,45 um, je\
eli nie ma pewności, \
e wykonał to producent, a
tak\
e nie wolno dopuścić do powstania \
ycia biologicznego w eluencie nietoksycznym dla bakterii i
grzybów - stosować 0.5 mM azydek sodu). Nale\
y przedmuchać filtr ssawny pompy sprę\
onym
powietrzem w kierunku odwrotnym do kierunku przepływu cieczy, dodatkowo odpowietrzyć eluent i
postawić go powy\
ej poziomu głowicy pompy.
ad.2 Sposób połączenia kolumny z dozownikiem i detektorem powinien być taki, \
eby
zminimalizować powstające ewentualne objętości martwe. W ten sposób zmniejsza się udział objętości
martwych stosunek rozmyciu pików chromatograficznych. Przez cały czas trwania wymiany eluentu
kolumna powinna być odłączona i zastąpiona łącznikiem (dwójnikiem). Kolejna kolumna potrzebna do
wykonania oznaczeń, powinna zostać przyłączona w miejsce dwójnika dopiero po upewnieniu się, \
e cały
aparat został poprawnie przepłukany i zawiera eluent, który aktualnie będzie wykorzystywany do analizy.
Zawór dozujący w pozycji powinien być w pozycji  inject .
Je\
eli klumna chromatograficzna podłączana jest do układu po raz pierwszy lub te\
nie była u\
ywana
przez dłu\
szy okres czasu nale\
y - po podłączniu jej do układu chromatograficznego  zastosować
wzrastający przepływ fazy ruchomej (od najmniejszego do właściwego). Gwałtowne włączenie pompy
pompującej fazę ruchomą z du\
ym przepływem mo\
e zruszyć zło\
e upakowane w kolumnie
chromatgraficznej.
Przy rozpoczynaniu analizy chromatograficznej jedną z bardzo wa\
nych rzeczy jest ustalenie równowagi
kolumny chromatograficznej. Jak długo nale\
y kolumnę stabilizować zale\
y od jej stanu, stę\
enia
składników fazy ruchomej oraz ich wskaz
nika retencji. Ustalenie stanu równowagi jest uwarunkowane
przez prędkość, z którą składniki fazy ruchomej są transportowane do kolumny lub mogą z niej być
usunięte. Je\
eli stę\
enie dodatków organicznych w fazie ruchomej jest niskie, ustalenie równowagi
zajmie sporo czasu, np.: je\
eli kolumna wcześniej nie miała kontaktu z metanolem, a jego stę\
enie w
fazie ruchomej wynosi 1%, to potrzeba przepuścić przez kolumnę co najmniej 10-krotną jej objętość w
celu dostarczenia odpowiedniej ilości metanolu. Na Rysunku poni\
ej przedstawiono nieustabilizowaną
linię bazową świadczącą o zbyt krótkim czasie stabilizacji kolumny.
ć
ś
Czas [min]
Nieustabilizowana linia podstawowa ze względu na zbyt krótki czas stabilizowania kolumny.
.u.]
Intensywno
[j
ad.3 Detektor nale\
y włączyć na 15-20 minut przed rozpoczęciem analiz (wyjątek stanowi detektor
refraktometryczny, którego stabilizacja mo\
e zająć 24 godziny). Przed rozpoczęciem analiz
chromatograficznych detektor nale\
y wyzerować. Je\
eli detektor UV, UV-VIS-DAD lub fluorescencyjny
nie daje się wyzerować w całym, albo w części zakresu pomiarowego, zaś balans detektora RI nie daje się
sprowadzić do jednej diody świecącej to nale\
y podejrzewać, \
e uzyty został eluent o niedostatecznej
czystości, albo - co gorzej - na powierzchni wewnętrznej naczyńka przepływowego w detektorze
wydzieliła się emulsja, albo depozyt substancji stałej. Jeśli tak to nale\
y wymieć eluent na inny - o
wy\
szej czystości, a je\
eli to nie pomaga, przepłukać naczyńko przepływowe odpowiedniego detektora
kolejno: dichlorometanem, acetonem, wodą, acetonem, toluenem i powrócić do stosowanego eluentu. W
razie potrzeby zastosować ciecz pośrednią. Je\
eli to nie pomaga zastosować dodatkowo płukanie 5% -
owym kwasem azotowym.
ad. 4 W chromatografie cieczowym próbka wprowadzana zostaje (pod ciśnieniem atmosferycznym) do
kolumny poprzez dozownik. W kolumnie panuje ciśnienie do kilkudziesięciu MPa. Dozowniki są
skonstruowane tak, aby nie było w nich przestrzeni  martwych , nie przemywanych fazą ruchomą. Zły
dozownik lub złe dozowanie mogą być przyczyną pojawienia się z
le rozdzielonych, szerokich i
niesymetrycznych pików.
Najczęściej w HPLC stosuje się objętości nastrzykiwanych próbek w zakresie od 1(5) do 150 �l. Jako
optymalną objętość próbki do nastrzyku ustalić mo\
na na 5-25�l (najmniej efektów uboocznych
związanych z niewłaściwym przygotowanie próbki). Bardzo wa\
ną kwestią dotyczącą nastrzyku jest
skład jakościowy roztworu, w którym nastrzykiwane są anality. Dlaczego? Otó\
, przy przepływie 0,5
ml/min  przeliczając przepływ na �l/s otrzymujemy 8,3�l/s  nastrzyk o wielkości 5�l  przy zało\
eniu,
\
e moment nastrzyku trwa sekundę  powoduje, \
e do układu chromatograficznego wprowadzamy
niemal\
e jeszcze raz taką objętość cieczy, jaka w danej chwili przepływa przez kapilary. Spowodować to
mo\
e znaczne zaburzenie składu ilościowego fazy, a to jak wiadomo ma bardzo du\
y wpływ na
parametry retencji analitów. Stąd te\
roztwór do nastrzyku powinien przygotowywany w fazie ruchomej
aby jak największym stopniu zapobiec niepo\
ądanym zmianom wcześniej ustalonych parametrów.
Istnieje mo\
liwość tzw. przeładowania kolumny. W zale\
ności o tego, czy za du\
e okazało się stę\
enie
wprowadzanej próbki czy jej objętość, mówi się o przeładowaniu objętościowym lub stę\
eniowym. W
trakcie zajęć omówione zostaną takie problemy, jak obecność pików frontujących i ogonujących (patrz
rysunki poni\
ej).
Czas retencji [min]
Czas retencji [min]
Notatki własne
ĆWICZENIE 2
DOBÓR WARUNKÓW ROZDZIELANIA W UKA
ADZIE FAZ ODWRÓCONYCH
Dr in\
. B. Makuch, mgr in\
. J. Wilga
Pani Bogumiła Makuch jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
Pani Joanna Wilga jest doktorantką na Studium Doktoranckim przy Wydziale Chemicznym
Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie dobór optymalnych warunków rozdzielenia substancji w układzie
faz odwróconych, na przykładzie ekstraktu z liści z Ginkgo bilobae.
Rysunek 1. Liście Ginkgo bilobae
Ju\
przed wiekami odkryto, \
e liście Ginkgo bilobae, tej najstarszej na świecie rośliny zawierają związki
flawonoidowe i terpenoidowe, które potrafią stymulować procesy pamięciowe mózgu, wpływają
pomocniczo w zwalczaniu zaburzeń obwodu krą\
enia krwi, a tak\
e w zaburzeniach pracy mózgu
spowodowanych zaburzeniami krą\
enia mózgowego, a rozmaite produkty zawierające Ginkgo robią
obecnie zawrotną karierę i są stosowane w postaci tabletek lub w roztworze.
Ekstrakty roślinne są zło\
onymi, wieloskładnikowymi mieszaninami związków znacznie ró\
niących się
właściwościami chemicznymi. Dobór warunków rozdzielania mo\
e być procesem trudnym i
pracochłonnym. Na ogół bywa, \
e nie jest mo\
liwe rozdzielenie w układzie izokratycznym (stały skład
fazy ruchomej) i nale\
y stosować gradient (zmiana skokowa bądz
ciągła składu fazy ruchomej).
Obecnie najczęściej stosowanymi układami rozdzielania metodą Wysokosprawnej Chromatografii
Cieczowej (HPLC) jest tzw. układ faz odwróconych (RP) i mo\
na zaryzykować stwierdzenie, \
e90%
wszystkich rozdzielań wykonuje się w tych układach z zastosowaniem fazy stacjonarnej typu RP  18
tzn. \
el krzemionkowy modyfikowany grupą oktadecylową.
W praktyce laboratoryjnej doboru faz rozdzielania dokonuje się przez:
a  zmianę składu fazy ruchomej - zmiana ilościowego udziału rozpuszczalników,
b  zmianą pH fazy ruchomej,
c- zastosowanie pary jonowej,
e  zmiana typu fazy ruchomej.
W trakcie wykonywania ćwiczenia będą uwzględniane punkty a, b, c, e. Rozpuszczalniki stosowane jako
fazy ruchomew układach RP wg ich iły elucyjnej to woda (najsłabszy) < MeOH< ACN < EtOH < THF <
iPrOH < chlorek metylenu (najsilniejszy). W praktyce najczęściej stosuje się 4  ry rozpuszczalniki w
ró\
nych układach tj. wodę, metanol, acetonitryl i tetrahydrofuran, a parametry retencji mogą być
regulowane składem fazy ruchomej.
Podstawowa zale\
ność to wzrost zawartości rozpuszczalnika bardziej polarnego w fazie ruchomej obni\
a
wartość współczynnika retencji (k).
Bywają takie problemy rozdzielcze, które mo\
na rozwiązać poprzez zamianę rozpuszczalnika w fazie
ruchomej; mo\
na np. zamienić metanol na tetrehydrofuran. Przy zało\
eniu stałej siły elucyjnej fazy
ruchomej korzysta się z prostej zale\
ności:
ST = Ł �
Ł Si�i
Ł �
Ł �
gdzie:
ST  całkowita siła elucyjna fazy ruchomej,
Si  siła elucyjna rozpuszczalnika
�i  udział molowy rozpuszczalnika w fazie ruchomej.
Przykład: mamy skład fazy ruchomej MeOH : H2O w stosunku objętościowym 7:3. Wówczas całkowitą
siłę elucyjną fazy ruchomej liczymy wg powy\
szej zale\
ności otrzymując:
ST = SMeOH� + SH2O� = 2,6 x 0,7 + 0 x 0.3 = 1,82
� �
� �
� �
Gdy zastąpimy metanol tetrahydrofuranem przy zało\
eniu takiej samej siły elucyjnej fazy ruchomej to
obliczenie jest następujące:
1,82 = 4,5 x X + 0 x X ok. 40
czyli nowy skład fazy ruchomej będzie następujący THF : H2O 4: 6 (v/v).
Innym sposobem doboru warunków rozdzielania jest zmiana pH fazy ruchomej. W przypadku
rozdzielania związków o charakterze słabych kwasów, fazę ruchomą zakwaszamy, zaś w przypadku
rozdzielania słabych zasad fazę ruchomą alkalizujemy. Efektem takich zabiegów jest wzrost
współczynnika retencji co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia związków, które zbyt szybko
opuszczają kolumnę chromatograficzna. Zmiana pH powoduje cofnięcie dysocjacji.
W układach RP mogą być stosowane równie\
inne typy faz stacjonarnych np. RP  8, rzadziej RP
 2, jak równie\
\
el modyfikowany grupa cyjanową lub fenylową. W ka\
dym przypadku kolejność elucji
jest następująca: pierwsze eluują substancje polarne (hydrofilowe)a w dalszej kolejności substancje
niepolarne (hydrofobowe). W przypadku rozdzielania węglowodorów czas elucji jest zale\
ny od długości
łańcucha fazy związanej z \
elem krzemionkowym.
WYKONANIE ĆWICZENIA
W trakcie ćwiczenia dobierane będą optymalne warunki rozdzielenia substancji czynnych w ekstrakcie
Ginkgo bilobae, w układzie faz odwróconych.
Pomiar wykonany zostanie w warunkach izokratycznych,; przy mierzonej długości fali  = 330 nm.
Wykorzystywane kolumny chromatograficzne:
- LiChrospher RP-18
- Kolumna cyjanowa
Wykorzystywane fazy ruchome:
- MeOH : H2O (7:3 v/v)
- MeOH : H2O (9:3 v/v)
- MeOH: H2O (7:3 v/v) z dodatkiem H3PO4 (1%)
- THF:H2O (4:6 v/v)
- THF:H2O (4:6 v/v) z dodatkiem H3PO4 (1%)
- MeOH: H2O (7:3 v/v) z dodatkiem H3PO4 (0,1%)
- THF:H2O (4:6 v/v) z dodatkiem H3PO4 (0,1%)
Parametry aparatury
" Detektor UV/DAD L  7450 firmy Merck HITACHI
" Pętla dozująca 20�l
" Dozownik Rheodyne 7125
" Pompa L  6200 firmy Merck HITACHI
Notatki własne
ĆWICZENIE 3
ROZWI
ZYWANIE PROBLEMÓW CHROMATOGRAFICZNYCH  PROBLEMY
ZWI
ZANE Z DOZOWANIEM PRÓBKI, KOLUMN
, POMP
I DETEKTOREM.
Prof. dr hab. in\
. M. Kamiński, mgr in\
. E. Gilgenast, mgr in\
. G. Romanik
Pan Marian Kamiński jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]
Panie Ewelina Gilgenast i Gra\
yna Romanik są doktorantkami na Studium Doktoranckim przy Wydziale
Chemicznym Politechniki Gdańskiej;
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z najstępującymi zagadnieniami: geneza oraz sposoby
rozwiązywania problemów, spotykanych w praktyce i dotyczących kolumny, dozowania, detekcji, elucji
gradientowej; zasady postępowania w celu doboru warunków rozdzielania w układach NP-HPLC;
metodyka zastosowania chromatografii \
elowej (GPC, SEC) do oznaczania rozkładu masy molekularnej
polimerów; obserwacja przebiegu rozdzielania barwnych substancji w kolumnie HPLC.
Streszczenie przebiegu ćwiczenia
1. Zapoznanie Uczestników z alternatywnymi sposobami postępowania, zapewniającymi zapobieganie /
eliminację problemów spotykanych w praktyce i dotyczących:
- doboru/oceny selektywności, sprawności, rozdzielczości i przepuszczalności kolumny,
- dozowania bardzo małych i bardzo du\
ych objętości próbki oraz doboru odpowiedniego
rozpuszczalnika roztworu dozowanego do kolumny,
- doboru właściwej metody detekcji oraz najkorzystniejszych warunków pracy najwa\
niejszych
detektorów stosowanych w HPLC (UV-VIS, RI, FLD),
- problemów spotykanych w warunkach elucji gradientowej i sposobów ich eliminacji /
minimalizacji : zanieczyszczenie składników eluentu, obecność rozpuszczonego powietrza w
cieczach stanowiących składniki eluentu, niedoskonałość systemu synchronizacji pracy zaworów
proporcjujących i cyklicznej pracy pompy, nieodpowiednie parametry mieszalnika,  demiksja
składników eluentu w warunkach programowania składu cieczy eluującej, wytrącanie się
składników próbki w eluencie o niskiej sile elucyjnej i innych.
2. Przykład wpływu składu eluentu na retencję i selektywność rozdzielania: chlorofili i karotenoidów
zawartych w ekstrakcie roślinnym, albo produktów naftowych, albo mieszanin innych substancji nisko i
średnio polarnych (do wyboru przez uczestników grupy) oraz przedstawienie i przedyskutowanie zakresu
zastosowania detektora UV-VIS/DAD do zastosowań jakościowych oraz do określania tzw.  czystości
pików ;
3. Przedstawienie metodyki zastosowania chromatografii \
elowej do oznaczenia rozkładu masy
molekularnej polimeru - kalibracja  nisko-dyspersyjnymi standardami polimeru, a następnie oznaczenie
rozkładu masy cząsteczkowej próbki polimeru (styropian, sztućce, albo fragment obudowy
styropianowej).
4. Wizualna obserwacja przebiegu rozdzielania chlorofili i karotenoidów w kolumnie szklanej w
warunkach NP-HPLC z detekcją UV-254, rejestracją w trybie Y-t. oraz kolekcją frakcji  przykład
preparatywnego zastosowania HPLC w skali  modelowej .
Materiały, aparatura, oprogramowanie
Składniki eluentu: n-heksan, n-heptan, eter metylowo  tertbutylowy (MTBE), czterowodorofuran (THF),
acetonitryl (ew.), wszystkie o czystości  do HPLC ( HPLC grade ), albo  do elucji gradientowej
( gradient grade );
Próbki i rozpuszczalniki próbek: odwodniony ekstrakt z trawy lub z liści do acetonu,  przeprowadzony
do rozpuszczalnika o składzie eluentu, albo roztwór oleju napędowego lub nafty w n-heptanie, lub w n-
heksane o stę\
eniu 0,05g/ml; roztwór polimerów polistyrenowych w THF o stę\
eniach ok. 0.1 g/ml.
Aparatura i wyposa\
enie: A) Modułowy chromatograf cieczowy MERCK  HITACHI serii LaChrom
(pompa HPLC, dozownik Rheodyne, kolumna 250x4mm typu CN  100 7 um, termostat kolumny,
detektor UV-VIS/DAD, detektor RI , interface, komputer, oprogramowanie  HSM ; B) Chromatograf
cieczowy z pompą strzykawkową, dozownik Rheodyne, detektor RI, rejestrator Y-t ; C) Bezpompowy
zbiornikowy moduł zasilania kolumny pod wpływem sprę\
onego azotu poprzez reduktor ciśnienia, z
dozownikiem membranowym, kolumną szklaną HPLC, detektorem UV-254 i rejestratorem Y-t ; D)
Chromatograf cieczowy serii  Elite MERCK HITACHI, sterowany komputerem oraz oprogramowanie
rejestracji i przetwarzania danych najnowszej generacji.
Przydatne w praktyce zale\
ności obliczeniowe
1. Rozdzielczość (RS) - uzale\
nia stopień rozdzielenia substancji od sprawności i selektywności
układu chromatograficznego i jest wyra\
ona następującym równaniem:
N ą -1 k2
RS =
4 ą 1+ k2
2. Obliczanie sprawności i innych parametrów na podstawie chromatogramu testowego:
LC S1/ 2
H = ( )2
5,54 l
LC l
N = = 5,54( )2
H S1/ 2
b
As0,1 =
a
LC
u =
t0
" Obliczanie sprawności osiągalnej teoretycznie w chromatografii cieczowej niezale\
nie od
skali rozdzielania  równanie Knoxa
B
0,33
hteor = + A� + C� , gdzie
�
ud
H
p
h = ; � = (dla dobrze wypełnionych i bardzo sprawnych kolumn: A=1, B=2, C=0,1)
d DM
p
Rys. Schemat, przedstawiający chromatogram testowy i sposób wyznaczania parametrów do
obliczenia parametrów sprawności kolumny
Znaczenie symboli:
a, b  część szerokości piku w 0,1 wysokości (patrz rys.)
ą - współczynnik selektywności
As0,1  współczynnik asymetrii piku w 0,1 wysokości
A, B, C  stałe dla konkretnej kolumny
DM  współczynnik dyfuzji molekularnej substancji rozdzielanej w eluencie
dp  średnica ziaren wypełnienia kolumny; wielkość ziaren wypełnienia kolumny
h- tzw. zredukowana wysokość półki teoretycznej
H  wysokość wypełnienia równowa\
na półce teoretycznej
hteor  wartość h otrzymana z równania Knoxa
k2  współczynnik retencji substancji póz
niej eluowanej
l  odległość mierzona na chromatogramie ( w warunkach elucji izokratycznej i stałego natę\
enia
przepływu eluentu)
LC  długość wypełnienia kolumny
N- liczba półek teoretycznych
RS  stopień rozdzielenia
S1/2  szerokość piku w � wysokości
t0  czas martwy kolumny
u - liniowa prędkość przepływu eluentu w kolumnie
� - tzw. zredukowana prędkość przepływu eluentu
Uwagi i zalecenia
Sugeruję, aby Uczestnicy ćwiczenia wykorzystali czas trwania ćwiczenia tak\
e dla przedyskutowania z
prowadzącymi i z innymi uczestnikami, problemów, z jakimi spotkali się w swojej praktyce stosowania
HPLC.
Literatura
1. Chromatografia cieczowa  praca zbiorowa pod redakcją M. Kamińskiego, CEEAM, Gdańsk
2004
2. Z. Witkiewicz  Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 1995
Notatki własne
ĆWICZENIE 4.
ANALIZA ILOŚCIOWA ZWI
ZKÓW W PROBKACH
dr in\
. A. Kot-Wasik
Pani Agata Kot-Wasik jest pracownikiem Katedry Chemii Analitycznej
Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej;
[e-mail]
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przygotowanie krzywej kalibracyjnej metodą wzorca zewnętrznego do oznaczenia
zawartości fluoksetyny w próbce.
Charakterystyka fluoksetyny
Produkcja, leków, choć tak po\
yteczna dla ludzi i zwierząt, mo\
e stać się te\
dla nich zagro\
eniem.
Stosowanie ogromnej ilości antybiotyków, hormonów, środków przeciwbólowych czy uspokajających,
stanowi powa\
ny problem w dzisiejszym świecie. Stąd środki farmaceutyczne podawane ludziom są w
dalszej kolejności obecne w mierzalnych stę\
eniach w wodach powierzchniowych, podziemnych jak
równie\
wodzie pitnej. Korzystanie z wody zanieczyszczonej przez pozostałości farmaceutyków,
spo\
ywanie produktów pochodzenia zwierzęcego zawierających pozostałości śladowe ilości leków, a
tak\
e ich metabolitów, zaburza równowagę w organizmie, oraz potęguje problem tak ju\
niebezpiecznego
zjawiska lekooporności.
Do leków antydepresyjnych najnowszej generacji zaliczane są selektywne inhibitory
wychwytu zwrotnego serotoniny. Do leków tych nale\
y m.in. fluoksetyna, którą w
1988 roku wprowadziła na rynek firma Eli Lilly pod nazwą handlową Prozac�. Jedna
kapsułka np.: Prozac�, poza wieloma innymi składnikami, zawiera 20 mg
fluoksetyny.
Oznaczenie chromatograficzne.
Techniki chromatograficzne są typowym przykładem technik opartych na pomiarze względnym czyli
inaczej mówiąc na porównaniu sygnału detektora uzyskanego dla:
" próbki wzorcowej, w której znane jest stę\
enie analitu;
" próbki badanej.
W związku z tym konieczne jest przygotowanie krzywych kalibracyjnych dla wszystkich analizowanych
związków. Krzywe takie wyznacza się w oparciu o analizę próbek wzorcowych.
Analiza jakościowa:
Na podstawie zgodności czasów retencji analitów obecnych w próbce badanej i we
wzorcu
Na podstawie widma UV lub/i MS
Na podstawie zgodności stosunku sygnału dla dwóch ró\
nych długości fal
A1
A2
A1/A2 = constans dla danego analitu
Analiza ilościowa
metoda wzorca zewnętrznego
W tym celu nale\
y przygotować szereg rozcieńczeń
analitu, nastrzyknąć do układu chromatograficznego i
wyznaczyć zale\
ność powierzchni piku od stę\
enia.
700
y = 129,47x - 3,6134
600
R2 = 0,9998 A następnie dokonać analizy chromatograficznej i
500
znalez
ć wartość powierzchni piku dla badanego
400
analitu, po czym obliczyć stę\
enie (z krzywej
300
kalibracyjnej y = ax + b lub z proporcji
200
100
A/C = Ax/Cx gdzie, Cx = C*Ax / A )
0
0 1 2 3 4 5 6
Stę\
enie [C]
Chromatogramy wzorcowych roztworów substancji
o stę\
eniach róznych stę\
eniach.
metoda dodatku wzorca
metoda wzorca wewnętrznego
metoda normalizacji
piku [A]
Pole powierzchni
Warunki analizy chromatograficznej umozliwiającej oznaczenie zawartości fluksetyny
Elementy układu pomiarowego Rodzaj elementu i parametry pracy
Chromatograf cieczowy HPLC-UV-DAD, Agilent seria 1100
Składniki fazy ruchomej A: MeOH (0,1% TFAA) oraz B: H2O (0,1% TFAA)
Faza ruchoma
Skład 40% MeOH : 60% H2O
Prędkość przepływu 0.5 ml/min
Kolumna Discovery RP Amide 15cm x 3mm, 5�m
Detektor UV  226nm
Wielkość nastrzyku 20�l
Czas trwania analizy 20 min
Przebieg ćwiczenia:
Przygotować wzorzec fluoksetyny o stę\
eniu 100mg/mL i nastrzyknąć.
W kolbce miarowej o objętości 50 ml umieścić 5 mg wzorca fluoksetyny [FLU].
Poniewa\
związek ten dobrze rozpuszcza się w metanolu, dopełnić kolbkę do kreski
tym\
e rozpuszczalnikiem, a tym samym otrzyma się wzorzec o stę\
eniu 100�g/ml.
DAD1, 9.541 (0. 6 mAU,Bln) of CHECKV15.D DAD1, 6.034 (1.5 mAU, - ) of CHECKV15.D
DAD1, 12.074 (1.0 mAU, - ) of CHECKV15.D DAD1, 7.981 (4.1 mAU, - ) of CHECKV15.D
DAD1, 10.474 (291 mAU, - ) of CHECKV15.D DAD1, 6.714 (686 mAU, - ) of CHECKV15.D
mAU mAU
600
250
500
200
400
150
300
100
200
50
100
0
0
220 240 260 280 300 320 340 360 380
220 240 260 280 300 320 340 360 380
Długość fali [nm]
Długość fali [nm]
B
A
Chromatogram HPLC-DAD-MS uzyskany w trakcie analizy roztworu wzorcowego fluoksetyny (maprotylina
jest tutaj wzorcem wewnętrznym) wraz z widmami UV i MS.
 Sporządzenie rozcieńczeń roztworu wzorcowego fluoksetyny;
Metodą serii rozcieńczeń w kolbkach o pojemności 10 ml wyposa\
onych w nakrętki z
tworzywa sztucznego przygotować roztwory wzorcowe o stę\
eniach: 30, 20, 10, 5, 2, 0.7,
0.3, 0.2, 0.02, 0.001 �g/ml. Z tak przygotowanych próbek do chromatografu cieczowego
wprowadzić po 20�l ka\
dego roztworu.
Nastrzyknąć ( 3 razy) roztwór wzorcowy o najwy\
szym stę\
eniu;
Nastrzyknąć (3 razy) roztwór o ni\
szym stę\
eniu;
Potraktować tą analizę jako analizę próbki i policzyć stę\
enie na podstawie jednego punktu (z
analizy pierwszej); zastanowić się nad z
ródłami błędu;
Na podstawie analizy nr 1 oraz analizy nr 2 narysować krzywą kalibracyjną; określic jej
parametry;
Nastrzyknąć mieszaninę o trzecim stę\
eniu (3 razy) traktując ją jako analizę próbki i policzyć
stę\
enie na podstawie dotąd otrzymanych wyników; zastanowić się nad z
ródłami błędów;
Uzupełnić krzywą kalibracyjną o kolejny punkt;
Powtórzyć schemat postępowania a\
do uzyskania 5-7 punktowej krzywej kalibracyjnej;
Krzywa wzorcowa dla fluoksetyny otrzymana na podstawie analiz z wykorzystaniem detektora DAD
Wyznaczyć stę\
enie fluoksetyny w roztworze o nieznanym stę\
eniu.
Notatki własne
Wszelkie prawa zastrze\
one. Nieautoryzowane rozpowszechnianie całości lub fragmentów
niniejszych materiałów jest zabronione. Utwór nie mo\
e być powielany ani rozpowszechniany
za pomocą urządzeń elektronicznych, mechanicznych, kopiujących, nagrywających i innych bez
pisemnej zgody posiadacza praw autorskich. Wykonywanie kopii jakąkolwiek metodą powoduje
naruszenie praw autorskich do niniejszej publikacji.