ARCH. MED. S
D. KRYM., 2009, LIX, 9-14 PRACE ORYGINALNE
Tomasz Kupiec, Wojciech Branicki
badania genetyczne domniemanych szczątków
generała Władysława Sikorskiego
Genetic analysis of the putative remains of general Władysław Sikorski
Z Instytutu Ekspertyz SÄ…dowych im. prof. dra Jana Sehna w Krakowie
Dyrektor: dr hab. M. Kała
Praca przedstawia wyniki identyfikacyjnych badań profile was also determined in hair revealed on
genetycznych przeprowadzonych na materiale po- the underpants and shirt secured from the studied
branym podczas ekshumacji domniemanych zwłok body. The mitochondrial DNA profile determined in
generała Władysława Sikorskiego pochowanego the bone material and also in the hair matched the
w sarkofagu w Krypcie św. Leonarda w Katedrze na profile characteristic for a female relative through
Wawelu. Z zabezpieczonych do badań genetycznych the maternal line of general Władysław Sikorski. The
próbek  fragmentu kości udowej oraz zęba uzyskano obtained evidence supports the hypothesis that the
pełny komplet wyników w zakresie analizy autoso- studied body is that of general Sikorski. An additional
malnych markerów typu STR, markerów Y-STR oraz analysis of position SNP rs12913832 located on the
sekwencji regionów HVI i HVII mitochondrialnego HERC2 gene revealed the presence of genotype C/C,
DNA. Taki sam profil mtDNA oznaczono również we which suggests that general Władysław Sikorski had
włosach ujawnionych na spodenkach i koszuli zabez- light (most probably blue) eyes.
pieczonych na zwłokach. Profil mitochondrialnego
DNA oznaczony w materiale kostnym oraz we włosach Słowa kluczowe: generał Władysław Sikor-
okazał się zgodny z profilem charakterystycznym ski, szczątki ludzkie, identyfikacja genetycz-
dla krewnej w linii matczynej generała Władysława na, mtDNA
Sikorskiego. Uzyskany dowód przemawia na korzyść Key words: general Władysław Sikorski, hu-
hipotezy, że zwłoki będące przedmiotem badań należą man remains, genetic identification, mtDNA
do generała Sikorskiego. Przeprowadzona dodatko-
wo analiza pozycji SNP rs12913832 zlokalizowanej WST
P
w genie HERC2 wykazała obecność genotypu C/C, co
sugeruje, że generał Władysław Sikorski posiadł jasny Proces identyfikacji zwłok ofiar katastrof,
(najprawdopodobniej niebieski) kolor oczu. zamachów terrorystycznych oraz konfliktów
zbrojnych należy do najpoważniejszych zadań
The paper presents results of genetic identification współczesnych nauk sądowych. Na skutek na-
studies carried out in material collected during turalnego procesu rozkładu ciała oraz wpływu
exhumation of the putative body of general Władysław niekorzystnych czynników zewnętrznych, często
Sikorski, buried in a sarcophagus in Saint Leonard s nie jest możliwe ustalenie charakterystycznych
crypt in the Wawel Cathedral. The analysis of cech wyglądu osoby będącej przedmiotem iden-
STR-type autosomal markers, Y-STR markers and tyfikacji i zastosowanie najprostszej metody jej
sequences of HVI and HVII regions of mitochondrial identyfikacji polegajÄ…cej na rozpoznaniu. brak
DNA carried out in samples collected for genetic dostępu do danych medycznych, a zwłaszcza
analysis  fragments of the thigh bone and a tooth kart dentystycznych, jak również danych dakty-
 yielded a full set of results. The same mtDNA loskopijnych ogranicza możliwość wykorzysta-
10 Tomasz Kupiec Nr 1
nia podstawowych metod kryminalistycznych, postanowienia, poddano także zabezpieczone
a w konsekwencji sprawia, że jedyną skuteczną fragmenty odzieży znalezione na zwłokach
metodą identyfikacji zwłok pozostaje porów- w postaci: chusteczki materiałowej, podkoszul-
nawcza analiza DNA. Wysoka skuteczność ka, ocieplacza na biodra, spodenek, fragmentu
technik genetycznych wynika przede wszystkim obszycia podkoszulka, koszuli, fragmentu taśm
z ich wysokiej czułości, która umożliwia analizę materiałowych oplatających stopy, kolana
szczątków o znacznym stopniu rozkładu biolo- i kciuk, fragmentu dwóch kocy barwy khaki, oraz
gicznego, a także tych, które podlegały działaniu poduszki. W trakcie przeprowadzonych oględzin
skrajnie niekorzystnych czynników fizycznych ujawniono na koszuli oraz spodenkach obec-
i chemicznych. Co więcej, współczesna genetyka ność włosów ludzkich, z których pięć pobrano
sądowa dysponuje różnorodnymi markerami ge- do badań genetycznych (W1-W5).
netycznymi, w tym polimorficznymi sekwencjami
zlokalizowanymi w dziedziczonym w linii matczy- Materiał porównawczy
nej mitochondrialnym DNA oraz w linii ojcowskiej Jako materiał porównawczy pobrano wymaz
chromosomie Y. Dzięki ich zastosowaniu, nawet ze śluzówki jamy ustnej krewnej w linii matczynej
przy braku najbliższej rodziny możliwe jest prze- generała Władysława Sikorskiego, pani Ewy
prowadzenie analizy porównawczej w oparciu Wojtasik (P1). Przedmiotem badań był również
o materiał pochodzący od dalekich krewnych, materiał biologiczny obecny na przedmiotach
również tych żyjących w znacznym odstępie osobistego użytku generała Władysława Si-
czasowym od osoby identyfikowanej. korskiego i zabezpieczony z nich za pomocÄ…
Stan zachowania domniemanych zwłok taśm do zbierania mikrośladów oraz jałowych
generała Sikorskiego, będących przedmiotem pałeczek wymazowych. badaniom poddano: 8
niniejszych badań, uniemożliwił ich identyfikację śladów (S1-S8) pobranych z pantofli i szczotki
przez rodzinę i świadków. brak zachowanych do munduru przekazanych przez krewną Ge-
kart daktyloskopijnych, kart dentystycznych nerała, a także 27 śladów biologicznych (S9-
i innych danych medycznych dotyczących S35) pobranych z elementów umundurowania
generała Władysława Sikorskiego uniemożli- i przedmiotów udostępnionych przez Muzeum
wił ich wykorzystanie w procesie identyfikacji, Wojska Polskiego w Warszawie.
który w tej sytuacji mógł polegać jedynie na Próbki materiału kostnego (K1, Z1) poddano
analizie DNA. W czasie sekcji zwłok do badań procesowi oczyszczania  myto pod bieżącą
genetycznych zabezpieczono fragmenty tkanek wodą, w 15% podchlorynie sodu, a następnie
kostnych, które stanowią najlepszy rodzaj ma- w 70% etanolu. Dodatkowo zostały one poddane
teriału badawczego. W charakterze materiału działaniu promieniowania UV. Tak przygotowany
porównawczego wykorzystano próbkę DNA po- materiał, po wysuszeniu, poddano kruszeniu
chodzącą od wnuczki siostry generała. Podjęto w ciekłym azocie z zastosowaniem aparatu
również próbę pozyskania materiału genetycz- FreezerMill 6750 (Spex CertiPrep, Matuchen,
nego pochodzącego bezpośrednio od genera- USA). Około 3 g proszku kostnego inkubowano
Å‚a. W tym celu zabezpieczono Å›lady materiaÅ‚u w temperaturze 56°C przez noc w obecnoÅ›ci
biologicznego z należącej do niego odzieży 3 ml buforu lizującego (0,5M EDTA, 10% SDS)
i przedmiotów osobistego użytku przekazanych z dodatkiem 225 µl proteinazy K (10 mg/ml) oraz
przez najbliższÄ… rodzinÄ™ oraz udostÄ™pnionych 120 µl 1M DTT. Po inkubacji próbki koÅ›ci podda-
przez Muzeum Wojska Polskiego w Warszawie. no dwukrotnej ekstrakcji zbuforowanÄ… mieszani-
Zgodnie z przedstawionym przez Instytut PamiÄ™- nÄ… fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego
ci Narodowej postanowieniem pobrano i pod- (Sigma Chemical, Steinhaim, Niemcy), a następ-
dano analizie genetycznej ślady biologiczne nie zagęszczano na kolumienkach typu Amicon
z elementów odzieży znalezionej przy zwłokach Ultra  15 (Millipore, billerica, USA).
będących przedmiotem ekshumacji. Izolacja materiału genetycznego z zabezpie-
czonych włosów (W1-W5) poprzedzona została
MATERIAA
Y I METODY ich wstępnym trawieniem w buforze lizującym
z dodatkiem proteinazy K (10 mg/ml), a następnie
Materiał dowodowy płukaniem sterylną wodą. Zabiegi te prowadzono
W czasie sądowo-lekarskich oględzin i sekcji w celu pozbycia się ewentualnych cząsteczek
zwłok, do badań identyfikacyjnych pobrano obcego DNA z powierzchni włosów.
fragment kości udowej (K1) oraz ząb-kieł (Z1). ślady biologiczne (S1-S35), materiał po-
badaniom biologicznym, zgodnie z treścią równawczy (P1) oraz włosy (W1-W5) poddano
Nr 1 bADANIA GENETYCZNE 11
izolacji DNA z wykorzystaniem aparatu bioRobot prowadzi do zmniejszenia ekspresji genu OCA2
M48 oraz zestawu MagAttract DNA Mini M48 i jest silnie skorelowana z niebieskim kolorem tÄ™-
Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Stężenie DNA czówki oczu [2, 3]. Analizę wykonano z użyciem
okreÅ›lono za pomocÄ… zestawu Pico®Green ds. metody wydÅ‚użania startera i zestawu SNaPshot
DNA Quantitation Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) multiplex kit stosujÄ…c uprzednio zastosowanÄ…
z zastosowaniem aparatu Fluoroskan Ascent FL. procedurÄ™ [4].
DNA wyizolowany z próbek materiału kostnego
(K1, Z1), materiału porównawczego (P1) oraz WYNIKI
próbek S1-S35 poddano analizie autosomal-
nych markerów typu STR, wchodzących w skład Uzyskano pełne profile DNA w zakresie poli-
zestawu AmpFISTR® Identifiler® lub/i MiniFiler® morficznych markerów DNA typu STR zlokalizo-
(Applied biosystems, Foster City, USA). Próbki, wanych na chromosomach autosomalnych oraz
w których stwierdzono obecność męskiego na chromosomie Y. Te same profile oznaczono
komponentu DNA, poddano następnie analizie przy tym w obu analizowanych fragmentach
markerów Y-STR wchodzących w skład zestawu kostnych (próbki Z1 i K1). badania genetyczne
AmpFISTR® Yfiler® (Applied biosystems, Foster potwierdziÅ‚y, że analizowane próbki pochodzÄ…
City, USA). Reakcje amplifikacji prowadzono od mężczyzny. Otrzymane wyniki analizy poli-
z zastosowaniem aparatu GenAmp 9700 ther- morficznych markerów DNA jądrowego zamiesz-
mocycler, a rozdział produktów PCR z zastoso- czono w tabelach I i II.
waniem analizatora genetycznego AbI PRISM
3100 Avant (Applied biosystems, Foster City, Tab. I. Wyniki badania autosomalnych markerów typu
USA). Stosowano przy tym oryginalne protokoły STR dla pobranych fragmentów kostnych.
producenta. Tab. I. Analysis results of autosomal STR markers of
Materiał genetyczny wyizolowany z fragmen- secured bone samples.
tów kostnych K1 i Z1, materiału porównawczego
Układ polimorficzny
Z1 K1
P1, jak również uzyskany z pobranych w cza-
Polymorphic system
sie oględzin odzieży włosów W1-W5 został
D8S1179 11,16 11,16
poddany analizie super-zmiennych regionów
mitochondrialnego DNA HVI i HVII. ReakcjÄ™
D21S11 29,30 29,30
amplifikacji prowadzono w całkowitej objętości
20 µl. W skÅ‚ad mieszaniny reakcyjnej wchodziÅ‚
D7S820 8,12 8,12
10 µl Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, Hilden,
Niemcy), 1 µl starterów PCR [1] oraz 9 µl ma-
CF1PO 10,12 10,12
trycy DNA. Rezultaty amplifikacji sprawdzano
przy użyciu elektroforezy kapilarnej na aparacie D3S1358 15,16 15,16
Qiaxcel (Qiagen, Hilden, Niemcy). 5 µl pro-
TH01 6,8 6,8
duktu PCR oczyszczano za pomocÄ… zestawu
Exo-SAP IT (Amersham Pharmacia, Freiburg,
D13S317 11 11
Niemcy) i poddawano reakcji sekwencjonowa-
nia. Sekwencjonowanie prowadzono z użyciem
D16S539 9,11 9,11
starterów zastosowanych do amplifikacji i ze-
stawu bigDye"! Terminator Cycle Sequencing
D2S1338 18,21 18,21
Ready Reaction Kit 1.1 (Applied biosystems,
D19S433 12,16.2 12,16.2
Foster City, USA). Produkty sekwencjonowania
oczyszczono przy użyciu zestawu Centri Sep"!
VWA 16,17 16,17
Column (Applied biosystems, Foster City, USA),
a następnie rozdzielano elektroforetycznie z uży-
TPOX 8 8
ciem analizatora AbI PRISM 3100 (Applied bio-
systems, Foster City, USA). Otrzymane sekwen-
D18S51 17,19 17,19
cje analizowano i porównywano do sekwencji
Amelogenina X,Y X,Y
referencyjnej przy pomocy programu SeqScape
(Applied biosystems, Foster City, USA).
D5S818 11,12 11,12
Próbkę kości Z1 dodatkowo poddano ana-
lizie polimorficznej pozycji SNP rs12913832.
FGA 23,24 23,24
Obecność w tej pozycji nukleotydowej allelu C
12 Tomasz Kupiec Nr 1
Tab. II. Wyniki badania markerów typu Y-STR dla
sława Sikorskiego prowadzono analizując ślady
pobranych fragmentów kostnych.
biologiczne (S1-S35) pobrane z przekazanych
Tab. II. Analysis results of Y-STR markers of secured
do badań elementów odzieży i przedmiotów
bone samples.
osobistego użytku generała. Do badań wyko-
rzystano markery DNA jÄ…drowego. Pozytywne
Układ polimorficzny
Z1 K1
wyniki analizy otrzymano dla 7 zabezpieczo-
Polymorphic system
nych śladów biologicznych. Uzyskane profile
DYS456 15 15
genetyczne pochodziły w czterech przypadkach
od kobiety, dalsze dwa stanowiły mieszaninę
DYS389I 13 13
materiału genetycznego pochodzącego, od
co najmniej dwóch osób. W przypadku jednej
DYS390 24 24
próbki, ujawniono profil DNA należący do męż-
czyzny. Wykonana analiza regionów HVI i HVII
DYS389II 29 29
mitochondrialnego DNA w tej próbce wykazała
DYS458 16 16
jednak, że uzyskany haplotyp jest różny od
oznaczonego w materiale porównawczym po-
DYS19 14 14
branym od Ewy Wojtasik.
DYS385 10,14 10,14
Tab. III. Wyniki analizy mitochondrialnego DNA.
Tab. III. Results of mitochondrial DNA analysis.
DYS393 12 12
Próbka Różnice odnotowane badany
DYS391 11 11
Sample w regionach HVI i HVII zakres
względem rCRS Analysed
DYS439 13 13
Differences observed in HVI region
and HVII regions according
DYS635 23 23 to rCRS
P1 16183C, 16189C, 16193.1C, 16024-16365
DYS392 13 13
16311C, 263G, 315.1C 73-340
Y GATA H4 13 13
Z1, K1 16183C, 16189C, 16193.1C, 16024-16365
16311C, 263G, 315.1C 73-340
DYS437 15 15
DYS438 12 12
Na odzieży zabezpieczonej w czasie sekcji
zwłok pochowanych jako generał Władysław
DYS448 19 19
Sikorski zabezpieczono i poddano analizie
mitochondrialnego DNA pięć włosów ludzkich.
Ze względu na dostępność materiału porów- We wszystkich oznaczono taki sam haplotyp
nawczego pochodzącego od krewnej generała mitochondrialnego DNA zgodny z haplotypem
Władysława Sikorskiego w linii matczynej, stwierdzonym w próbkach materiału kostnego
w badanym przypadku celowa była analiza poli- i charakterystycznym dla krewnej generała (ta-
morficznych sekwencji regionów HVI i HVII mito- bela III).
chondrialnego DNA. badania wykazały obecność
takiego samego profilu mtDNA w obu badanych WNIOSKI
próbkach materiału kostnego oraz w próbce ma-
teriału porównawczego pochodzącej od krewnej Jednym z zasadniczych celów ekshuma-
generała. Odnotowane różnice w otrzymanych cji i kompleksowych badań domniemanych
sekwencjach DNA względem sekwencji referen- szczątków generała Władysława Sikorskiego,
cyjnej rCRS przedstawiono w tabeli III. zleconych przez Oddziałową Komisję ścigania
Analiza pozycji SNP rs12913832 zlokalizowa- Zbrodni przeciwko Narodowi Polskiemu w Ka-
nej w genie HERC2, przeprowadzona dla jednej towicach, była identyfikacja zwłok. Ze względu
z próbek kości, wykazała obecność homozygo- na daleko posunięty rozkład ciała, proces jego
tycznego genotypu C/C, który występuje głów- identyfikacji oparto na porównawczej analizie
nie u osób o niebieskim kolorze oczu. materiału genetycznego.
Poszukiwania materiału porównawczego po- Przeprowadzone badania genetyczne pobra-
chodzącego bezpośrednio od generała Włady- nych ze zwłok fragmentów kostnych (Z1, T1),
Nr 1 bADANIA GENETYCZNE 13
pomimo daleko posuniętego rozkładu tkanek przypadku może zostać uznane za silny dowód
miękkich, umożliwiły uzyskanie pełnego zestawu na to, że badane szczątki należały do generała
wyników badanych markerów autosomalnych Władysława Sikorskiego.
typu STR, markerów typu STR chromosomu Y, Wykonana dodatkowo analiza polimorfizmu
a także analizowanych fragmentów HVI i HVII genu HERC2 odpowiedzialnego za dziedzi-
mitochondrialnego DNA. czenie niebieskiego i brÄ…zowego koloru oczu
Poszukiwania materiału porównawczego pozwoliła oznaczyć w nim genotyp C/C. Taki
pochodzącego bezpośrednio od Władysława wynik wskazuje, że mężczyzna, którego szczątki
Sikorskiego na przedmiotach i odzieży udostęp- analizowano z 80% prawdopodobieństwem po-
nionych przez krewną generała oraz Muzeum siadał niebieski kolor oczu. Warto wspomnieć,
Wojska Polskiego w Warszawie, nie pozwoliły że uzyskany wynik jest zgodny z relacjami kole-
na odnalezienie próbek DNA, które mogłyby być gów generała z czasów szkolnych. Potwierdzili
użyteczne w procesie identyfikacyjnym. Uzyska- oni, że miał on  bławatny kolor oczu dodając,
ne z zabezpieczonych śladów profile genetycz- że miał również jasne włosy.
ne markerów autosomalnych typu STR pocho- Częstym problemem identyfikacyjnych ba-
dziły od kobiet lub stanowiły mieszaninę DNA, dań genetycznych szczątków ludzkich jest brak
co wykluczało ich użyteczność w charakterze optymalnego materiału porównawczego. W opi-
materiału porównawczego. Wiarygodność po- sanym przypadku, mimo uzyskania kompletu
jedynczego śladu biologicznego pochodzącego danych dla wszystkich podstawowych markerów
od mężczyzny podważono po uzyskaniu wyniku stosowanych współcześnie do identyfikacji ge-
analizy mitochondrialnego DNA. W związku netycznej człowieka, użyteczne okazały się wy-
z tym, że posiadał on profil mitochondrialnego łącznie dane na temat mitochondrialnego DNA.
DNA różny od ujawnionego w materiale po- Ze względu na charakter dziedziczenia analiza
równawczym pobranym od krewnej generała, mtDNA posiada ograniczoną siłę różnicującą,
próbka ta nie mogła pochodzić od generała. co sprawia, że uzyskana wartość dowodowa
Ze względu na brak wiarygodnego materiału jest nieporównywalnie mniejsza niż w przypadku
biologicznego pochodzącego bezpośrednio zastosowania markerów autosomalnych typu
od Władysława Sikorskiego, badania identyfi- STR. Wydaje się jednak, że uzyskany w toku
kacyjne szczątków prowadzono wykorzystując badań stopień pewności i okoliczności sprawy
wyłącznie materiał porównawczy pobrany od nie dają żadnych podstaw do podważania twier-
biologicznej krewnej generała w linii matczynej. dzenia, że badane szczątki należały do generała
Uzyskana zgodność profili mtDNA w próbkach Władysława Sikorskiego.
materiału kostnego i włosów pobranych w trak-
cie ekshumacji domniemanych zwłok generała
Sikorskiego z profilem mtDNA Ewy Wojtasik
przekonuje, że badane szczątki mogą pochodzić
od generała Władysława Sikorskiego. W przy- PIśMIENNICTWO
padku analizy mtDNA przyjętym sposobem
oszacowania wartości dowodowej stwierdzonej 1. Wilson M. R., DiZinno J. A., Polanskey D.,
zgodności profili genetycznych jest analiza czę- Replogle J., budowle b.: Validation of mitochon-
stości występowania haplotypu w bazie danych. drial DNA sequencing for forensic casework ana-
Przeprowadzona analiza kryminalistycznej bazy lysis. Int J Legal Med. 1995, vol. 108, 68-74.
EMPOP (www.empop.org) wykazała, że haplotyp 2. Eiberg H., Troelsen J., Nielsen M., Mikkel-
mtDNA charakterystyczny dla badanych szczÄ…t- sen A., Mengel-From J., Kjaer K. W., Hansen
ków oraz krewnej generała nie pojawił się wśród L.: blue eye color in humans may be caused
3831 osób zamieszkujących obszar euroazjaty- by a perfectly associated founder mutation in
cki [5]. Na tej podstawie można dalej obliczyć a regulatory element located within the HERC2
maksymalną częstość haplotypu w populacji [6], gene inhibiting OCA2 expression. Hum Genet.
która w tym przypadku wynosi 0,00077. Oznacza 2008, vol. 123(2), 177-87.
to, że oznaczony profil mtDNA może pojawić się 3. Sturm R. A., Duffy D. L., Zhao Z. Z., Leite
u 1 na 1294 niespokrewnionych osób. Obliczone F. P., Stark M. S., Hayward N. K., Martin N. G.,
na podstawie uzyskanych badań genetycznych Montgomery G. W.: A single SNP in an evolu-
prawdopodobieństwo pokrewieństwa pomiędzy tionary conserved region within intron 86 of the
badanymi osobami, przy założeniu 50% prawdo- HERC2 gene determines human blue-brown eye
podobieństwa a priori, jest równe 99,92% i w tym color. Am J Hum Genet, 2008, vol. 82, 424-31.
14 Tomasz Kupiec Nr 1
4. branicki W., brudnik U., Wojas-Pelc: forensic casework. Forensic Sci Rev, 1999, vol.
A Interactions between HERC2, OCA2 and MC1R 11, 21-50.
may influence human pigmentation phenotype.
Ann Hum Genet, 2009, vol. 73(2), 160-70.
5. Parson W., Dur A.: EMPOP  a forensic Adres do korespondencji:
mtDNA database. Forensic Sci Int: Genet, 2007, dr Tomasz Kupiec
vol. 1, 88-92. Instytut Ekspertyz SÄ…dowych
6. Holland M. M., Parsons T. J.: Mitochondrial 31-033 Kraków, ul. Westerplatte 9
DNA sequence analysis  validation and use for [e-mail]