2011-10-14 Teoria macierzystych komórek nowotworowych versus teoria klonalna Wprowadzenie do problematyki genetycznej nowotworów sporadycznych, rodzinnych i dziedzicznych. Prof. dr hab. Maria M. SÄ…siadek, Katedra i ZakÅ‚ad Genetyki WykÅ‚ad zostaÅ‚ przygotowany z wykorzystaniem przezroczy dostÄ™pnych na stronach NIH. Transformacja nowotworowa jako proces wieloetapowy Teoria macierzystych komórek (inicjacja, promocja, progresja) nowotworowych versus teoria klonalna Czas Inaktywacja Kumulacja mutacji Proliferacja Genetyczna supresorów, niestabilność genów mutatorowych, aktywacja protoonkogenów 1 2011-10-14 Utrata kontroli proliferacji komórkowej: Nowotwory sporadyczne PrawidÅ‚owe naprawa - Etiologia mieszana: narażenie na apoptoza czynniki rakotwórcze oraz tÅ‚o Uszkodzenie genetyczne . - Indywidualne ryzyko zachorowania na Transformacja nowotwór sporadyczny jest modulowane przez geny o niskiej penetracji. Nowotwory dziedziczne H" 5-10%, rodzinne H" 15%, sporadyczne H" 70-75%. Nowotwory rodzinne WiÄ™kszość nowotworów nie jest dziedziczna! " sÄ… uwarunkowane wieloczynnikowo " w rodowodzie obserwowana jest akumulacja nowotworów, ale ich wystÄ™powanie nie speÅ‚nia kryteriów znanych sposobów dziedziczenia 2 2011-10-14 Nowotwory sporadyczne versus nowotwory dziedziczne. Nowotwory dziedziczne Uwarunkowane autosomalnie recesywnie " xeroderma pigmentosum, trichothiodystrofia, zespół Blooma, anemia Fanconiego, zespół Nijmegen - geny naprawy DNA Uwarunkowane autosomalnie dominujÄ…co " " geny supresorowe lub mutatorowe " " Å›rednia wieku, w którym wystÄ™puje nowotwór jest niższa niż w przypadkach nowotworów sporadycznych " " ryzyko rozwoju nowotworu jest zależne od wieku " " ryzyko rozwoju nowotworu dla nosicieli mutacji dotyczy nie tylko narzÄ…du krytycznego (np. raka jelita grubego w HNPCC), ale też innych narzÄ…dów tzw. spektrum nowotworów dla mutacji danego Mutacja germinalna genu Mutacja somatyczna Geny kluczowe w procesie transformacji Nowotwory sporadyczne versus nowotwory nowotworowej: dziedziczne. Mutacje somatyczne Mutacje germinalne Geny wysokiej penetracji W komórkach somatycznych W komórkach rozrodczych " Protoonkogeny Nie sÄ… dziedziczne SÄ… dziedziczne " Geny supresorowe SÄ… przyczynÄ… zespołów nowotworów dziedzicznych " Geny mutatorowe Geny Å›redniej i niskiej penetracji niedziedziczne " w genach o Å›redniej penetracji wystÄ™pujÄ… mutacje lub polimorfizmy, które mogÄ… zmieniać indywidualne ryzyko rozwoju nowotworu w stosunku do ryzyka populacyjnego Mutacje we Mutacje w wszystkich komórkach komórkach " w genach o niskiej penetracji wystÄ™pujÄ… polimorfizmy, rozrodczych potomków które mogÄ… modulować indywidualnÄ… podatność na dziaÅ‚anie czynników rakotwórczych (np. GSTT, NAT2, XPD, XRCC3). 3 2011-10-14 Geny o wysokiej penetracji versus geny o niskiej Cykl komórkowy: penetracji Geny o wysokiej penetracji versus geny o Å›redniej i niskiej penetracji. Matrix proteazy fibroblasty cytokiny Naczynia krwionoÅ›ne 4 2011-10-14 Onkogeny Mechanizmy dziaÅ‚ania onkogenów Normal Growth-Control Pathway Growth factor Kontrola Komórka prawidÅ‚owa proliferacji, Receptor wzrostu i różnicowania Signaling enzymes Transcription factors DNA Cell nucleus Onkogeny stymulujÄ… Komórka nowotworowa niekontrolowanÄ… proliferacjÄ™ Cell proliferation Mutacja onkogenu Onkogeny Mechanizmy aktywacji protoonkogenów: translokacja zrównoważona, amplifikacja 9 9 (q+) Kontrola proliferacji Ph 22 (22q ) bcr bcr-abl 1-sza mutacja abl akceleracja proliferacji BiaÅ‚ko fuzyjne (o wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciach kinazy tyrozynowej) 5 2011-10-14 Geny supresorowe Mechanizmy dziaÅ‚ania genów supresorowych Funkcjonalne geny blokujÄ… transformacjÄ™ Utrata funkcji supresorów Transformacja Utrata funkcji obu alleli http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/genetics/risk-assessment-and-counseling Geny supresorowe Geny kodujÄ…ce biaÅ‚ka usuwajÄ…ce zle sparowane zasady ( mismatch repair) Normal DNA repair T C G A C 1 mutacja Base pair No cancer mismatch T C T A C 2 mutacja AG C T G T C T A C T C T A C AG C T G Cancer A G T G A G A T G No DNA repair 6 2011-10-14 Hipoteza dwóch uderzeÅ„ (Two-Hit Hypothesis) Geny naprawy DNA Mutacja germinalna Mutacja somatyczna http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/genetics/risk-assessment-and-counseling Utrata heterozygotycznoÅ›ci (Loss of Utrata heterozygotycznoÅ›ci Heterozygosity, LOH) Geny wrażliwoÅ›ci na rozwój nowotworu Mutacje germinalne http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/genetics/risk-assessment-and-counseling 7 2011-10-14 Mechanizmy prowadzÄ…ce do utraty prawidÅ‚owego Metylacja zmienia ekspresjÄ™ genów allelu CpG island Gene Alel prawidÅ‚owy Allel zmutowany Me Me CpG island Utrata prawidÅ‚owego allelu becomes HDAC histone deacetylase complex methylated Delecja Mikrodelecja Translokacja Utrata i Rekombinacja Mutacja chromosomu niezrównoważona reduplikacja punktowa Methyl-binding proteins Me Me Gene inactivated HDAC modifies chromatin Epigenetyczna kontrola ekspresji genów Wzór metylacji w nowotworach (hypermetylacja promotoró, hypometylacja globalna: (a) Increased CpG island methylation -inactivation of tumour suppressor genes (e.g. p16) -inactivation of DNA repair genes (e.g.MLH1) (b) Reduced global DNA methylation -reduced chromosome stability -activation of retrotransposons -activation of oncogenes CpG island hypermethylation profile of human cancer D. Rodenhiser, M. Mann; Can Med Assoc J (2006 8 2011-10-14 Geny o wysokiej penetracji versus geny o Å›redniej i Nowotwory wpÅ‚yw czynników egzogennych i endogennych niskiej penetracji. Age Age Age Hormones Alcohol Alcohol Diet Diet Diet Obesity Matrix Smoking Smoking Carcinogens Weak immune Viruses proteazy system fibroblasty Cancer Cancer cytokiny Naczynia krwionoÅ›ne Czas http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR03_DNADamageResponse.aspx 9 2011-10-14 Geny o Å›redniej i niskiej penetracji Phase I - Cytochrome P 450 - multigene superfamily of mixed function oxygenases, - localised mainly in the microsomes, but also in the nuclei, Biometabolizm ksenobiotyków - divided into 10 subfamilies, on the basis of protein- aktywacja (faza I) sequence homology. dezaktywacja (faza II) - several polymorphisms have been identified in these genes Geny cyklu komórkowego: - supresory cyklu - geny Å›mierci komórki -kodowanie sygnałów Geny różnicowania komórek Geny naprawy DNA (NER, BER itd.) Geny naczyniogenezy Geny biaÅ‚ek warunkujÄ…cych przyczepność do macierzy -http://dragon.zoo.utoronto.ca/~J02T0301B/cyptree.htm Phase II Dwa główne mechanizmy determinacji indywidualnego ryzyka zachorowania na chorobÄ™ nowotworowÄ… glutatione S-transferases (GST) The family of enzymes which detoxify the electrophilic substances (formed during the phase I), by catalysing the reaction of coniugation of 1. Efektywność procesów biotransformacji reactive electrophiles to the glutathione. zwiÄ…zków egzogennych: Faza I- aktywacji. Konwersja pierwotnie biologicznie nieaktywnych postaci do postaci reaktywnych N-acetyl transferases (NATs) Faza II detoksyfikacji. Usuwanie zwiÄ…zków z organizmu. The group of cytosolic enzymes, involved in the dotoxification of various xenobiotics (phase II), by catalysing the transfer of acetate from acetyl 2. Efektywność naprawy DNA CoA to amine and hydrazine groups 10 2011-10-14 DNA repair systems Zmiany molekularne w nowotworach Cross-links Single-strands breaks Base damage Double-strands break S / G2 G1 DR direct reversion BER - base excision repair SSA NHEJ HRR NER nucleotide excision single strand non homologous homologous repair annealing end joining recombination repair MMR mismatch repair Nowotwory sporadyczne. ZiÄ™tek, 2002 11 2011-10-14 A wiÄ™c& & . Ryzyko indywidualne rozwoju nowotworu zależy od & & Czynniki egzogenne Pacjent z chorobÄ… nowotworowÄ… =10 osób Pochodzenie etniczne Ryzyko indywidualne rozwoju nowotworu zależy od & & Nowe przypadki zachorowania na raka jelita grubego Japonia USA Czynniki endogenne: JapoÅ„czycy, urodzeni w USA Ja[ponki, 142.5 urozone w USA JapoÅ„czycy, Japonki, urodzeni w urodzone w 90.1 Japonii Japonii 69.3 63.5 System immunologiczny Polimorfizmy w genach biometobolizmu Polimorfizmy genów naprawy DNA *Roczna czÄ™stość zachorowania na 100,000 mieszkaÅ„ców Zmiany w poziomach hormonów 12 2011-10-14 Alterations in xenobiotic inactivation (phase II) Decrease in DNA-repair Hyperactive Slow Chromosome Gene DNA Gene mutation Chromosome Gene Excision repair protein Carcinogen Carcinogen Water-soluble Water-soluble DNA carcinogen carcinogen Gene mutation Excision repair protein Mutagenic/carcinogenic agents may induce alterations in the genome et any level of its organisation. Mismatch repair Normal DNA repair T C G A C Base pair Gene No cancer mismatch T C T A C AG C T G Chemical DNA molecule bases (chromosome) T C T A C T C T A C AG C T G Cancer A T C A G T G A G A T G G No DNA repair 13 2011-10-14 Tobacco Use and Cancer Smoking and Susceptibility to Lung Cancer Phase I Some Cancer-Causing Chemicals in Tobacco Smoke Hyperactive Activator Lazy Activator Precarcinogen Precarcinogen Carcinogen Carcinogen Smoking and Susceptibility to Lung Cancer Phase II Smoking and Susceptibility to Lung Cancer Active Eliminator Lazy Eliminator Carcinogen Carcinogen Activator Precarcinogen Carcinogen Water-Soluble Water-Soluble Carcinogen Eliminator Carcinogen 14 2011-10-14 Bladder Cancer Risk Lazy Acetylator Deaminator Arylamines Precarcinogen Nonreactive compound (safely removed from body) Carcinogen Arylamines and Bladder Cancer Deaminator Acetylator Arylamines Nonreactive Precarcinogen Poradnictwo genetyczne w onkologii. compound (safely removed from body) Carcinogen 15 2011-10-14 PrzykÅ‚ad: BRCA1-zależny dziedziczny rak piersi i Cele i zakres poradnictwa genetycznego w jajnika onkologii. " identyfikacja osób i rodzin o podwyższonym ryzyku zachorowania na chorobÄ™ nowotworowÄ… 92 PierÅ› 45 86 d 89 " rozpoznanie zespołów nowotworów dziedzicznych na podstawie analizy rodowodu, PierÅ› 59 73 68 Jajnik 59 d 62 " podjÄ™cie decyzji o kierunku i zakresie badaÅ„ molekularnych Bez mutacji Nosiciel mutacji BRCA1 ChorujÄ…cy na raka PierÅ› 36 Rozpoznanie zespoÅ‚u dziedzicznej predyspozcji Kryteria rozpoznania zespoÅ‚u dziedzicznego raka do nowotworów jest stawiane na podstawie piersi lub/i jajnika analizy rodowodu " " diagnoza definitywna: 3 krewnych chorujÄ…cych na raka piersi/jajnika w dowolnym wieku " " diagnoza prawdopodobna: " dwa przypadki zachorowania na nowotwór piersi i/lub jajnika w rodzinie " rak piersi rozpoznany przed 45 r.ż. " rak piersi i jajnika u tej samej osoby " atypowy lub atypowy-rdzeniasty rak piersi " obustronny rak piersi " rak jajnika pochodzenia nabÅ‚onkowego rozpoznany w dowolnym wieku " rak piersi u mężczyzny 16 2011-10-14 Co może utrudnić interpretacjÄ™ rodowodu? Kryteria rozpoznania HNPCC: " MaÅ‚o liczna rodzina Zmodyfikowane kryteria amsterdamskie wg ICG-HNPCC " Åšmierć czÅ‚onków rodziny (głównie w mÅ‚odym wieku) (ang. International Collaborative Group on HNPCC): " UsuniÄ™cie narzÄ…dów krytycznych (np. usuniÄ™cie macicy i jajników z powodu włókniaków macicy lub endometriozy) " " u co najmniej 3 czÅ‚onków rodziny stwierdzono zweryfikowanego histopatologicznie raka jelita grubego " Nieprawdziwe dane dotyczÄ…ce pochodzenia lub trzonu macicy, jelita cienkiego, dróg moczowych; " Pózny poczÄ…tek choroby jeden z chorych jest krewnym Iº dwóch pozostaÅ‚ych; " NiepeÅ‚na penetracja wykluczono polipowatość rodzinnÄ… " Zmienna ekspresja " Heterogenność genetyczna " " co najmniej 2 z chorych osób to krewni Iº, w dwóch " Imprinting genomowy różnych pokoleniach " Mutacje de novo " Mozaicyzm " " przynajmniej u jednej z chorych osób rak zostaÅ‚ " Dziedziczenie mitochondrialne zdiagnozowany <50 r.ż. " MałżeÅ„stwa krewniacze " Rozród wspomagany (dawca komórek jajowych lub plemników) http://www.cancer.gov/cancerinfo/pdq/genetics/risk-assessment-and-counseling Kryteria Betesda (zmodyfikowane): NiepeÅ‚na penetracja i fenokopie " " rak jelita grubego zdiagnozowany <50 r.ż. " " obecność synchronicznych, metachronicznych raków jelita grubego lub innych zwiÄ…zanych z HNPCC nowotworów, niezależnie od wieku " " rak jelita grubego ze stwierdzonym wysokim poziomem niestabilnoÅ›ci mikrosatelitarnej (MSI-H) w guzie, zdiagnozowany u pacjenta <60 r.ż. " " rak jelita grubego zdiagnozowany u 1 lub wiÄ™cej krewnych Zdrowy chorego z nowotworem zwiÄ…zanym z HNPCC, jeden z Nosiciel nowotworów zostaÅ‚ zdiagnozowany <50 r.ż. Nosiciel mutacji, chorujÄ…cy " " rak jelita grubego zdiagnozowany u 2 lub wiÄ™cej krewnych Nowotwór sporadyczny Iº lub IIº z nowotworem zwiÄ…zanym z HNPCC, niezależnie od wieku 17 2011-10-14 Mutacje de novo Czynniki wpÅ‚ywajÄ…ce na penetracje Ujemny wywiad rodzinny w odniesieniu do nowotworów dziedzicznych Nowa mutacja w komórkach germinalnych Geny modyfikatory Karcinogeny Å›rodowiskowe Chore potomstwo Estrogeny Hormony Dziedzicznym polipowaty rak jelita Geny naprawy DNA grubego 30% MEN 2B 50% Odpowiedz na uszkodzenia DNA Siatkówczak dziedziczny 50% Różne locus, różne allele (heterogenność Penetracja zależna od wieku niealleliczna), ten sam fenotyp 100 Chromosome 17 Chromosome 13 80 Nosiciel mutacji Allel (gen) Osoby 60 chorujÄ…ce (%) Locus 40 (miejsce w genie) Allel (gen) 20 Ogólna Locus populacja (miejsce w genie) 0 20 40 60 80 BRCA1 BRCA2 Wiek Dziedziczny rak piersi i jajnika 18 2011-10-14 Heterogenność alleliczna (BRCA1) Diagnostyka molekularna nowotworów na przykÅ‚adzie raka piersi/jajnika Lokalizacja chromosom 17 Funkcja stabilizacja genomu Dziedziczenie: Znanych mutacji ~ autosomalne, 1200 " Najważniejszymi genami zwiÄ…zanymi z rodzinnym dominujÄ…ce wystÄ™powaniem raka piersi i jajnika sÄ…: BRCA 1 (Miki et al 1994, OMIM 113705) BRCA 2 (Wooster et al 1995, OMIM Nonsense/zmiana ramki odczytu 600185) Missense Mutacja splicingowa Diagnostyka molekularna schemat ( LubiÅ„ski et al.. 2002) PrzykÅ‚ad: BRCA2-zależny dziedziczny rak piersi pierÅ› 44 DNA d 48 PTT HD PCR SSCP Krew obwodowa d 83 Jajnik 65 d 68 CzÄ™sto niepeÅ‚na penetracja Prostata 64 5 Bases A A G A G A S M M C Bez nowotworu Nosiciel mutacji Chory PierÅ› 33 38 35 42 19 2011-10-14 PrzykÅ‚ad: efekt fundatora w populacji BRCA1 Å»ydów Aszkenazyjskich WÅ›ród Å»ydów Aszkenazyjskich 1 na 40 jest nosicielem mutacji BRCA1 lub BRCA2 BRCA1 185delAG 5382insC CzÄ™stość ~1% CzÄ™stość ~0.15% BRCA2 BRCA2 6174delT CzÄ™stość ~1.5% Co uÅ‚atwia decyzjÄ™ o kierunku diagnostyki Spektrum mutacji genu BRCA1 w Polsce w rodzinach z molekularnej? silnÄ…agregacjÄ…raków piersi/jajnika Rozpowszechnienie mutacji i efekt zaÅ‚ożyciela Mutacja Ekson Liczba rodzin 5382 insC 20 68 C61G 5 31 4153delA 11 12 5370C/T 20 4 3819del5 11 3 794delT 11 2 185delAG 2 1 2985del5 11 1 5149del4 17 1 ZiÄ™tek, 2002 20 2011-10-14 Trudna decyzja Badania genetyczne w nowotworach - 100 ograniczenia 50 40 Procent populacji 30 20 10 Jest mutacja, ale: 0 " Może nigdy nie doprowadzić do choroby Nie chce Chce " Może pozostać nie wykryta wiedzieć wiedzieć Badania genetyczne w nowotworach - Porada genetyczna korzyÅ›ci " interpretacja wyników badaÅ„ molekularnych i wytypowanie osób w rodowodzie, u których powinny być wykonane badania (badania w rodzinie powinny być w pierwszej kolejnoÅ›ci przeprowadzone, o ile jest to możliwe, u osób z choroba nowotworowÄ…). " opracowanie porady genetycznej dla nosicieli mutacji genów krytycznych, uwzglÄ™dniajÄ…cej schematy postÄ™powania profilaktyczno-diagnostycznego u osób chorujÄ…cych na nowotwór przed i po leczeniu oraz u zdrowych nosicieli mutacji " opracowanie porady genetycznej dla czÅ‚onków rodzin, w których zostaÅ‚ rozpoznany zespół nowotworów dziedzicznych, ale nie zostaÅ‚a zidentyfikowana krytyczna mutacja. " Brak mutacji ulga !!! " Jest mutacja - badania profilaktyczne " - Å›wiadome decyzje " - możliwoÅ›ci wczesnej interwencji medycznej 21 2011-10-14 Testy genetyczne wykrywajÄ… predyspozycjÄ™, a nie Ograniczenia techniczne chorobÄ™! Ryzyko rozwoju nowotworu do 65 roku życia: 100 10 90 9 80 8 70 7 60 6 50 5 40 4 30 3 20 2 10 1 0 0 Z mutacjÄ… BRCA1 Bez mutacji BRCA1 Konieczność porady genetycznej Ryzyko rozwoju nowotworu u pacjentek z mutacjÄ… BRCA1 Rak piersi: 50% - 73% do 50 r. ż. " 65% - 87% do 70 r. ż. Rak jajnika 40% do 70 r.ż. BRCA2 Rak piersi: 59% do 50 r.ż " 82% do 70 r. ż. Rak jajnika: 29% do 50 r. ż. 63% do 70 r.z. 22 2011-10-14 Schemat badaÅ„ kontrolnych w rodzinach z zespoÅ‚ami dziedzicznego raka Rodowód rodziny z rozpoznanym HNPCC sutka/jajnika PierÅ›: " Samokontrola " 20rż. ( co 6 m-cy) " Badanie palpacyjne " 20-25 (co 6 m-cy) " USG " 25 (co 12 m-cy) " Mammografia " 35 (co 12 m-cy) " 30-35 lat (co 12 m-cy) NarzÄ…d rodny " USG dopochwowe " 30-35 lat (co 12 m-cy) " CA 125 Nowe geny w diagnostyce klinicznej Rodowód rodziny z rozpoznanym dziedzicznym rakiem piersi 23 2011-10-14 Specyficzność testu 2500 kobiet testowanych w kierunku raka jajnika NOD2: rak piersi i pÅ‚uc (3020insC), rak jelita Dodatnie Ujemne FaÅ‚szywie dodatnie grubego 100% specyficznoÅ›ci - akceptowane CHEK2: mutacje skracajÄ…ce biaÅ‚ko CHEK2 majÄ… istotne znaczenie dla ryzyka zachorowania na raka prostaty, piersi i tarczycy, podczas gdy variant I157T (missense) Å‚Ä…czy siÄ™ ze zwiÄ™kszonym ryzykiem raka piersi, prostaty, jelita grubego, nerki i tarczycy. NBS1: rak piersi, rak prostaty (LubiÅ„ski, 2004) melanoma, non-Hodgkin lymphoma, rak jajnika, rak jelita grubego Kryteria wprowadzenia testów diagnostycznych: CzuÅ‚ość testu " Efektywność kliniczna (wczesne wykrycie modyfikuje prognozÄ™) chorujÄ…ce " Akceptowalność testu przez pacjenta " Uciążliwość testu 100% Niska czuÅ‚ość testu! " Aspekty psychologiczne " Efektywność ekonomiczna: wykryte " Ceny testów * FaÅ‚szywie " Cena leczenia w przypadkach dodatnie pózno wykrytych 24 2011-10-14 Badania molekularne przy wyborze terapii Diagnostyka molekularna - perspektywy Klasyczna Te same nowotwory, odmienne leczenie Inna terapia Tkanka Badania histopatologiczne nowotworowa efektywna Proteomika PrzyszÅ‚ość Wyniki badaÅ„ molekularnych Spektrometria masowa Genomika efektywna Tkanka s nowotworowa DNA Gene chip Microarray Klasyfikacja molekularna nowotworów Tajemnica lekarska Pacjent z Pacjent z Pacjent z Pacjent z rakiem pÅ‚uc A rakiem pÅ‚uc B rakiem pÅ‚uc C rakiem pÅ‚uc D biopsja biopsja biopsja biopsja mikromacierz mikromacierz mikromacierz mikromacierz Rak drobnokomórkowy Niedrobnokomórkowy rak pÅ‚uc Adenocarcinoma Rak wielkokomórkowy 25 2011-10-14 Money makes the world go round& & 26