INÅ»YNIERIA GENETYCZNA KLONOWANIE Øðklonowanie DNA - uzyskiwanie wielu kopii genu lub fragmentu DNA do celów badawczych Øðklonowanie organizmów - reprodukcja bezpÅ‚ciowa organizmów; powstaÅ‚y klon jest genetycznie identyczny z przodkiem (pochodzi od niego) Øðklony komórek (bakterii) - komórki (bakterie) wywodzÄ…ce siÄ™ z pojedynczego przodka KLONOWANIE Dlaczego klonujemy geny ? Øð kolejność uÅ‚ożenia nukleotydów (sekwencja genu) Øð poszukiwanie homologii ze znanymi genami Øð mechanizmy regulacyjne odpowiedzialne za aktywność genu Øð struktura i funkcja biaÅ‚ka wykorzystanie praktyczne w: żðprzemyÅ›le żðrolnictwie żðmedycynie żðfarmacji Tworzenie biblioteki genomowego DNA Biblioteka genomowa = zbiór wszystkich klonów bakteryjnych zawierajÄ…cych caÅ‚y genom organizmu Biblioteka genomowego DNA a biblioteka cDNA Biblioteka Biblioteka cDNA genomowego DNA GENOM CZAOWIEKA: Øðliczba genów czÅ‚owieka - ok. 25 tys. Øðw 3.2 mld nukleotydów: Øð1.1% - exony Øð24% - introny Øð75% - sekwencje niekodujÄ…ce KLONOWANIE DNA Metody klonowania DNA: 1. klonowanie tradycyjne 2. z zastosowaniem reakcji PCR 3. w oparciu o rekombinacjÄ™ homologicznÄ… KLONOWANIE DNA Co jest niezbÄ™dne (i przydatne) do klonowania: 1. Enzymy: a. enzymy restrykcyjne b. ligaza c. polimeraza DNA (PCR) 2. Wektory (plazmidy) 3. Bakterie 4. Startery (PCR) KLONOWANIE DNA ENZYMY RESTRYKCYJNE: Rodzaj enzymów bakteryjnych specyficznie przecinajÄ…cych nić DNA w okreÅ›lonych miejscach żðstanowiÄ… obronÄ™ bakterii przed obcym DNA żðsÄ… specyficzne przecinajÄ… DNA tylko po napotkaniu okreÅ›lonej sekwencji (4-8 nukleotydów) żðnajczęściej rozpoznajÄ… sekwencje palindromowe (np. KAJAK) żðgenerujÄ… lepkie lub tÄ™pe koÅ„ce żðnazwy biorÄ… od gatunku bakterii KLONOWANIE DNA Enzymy restrykcyjne LEPKIE KOCCE TPE KOCCE GAATTC GGCC CTTAAG CCGG EcoRI HaeIII G AATTC GG CC CTTAA G CC GG KLONOWANIE DNA KLONOWANIE DNA + wektor + LIGAZA fragment DNA pusty ALE TAKÅ»E: rekombinowany wektor wektor KLONOWANIE DNA LIGAZA: POLIMERAZA DNA: Enzym katalizujÄ…cy Å‚Ä…czenie wolnych Enzym katalizujÄ…cy syntezÄ™ DNA koÅ„ców DNA poprzez tworzenie na matrycy istniejÄ…cego DNA wiÄ…zaÅ„ fosfodiestrowych KLONOWANIE DNA WEKTOR: CzÄ…steczka DNA, która umożliwia wprowadzenie do komórki obcego fragmentu DNA " Zdolność do autonomicznej replikacji wewnÄ…trz komórki (ori) " Możliwość izolacji dużej iloÅ›ci wektorowego DNA bez zanieczyszczeÅ„ genomowym DNA " Obecność miejsc restrykcyjnych (polilinker) " Obecność genu umożliwiajÄ…cego selekcjÄ™ (np. oporność na antybiotyk, kolor kolonii) KLONOWANIE DNA Rodzaje wektorów: qð Plazmidy bakteryjne (do 30 tys. par zasad) qð Fagowe: żð bakteriofaga (do 40 tys. par zasad) żð bakteriofaga M13 jednoniciowy qð Kosmidy poÅ‚Ä…czenie bakteriofaga z plazmidem (do 40 tys. par zasad) qð Wektory wahadÅ‚owe funkcjonalne w bakteriach i drożdżach (do 40 tys. par zasad) qð Sztuczne chromosomy (YAC) klonowanie dużych fragmentów DNA (do 5 mln. par zasad) KLONOWANIE DNA Co siÄ™ robi ze sklonowanymi genami ? 1. Eksperymenty w hodowlach komórkowych: qð badanie wpÅ‚ywu danego genu na procesy fizjologiczne komórki qð interakcje z innymi genami (biaÅ‚kami) qð badanie lokalizacji komórkowej i okresu półtrwania qð badanie elementów regulatorowych genów - regulacja aktywnoÅ›ci qð produkcja okreÅ›lonego biaÅ‚ka na dużą skalÄ™ (do immunizacji zwierzÄ…t, do izolacji aktywnych zwiÄ…zków) 2. Tworzenie organizmów transgenicznych ORGANIZMY TRANSGENICZNE Organizm transgeniczny organizm do którego wprowadzono obcy lub zmodyfikowany gen (geny) ulegajÄ…cy dziedziczeniu ORGANIZMY TRANSGENICZNE Klon populacja identycznych pod wzglÄ™dem genetycznym organizmów, komórek, wirusów lub czÄ…steczek DNA Klonowanie uzyskanie klonu komórek, czyli grupy komórek potomnych pochodzÄ…cych od jednej komórki; każda komórka klonu powinna posiadać identyczny materiaÅ‚ genetyczny Klonowanie somatyczne usuwanie chromosomów aktywowanego oocytu (enukleacja) i wprowadzenie w ich miejsce jÄ…dra komórki somatycznej Transgen obcy lub zmodyfikowany gen zintegrowany z genomem gospodarza, trwale ulegajÄ…cy ekspresji i replikacji w jego komórkach, podlegajÄ…cy dziedziczeniu GMO genetically modified organism ORGANIZMY TRANSGENICZNE Sposoby uzyskiwania zwierzÄ…t transgenicznych: qð mikroiniekcja DNA do przedjÄ…drzy zygoty (przed pierwszym podziaÅ‚em) qð integracja DNA losowa qð maÅ‚e prawdopodobieÅ„stwo uzyskania pozytywnego rezultatu (1-4%) qð los transgenu niepewny (niestabilność, wygaszanie aktywnoÅ›ci) qð przydatne dla wielu gatunków zwierzÄ…t qð wprowadzenie DNA do embrionalnych komórek macierzystych (ES) qð integracja celowana (rekombinacja homologiczna) qð wiÄ™ksze prawdopodobieÅ„stwo uzyskania pozytywnego rezultatu (10-15%) qð transgen stabilny i aktywny qð stosowane głównie u myszy qð zastosowanie w tworzeniu zwierzÄ…t knock-out qð przez infekcjÄ™ embrionu zrekombinowanym wirusem (retrowirusy) qð najrzadziej stosowana qð wirusy RNA qð ograniczenie rozmiar wprowadzanego DNA ORGANIZMY TRANSGENICZNE Mikroiniekcja DNA do przedjÄ…drzy zygoty ORGANIZMY TRANSGENICZNE Wprowadzenie DNA do embrionalnych komórek macierzystych (ES) KOMÓRKI MACIERZYSTE niezróżnicowane komórki, które mogÄ… siÄ™ dzielić i dawać poczÄ…tek wyspecjalizowanym komórkom dowolnej tkanki CHIMERA - organizm zbudowany z komórek pochodzÄ…cych z 2 lub wiÄ™cej organizmów różniÄ…cych siÄ™ pod wzglÄ™dem genetycznym ORGANIZMY TRANSGENICZNE Wprowadzenie DNA do embrionalnych komórek macierzystych (ES) umożliwia nam: A wymianÄ™ sekwencji DNA (knock-in) B ukierunkowanÄ… delecjÄ™ sekwencji (knock-out) C dokÅ‚adanie genów ORGANIZMY TRANSGENICZNE Wprowadzenie DNA za poÅ›rednictwem rekombinowanych retrowirusów Embriony bez otoczki sÄ… hodowane razem z komórkami produkujÄ…cymi czÄ…steczki wirusa materiaÅ‚ genetyczny wirusa integruje do genomu embrionalnego uzyskane zwierzÄ™ ma zmieniony genom ORGANIZMY TRANSGENICZNE Do czego sÄ… nam potrzebne zwierzÄ™ta transgeniczne ? qð jako fabryki leków i organów (owce, kozy, krowy, Å›winie) qð modele chorób ludzkich qð obiekty do testowania nowych metod leczenia qð badania nad zÅ‚ożonymi procesami biologicznymi żð rozwój żð onkogeneza żð leczenie żð różnicowanie żð choroby dziedziczne żð funkcjonowanie mózgu żð choroby zwyrodnieniowe żð choroby zakazne żð odpowiedz ukÅ‚adu immunologicznego żð oddziaÅ‚ywanie miÄ™dzy organizmem a Å›rodowiskiem żð regulacja hormonalna ZwierzÄ™ta transgeniczne jako bioreaktory krowy, kozy, owce, pożądane biaÅ‚ka wytwarzane sÄ… w gruczoÅ‚ach mlecznych i wydzielane z mlekiem. Produkowane sÄ…: - antytrombina - ludzki enzym - czynnik krzepliwoÅ›ci - antytrypsyny - stosowanej w leczeniu rozedmy pÅ‚uc, - erytropoetyny - leczenie anemii , - Mleko z ludzkimi biaÅ‚kami nie uczula niemowlÄ…t ZwierzÄ™ta transgeniczne " Inne: - owce wytwarzajÄ…ce weÅ‚nÄ™ toksycznaÄ… dla moli i nie kurczÄ…cÄ… siÄ™ w praniu, - lepsza jakość miÄ™sa, mleka, - transgeniczne koty dla alergików - ich sierść nie powoduje alergii, - transgeniczne rybki akwariowe z genami z meduzy, dziÄ™ki którym fluoryzujÄ… w ciemnoÅ›ci KLONOWANIE SOMATYCZNE klonowanie somatyczne proces polegajÄ…cy na bezpÅ‚ciowym rozmnażaniu organizmów. Polega na usuniÄ™ciu chromosomów oocytu i wprowadzeniu na ich miejsce jÄ…dra komórki somatycznej ROÅšLINY TRANSGENICZNE Przy ich tworzeniu wykorzystujemy naturalne zjawisko transformacji nowotworowej roÅ›lin przez Agrobacterium tumefaciens Odpowiedzialny za to zjawisko jest plazmid Ti W naturze Agrobacterium infekuje okolice szyjki korzenia ROÅšLINY TRANSGENICZNE Metody uzyskiwania roÅ›lin transgenicznych A infekowanie rany w okolicy szyjki korzenia rekombinowanym Agrobacterium B transformacja komórek roÅ›linnych w hodowli (za pomocÄ… Agrobacterium lub metodami fizyko-chemicznymi) ROÅšLINY TRANSGENICZNE UZYSKIWANIE ROÅšLIN ODPORNYCH NA HERBICYDY ROÅšLINY TRANSGENICZNE Do czego sÄ… nam potrzebne roÅ›liny transgeniczne ? qð wzrost opornoÅ›ci na szkodniki, herbicydy, warunki meteorologiczne qð wzbogacenie o brakujÄ…ce substancje ( zÅ‚oty ryż ) qð ulepszenie dla przemysÅ‚u spożywczego (pomidor Flavr Savr pierwsze GMO wprowadzone do obrotu w 1994) ROÅšLINY TRANSGENICZNE RoÅ›liny transgeniczne uprawne: ØðnajwiÄ™kszy areaÅ‚ upraw: USA, Argentyna, Brazylia Øðnajczęściej uprawiane: soja, kukurydza, baweÅ‚na, rzepak ØðnajczÄ™stsze modyfikacje: tolerancja na herbicydy, odporność na szkodniki PrzykÅ‚ady roÅ›lin Tg w uprawach: 1. kukurydza odporna na szkodniki (omacnica prosowianka) MON 810 bakteryjny gen Bt produkujÄ…cy biaÅ‚ko Cry toksyczne dla niektórych gatunków motyli 2. rzepak, kukurydza, soja, buraki cukrowe odporność na herbicydy 3. baweÅ‚na odporna na herbicydy Kukurydza - odporność na owady - wszczepiony zostaÅ‚ gen odpowiedzialny za wytwarzanie biaÅ‚ka, które zjadane przez owada niszczy jego przewód pokarmowy co doprowadza do Å›mierci. BiaÅ‚ko to "dziaÅ‚a" tylko w organizmach niektórych, Å›ciÅ›le okreÅ›lonych gatunków owadów- szkodników, nie jest aktywne np. u czÅ‚owieka. - wytwarzanie substancji używanych do wyrobu leków lub szczepionek, Ziemniaki - wzrost zawartoÅ›ci skrobi, ponadto odmiany skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ wyÅ‚Ä…cznie z amylopektyny - u odmian tradycyjnych 20% skrobi to amyloza, którÄ… usuwa siÄ™ z ziemniaków przemysÅ‚owych co podnosi koszty, - odporność na herbicydy, stonkÄ™ ziemniaczanÄ…, wirusy, - "sÅ‚odkie ziemniaki" - wprowadzenie genu odpowiedzialnego za wytwarzanie sÅ‚odkiego biaÅ‚ka - taumatyny, - odporność na ciemnienie pouderzeniowe - wiÄ™ksza trwaÅ‚ość, - maÅ‚a zawartość glikoalkaloidów - substancji szkodliwych na czÅ‚owieka, wystÄ™pujÄ…cych w surowych ziemniakach. Pomidory - spowolnienie dojrzewania, wiÄ™ksza trwaÅ‚ość - wiÄ™ksza zawartość suchej masy, - poprawa smaku, - intensywniejsza barwa, cieÅ„sza skórka. Truskawka wyższa sÅ‚odkość owoców, - spowolnienie dojrzewania, - odporność na mróz. Soja - odporność na Å›rodki ochrony roÅ›lin na herbicydy, - odporność na wirusy, szkodniki, - obniżona zawartość kwasu palmitynowego. SaÅ‚ata - produkujÄ…ca szczepionkÄ™ na zapalenie wÄ…troby typu B - można siÄ™ szczepić jedzÄ…c saÅ‚atÄ™ - zostaÅ‚a ona opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego Winogrona - odmiany bezpestkowe.