KWASY NUKLEINOWE
1. Hydroliza, wykrywanie składników kwasów nukleinowych
Zasada:
Po hydrolizie kwasów nukleinowych można wykrywać poszczególne ich składniki jak pentozę,
kwas fosforowy i zasady azotowe.
Wykonanie:
Hydroliza kwasów nukleinowych: Do 5 cm3 0,5 % roztworu RNA z drożdży dodać 5 cm3 HCl o
stężeniu 1 mol×ðdm-3 i ogrzewać na wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej przez 30 minut od momentu
zagotowania.
a) Wykrywanie pentozy:
Do probówki nalać 2 cm3 odczynnika Biala i ogrzewać na łaz
ni wodnej przez ok. 3 min, a następnie
dodać 1 cm3 hydrolizatu. Zamieszać i wstawić do łaz
ni wodnej. Po kilku minutach zanotować
powstajÄ…ce zielononiebieskie zabarwienie.
b) Wykrywanie jonów ortofosforanowych:
Do 1 cm3 hydrolizatu dodać 2 cm3 2,5% roztworu molibdenianu amonowego i całość ogrzać do
wrzenia. Wytwarza się żółty osad fosforomolibdenianu amonowego. Po dodaniu paru kropel 1%
roztworu kwasu askorbinowego (witamina C) następuje redukcja molibdenianu amonowego do
mieszaniny tlenków molibdenu (Mo2O5×ðMoO3), tzw. bÅ‚Ä™kitu molibdenowego.
c) Wykrywanie zasad purynowych:
2 cm3 hydrolizatu ogrzać do wrzenia, dodać kilka kropel roztworu 0,25 M CuSO4 i ostrożnie
kroplami dodawać nasycony roztwór Na2SO3. W obecności puryn wytrąca się żółtobiały osad
nierozpuszczalnych soli miedziowych I (miedziawych) puryn. (Na2SO3 zredukował Cu2+ do
Cu+).
Rys. 27. Wzory strukturalne zasad purynowych
2. Izolacja DNA z warzyw, owoców metodą uproszczoną
Wykonanie:
Pomidor (zgnieść) lub jabłko (zetrzeć na tarce) a następnie umieścić w zlewce i dodać łyżeczkę
płynu do mycia naczyń w celu emulgacji lipidów, a przez to dezintegracji błon
cytoplazmatycznych. Zlewkę wraz ze zhomogenizowanym materiałem wstawić na 15 minut do
Å‚az
ni wodnej (60°C) (uwaga!!! temperatura nie może być zbyt wysoka, bowiem DNA może
zdenaturować, z kolei nie może też być za chłodno, bo wtedy nie zdenaturuje RNA co sprawi,
że izolowany DNA może być nim zanieczyszczony). Przełożyć do łaz
ni lodowej (szybko
schłodzić) i dodać łyżkę stołową soli zmiękczającej do mięsa firmy Kamis (na tym etapie chodzi
o wytrącenie białek, które podobnie jak DNA rozpuszczają się w wodzie). Otrzymany ekstrakt
przesączyć przez lejek z sączkiem bibułowym. Wlać przesącz do naczynia (cylindra)
zawierającego 50 cm3 alkoholu 96% (może być denaturat). Zaobserwować wytrącone białe
 kłaczki DNA.
3. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości kwasów nukleinowych i badanie ich
czystości
Zasada:
Aromatyczne pierścienie purynowe i pirymidynowe absorbują światło w zakresie UV.
Właściwość tę można zastosować do pomiaru stężenia RNA w roztworze. Wprawdzie
poszczególne zasady różnią się nieco pod względem zakresem maksymalnej absorpcji UV, to
jednak różnice te są niewielkie i można przyjąć, że 260 nm jest optymalną długością fali przy
pomiarze ilościowym RNA.
Rys. 28. Wzory strukturalne pirymidyny i puryny
Spektrofotometrię w UV można wykorzystać również do ilościowych oznaczeń białek, jednak
jedynie w przypadku, jeśli oznacza się zawartość konkretnego białka względem konkretnego
wzorca (białko badane i wzorzec zawierać muszą taką samą ilość absorbujących UV
aminokwasów aromatycznych; pomiar wykonuje się przy  = 280 nm).
Wykonanie:
SporzÄ…dzanie krzywej kalibracyjnej
Do probówki wlać 3 cm3 roztworu wzorcowego (w 100 cm3 buforu octanowego o pH = 5,5
rozpuścić na gorąco 10 mg RNA z drożdży) i dolać do niego 3 cm3 buforu octanowego
uzyskując stężenie 100 źg RNA w 1 cm3. Po zmieszaniu powtórzyć rozcieńczanie tą samą
metodą pobierając do nowej probówki 3 cm3 roztworu z poprzedniej probówki i uzupełnić 3 cm3
buforu octanowego, uzyskując kolejne stężenia RNA: 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.5, przy  = 260
nm każdego roztworu RNA.
Pomiar stężenia RNA w nieznanym roztworze
Wykonać pomiar spektrofotometryczny absorpcji przy  = 260 dla roztworu RNA o nieznanym
stężeniu.
Sprawozdanie
a) Za pomocą arkusza kalkulacyjnego MS Excel wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć
równanie regresji liniowej zależności absorbancji od stężenia RNA (wzorca).
b) Obliczyć stężenie RNA nieznanych roztworów za pomocą równania regresji liniowej
otrzymanego w podpunkcie a).
4. Jakościowa analiza kwasów nukleinowych - reakcja PCR
Zasada:
Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) służy powieleniu in vitro
fragmentu DNA. Technika została wynaleziona w roku 1983 przez amerykańskiego biochemika
Kary ego Mullisa, za co w 1993 roku otrzymał nagrodę Nobla. Namnażanie fragmentu DNA
sterowane jest zmianami temperatury i zachodzi w urzÄ…dzeniu zwanym termocyklerem.
Termocykler zawiera blok grzejny z otworami na probówki, w których zachodzić może reakcja.
Powielenie (amplifikacja) zachodzi na drodze enzymatycznej katalizowanej przez termostabilnÄ…
polimerazę DNA (otrzymaną z bakterii Thermus aquaticus, które żyją w gorących z
ródłach w
temperaturze czÄ™sto przekraczajÄ…cej 100°C). Enzym do rozpoczÄ™cia syntezy komplementarnej
nici DNA potrzebuje fragmentów dwuniciowych, dlatego reakcja polimeryzacji wymaga użycia
tzw. starterów. Startery to syntetyczne oligonukleotydy przyłączające się na obu końcach
amplifikowanego regionu. Termostabilna polimeraza z wykorzystaniem trifosforanów
deoksyrybonukleotydów (dNTP) katalizuje syntezę nowej komplementarnej nici dobudowując
do końca 3 startera kolejne nukleotydy. Optymalne dla enzymu pH oraz siłę jonową roztworu
zapewnia odpowiedni bufor. Poza tym do reakcji dodaje siÄ™ jony magnezu stanowiÄ…ce kofaktor
dla enzymu. Reakcja PCR jest powtarzającą się 30-40 razy sekwencją następujących etapów
(Ryc. 29):
1. Termiczna denaturacja matrycy zachodzi w temperaturze powyżej 90°C. W podwójnej
nici DNA pary zasad połączone wiązaniami wodorowymi ulegają rozdzieleniu.
Denaturacja matrycy jest możliwa bez dezaktywacji enzymu, ponieważ stosowane w
PCR polimerazy sÄ… termostabilne.
2. Hybrydyzacja starterów (ang. annealing) do matrycowego DNA oraz do nowych nici.
Etap ten zachodzi w temperaturze ok. 40-60°C, zależnie od dÅ‚ugoÅ›ci i sekwencji
starterów.
3. Elongacja czyli wydłużanie startera katalizowane przez polimerazę (dobudowywanie
nici komplementarnej w kierunku 5 3 z wykorzystaniem trifosforanów
deoksyrybonukleotydów). Etap ten zachodzi najczęściej w temperaturze 72°C. Startery
będące oligonukleotydami o długości około 20-30 nukleotydów definiują zatem końce
amplifikowanej sekwencji.
4. Ryc. 29. Przebieg reakcji PCR.
.
Zakładając 100-procentową wydajność reakcji, po każdym cyklu PCR ilość produktu podwaja
się. Zatem po 20 cyklach reakcja PCR generuje produkt w ilości około miliona kopii sekwencji
docelowej (220). Po powieleniu sekwencji konieczna jest jej wizualizacja. W pierwszej
kolejności przeprowadza się tzw. elektroforezę w żelu (agarozowym lub poliakrylamidowym).
Jest to rozdział naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym przeprowadzony w takich
warunkach, że na tempo migracji wpływa wyłącznie długość cząsteczki. DNA w postaci
prążków wizualizuje się po wyznakowaniu bromkiem etydyny, który interkaluje (wchodzi w
kompleks z dwoma nićmi DNA) między pary zasad DNA i po wzbudzeniu światłem UV
fluoryzuje.
PCR opisany w powyżej formie nie pozwala na ilościową detekcję DNA. Pozwala jedynie na
stwierdzenie obecności amplifikowanej sekwencji, a także z zastosowaniem markera wielkości
na ustalenie długości powielonego fragmentu.
W praktyce stosuje się wiele modyfikacji reakcji PCR, a wśród nich RT-PCR (ang. reverse
transcription PCR) oraz PCR w czasie rzeczywistym (ang. real time PCR).
W reakcji RT-PCR jako matrycÄ™ wykorzystuje siÄ™ czÄ…steczki matrycowego RNA. Pierwszy
etap katalizowany jest przez odwrotną transkryptazę (polimerazę DNA zależną od RNA), która
syntetyzuje komplementarne cDNA na matrycy RNA. Utworzone cDNA jest następnie
amplifikowane w reakcji PCR. Za pomocą reakcji RT-PCR można zatem powielać transkrypty
(mRNA) różnych genów.
PCR w czasie rzeczywistym umożliwia ilościowy pomiar kwasów nukleinowych. Do
mieszaniny reakcyjnej dodaje się związki, które emitują fluorescencję o natężeniu
proporcjonalnym do powstałego produktu PCR. Mogą być nimi związki wiążące się z każdym
dwuniciowym DNA (np. SYBR Green) lub też syntetyczne oligonukleotydy (sondy) specyficzne
do analizowanej sekwencji (Ryc.). Jako że detekcję ilości produktu przeprowadza się poprzez
pomiar fluorescencji, etap elektroforezy zostaje wyeliminowany.
Ryc. 30. Chemizm detekcji fluorescencji barwnika SYBR Green w reakcji PCR.
Ryc. 31. Chemizm detekcji fluorescencji barwnika reporterowego sondy w reakcji PCR .
Zastosowanie fluoroforów wymaga specjalnie przystosowanego termocyklera, którego
sprzężenie z fluorymetrem umożliwia detekcję sygnału fluorescencji. W celu wyznaczenia
początkowej ilości kopii matrycy wyznacza się wartość parametru CT (ang. threshold cycle). CT
jest to numer cyklu PCR, w którym intensywność fluorescencji przekracza zdefiniowany próg
(ang. threshold) (Ryc. ). Im więcej kopii matrycy znajduje się w mieszaninie reakcyjnej na
początku reakcji, tym mniejsza liczba cykli PCR jest wymagana do osiągnięcia granicznej
fluorescencji.
Ryc. 32. Wyznaczenie wartości CT (ang. threshold cycle)
Zaletą reakcji PCR jest jej wysoka czułość i specyficzność, a także stosunkowo prosta
zasada działania. Reakcja ta znalazła zastosowanie nie tylko w badaniach podstawowych, ale
także w praktyce. Przykładowo PCR wykorzystuje się w celu detekcji mutacji, patogenów,
klasyfikacji organizmów, identyfikacji organizmów genetycznie zmodyfikowanych,
sekwencjonowaniu, diagnostyce prenatalnej, ustalaniu ojcostwa, czy w pomiarach ekspresji
genów.
1. Detekcja bakterii Escherichia coli w glebie z wykorzystaniem reakcji PCR
Izolacja całkowitego genomowego DNA z ziemi
Zestaw Genomic Mini AX SOIL (SPIN) (A&A Biotechnology) pozwala na izolacjÄ™
genomowego DNA z próbki gleby. Kolumienki z membraną jonowymienną umożliwiają
izolacjÄ™ do 15 µg DNA z próbki gleby o masie 500 mg. Do elucji stosuje siÄ™ bufor o niskiej sile
jonowej i wysokim pH.
Odczynniki i materiały:
-Genomic Mini AX SOIL (SPIN)
-0,9% roztwór NaCl
-sterylne końcówki do pipet, probówki typu  Falcon
Przygotowanie materiału (izolacja komórek z próbek ziemi)
1. 0,5 grama próbki ziemi umieścić w 15 ml probówce typu  Falcon
2. Do objętości 2,5 ml dodać 0,9% roztworu NaCl.
3. Próbkę zamieszać na worteksie, następnie przez 5 minut inkubować na lodzie.
4. Do drugiej 15 ml probówki wlać 0,5 ml roztworu separacyjnego R, przez 5 minut
inkubować na lodzie.
5. Znajdującą się w pierwszej probówce zawiesinę ziemi pobrać ostrożnie pipetą znad osadu
piasku i nawarstwić na powierzchnię roztworu separacyjnego R znajdującego się w
drugiej probówce (Warstwa zawiesiny ziemi nie może być wymieszana z warstwą
roztworu separacyjnego R!)
6. Całość zwirować (10 minut, 7000 obrotów/minutę).
7. Supernatant przenieść do nowej 15 ml probówki i próbkę uzupełnić 0,9% roztworem
NaCl do objętości 10 ml. Całość wymieszać odwracając.
8. Próbkę zwirować (10 minut, 7000 obrotów/minutę)
9. Delikatnie zlać supernatant, osad zawiesić w 100 źl buforu do zawieszania bakterii (bufor
BS).
Izolacja DNA
1. Do próbek dodać 10 źl lizozymu, całość wymieszać, próbkę inkubować w termobloku
(15 minut, 37°C).
2. Do każdej z próbek po inkubacji dodać 300 źl buforu lizującego LSU oraz 20 źl
proteinazy K. CaÅ‚ość wymieszać i inkubować w termobloku (10 minut, 50°C). Co kilka
minut próbkę wstrząsnąć (używając worteksu).
3. Po inkubacji próbkę wstrząsnąć (ok. 2 minuty), następnie zwirować (10 sekund, 9500
obrotów/minutę).
4. Próbki nanieść na kolumienkę Mini AX Spin umieszczoną w 2 ml probówce.
5. Kolumny włożyć do wirówki i wirować przez 30 sekund (9500 obrotów/minutę).
6. Kolumienkę umieścić w nowej 2 ml probówce. Nanieść 600 źl buforu płuczącego W1, a
następnie wirować (30 sekund, 9500 obrotów/minutę).
7. Kolumienkę umieścić w nowej 2 ml probówce. Nanieść 500 źl buforu płuczącego W2,
po czym wirować (30 sekund, 9500 obrotów/minutę).
8. Kolumienkę umieścić w nowej 1,5 ml probówce do elucji. Nanieść 150 źl buforu
elucyjnego E. Próbki poddać inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
9. Próbki zwirować (30 sekund, 9500 obrotów/minutę).
10. Kolumny usunąć. Probówki z genomowym DNA przechowywać do dalszej analizy w
lodówce.
Reakcja PCR
Technika PCR wykazuje się dużą czułością, musi być zatem wykonywana w warunkach
sterylnych, wolnych od zanieczyszczeń przypadkowym DNA. Należy używać sterylnych
probówek i końcówek do pitet, wody o odpowiedniej czystości. W czasie pracy należy nosić
ubranie ochronne i rękawiczki.
Odczynniki i materiały:
- bufor do PCR 10x
- trifosforany deoksyrybonukleotydów o stężeniu 10 mM
- startery specyficzne do analizowanej sekwencji o stężeniu 10 µM
- polimeraza DNA Taq o stężeniu 5u/µl
- MgCl2 o stężeniu 25 mM
- agaroza
- bufor TBE 5x stężony (wymieszać Tris-HCl 54 g, 0,5 M EDTA 20 ml, HBO3 27,5 g, dopełnić
wodÄ… destylowanÄ… do 500 ml)
- barwnik obciążajÄ…cy (sacharoza 40%, 0,5 M EDTA 1mM, bÅ‚ekit bromofenolowy 0,25%, ²-
merkaptoetanol 2mM)
- roztwór bromku etydyny (5 mg/ml)
- sterylne końcówki do pipet i probówki typu  ependorf
Procedura:
1. Przygotować na lodzie  master-mix dla procesu PCR według poniższego schematu:
Tabela 1. Skład mieszaniny reakcyjnej- Reakcja PCR.
Składnik mieszaniny Objętość/reakcję Stężenie w reakcji
woda 11,7 µl -
bufor do PCR 10x 2 µl 1x
dNTP 10 mM 0,5 µl 0,25 mM
starter  forward 10 µM 1 µl 0,5 µM
starter  reverse 10 µM 1 µl 0,5 µM
polimeraza DNA Taq 5u/µl 0,2 µl 0,05 u/µl
MgCl2 25 mM 1,6 µl 2 mM
matryca DNA 2 µl zależne od wydajnoÅ›ci
izolacji
Suma 20 µl -
2. Sporządzić 1% żel agarozowy. W tym celu należy odważyć 2 g agarozy i rozpuścić ją w
200 ml buforu TBE 1x poprzez podgrzanie. Dodać bromku etydyny w takiej ilości, by
jego stężenie w żelu wynosiło 0,005%.
3. Po schłodzeniu żelu należy wylać go na płytę aparatu do elektroforezy horyzontalnej.
Pozostawić do stężenia.
4. Po stężeniu żelu usunąć grzebień (zwolnić uformowane studzienki).
5. Żel zalać buforem nośnikowym TBE 1x.
6. Próbkę DNA zmieszać przez pipetowanie z barwnikiem obciążającym w stosunku 9:1.
7. Próbki nanieść na studzienki w żelu.
8. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przez około 2 godziny przy stałym natężeniu
prądu 40 mA i napięciu 50 mV.
9. Po zakończeniu rozdziału produkty amplifikacji obserwować w świetle UV
transiluminatora.
2. Pomiar ekspresji genów z wykorzystaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym
Izolacja RNA
Zestawy RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) przeznaczone są do izolacji całkowitego RNA z
komórek i tkanek roślinnych (Ryc. ). Najpierw próbki są poddawane lizie i homogenizacji w
obecności wysoce denaturującego buforu zawierającego izotiocyjanian guanidyny (GITC), który
natychmiast unieruchamia rybonukleazy (RNazy, enzymy z klasy hydrolaz dzielÄ…ce czÄ…steczki
RNA na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy przez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych,
by zapobiec degradacji RNA. Następnie, wchodzące w skład zestawu bufory pozwalają na
zwiÄ…zanie z membranÄ… aż do 100 µg RNA dÅ‚uższego niż 200 pz (par zasad), które jest
wypłukiwane wolną od rynonukleaz wodą. Otrzymujemy całkowite RNA wzbogacone w
matrycowe RNA, ponieważ RNA krótsze od 200 nukleotydów, takie jak 5.8 S rRNA, 5S rRNA i
tRNA, które razem obejmują 15-20% całkowitego RNA, nie przyłączają się do membrany.
Odczynniki i materiały:
- RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)
- 14,3 M ²-merkaptoetanol (²-ME)
- etanol 96-100%
- sterylne, wolne od rybonukleaz końcówki do pipet i probówki typu  ependorf
UWAGI WST
PNE
1. Tkankę roślinną zaraz po pobraniu należy umieścić w ciekłym azocie, by zapobiec
zmianom w ekspresji genów spowodowanymi degradacją RNA oraz indukcją
transkrypcji po pobraniu próbek.
2. Procedurę, łącznie z wirowaniem, należy wykonywać w temperaturze pokojowej, w
miarę możliwości SZYBKO.
Ryc. 33. Schemat procedury izolacji RNA z użyciem zestawu RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
Procedura:
1. Dokonać wstępnej homogenizacji tkanki w homogenizatorze TissueLyserII (Qiagen). W
tym celu należy do każdej probówki z tkanką roślinną dodać wysterylizowane etanolem
kulki z węgliku wolframu, następnie probówki z tkanką umieścić w schłodzonych w
ciekłym azocie blokach do homogenizacji i uruchomić homogenizator (30 Hz, 2 minuty).
2. Do 2 ml probówki zawierającej około 50 mg zmiażdżonej tkanki (NIE DOPUŚCIĆ DO
ROZMROÅ»ENIA!) dodać 450 µl buforu RLT (z ²-merkaptoetanolem) i zamieszać na
worteksie.
3. Przeprowadzić inkubacjÄ™ próbek w termobloku (56°, 2 minuty).
4. Lizat przenieść na kolumnę QIAshredder (fioletowa) umieszczoną w 2 ml probówce
zbiorczej. Zwirować (2 min, przy maksymalnych obrotach).
Delikatnie przenieść supernatant z probówki zbiorczej do nowej probówki wirówkowej
(nie wstrzÄ…sajÄ…c osadu!!).
5. Dodać etanol (poÅ‚owÄ™ objÄ™toÅ›ci supernatantu, tj. okoÅ‚o 220 µl) do oczyszczonego lizatu.
Całość zamieszać.
6. PróbkÄ™ (okoÅ‚o 650 µl) naÅ‚ożyć na kolumnÄ™ RNeasy (różowa) umieszczonÄ… w 2 ml
probówce zbiorczej. Zamknąć probówkę, wirować (15 sekund, e"10000 obrotów/minutę).
Wylać przesącz (nie wyrzucać probówki zbiorczej).
7. Dodać 700 µl buforu RW1 na kolumnÄ™. Zamknąć probówkÄ™. Wirować (15 sekund,
10000 obrotów/minutę). Wylać przesącz (nie wyrzucać probówki zbiorczej).
8. Na kolumnÄ™ naÅ‚ożyć 500 µl buforu RPE. Zamknąć probówkÄ™, wirować (15 sekund,
e"10000 obrotów/minutę) w celu przepłukania kolumny. Wylać przesącz (nie wyrzucać
probówki zbiorczej).
9. Dodać ponownie 500 µl buforu RPE na kolumnÄ™. Zamknąć delikatnie probówkÄ™,
wirować (2 minuty e"10000 obrotów/minutę).
10. Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej (starą wyrzucić). Wirować przy
maksymalnych obrotach, by wysuszyć membranę.
11. W celu wypłukania RNA należy przenieść kolumnę do nowej probówki, dodać
bezpoÅ›rednio na membranÄ™ kolumny 30 µl wody. Zamknąć probówkÄ™ delikatnie i
wirować (1minuta, 10000 obrotów/minutę).
12. Uzyskany eluat nanieść ponownie na kolumnę, powtórzyć wirownie (1minuta, 10000
obrotów/minutę).
Odwrotna transkrypcja
Zestaw QuantiTect Reverse Transcription Kit umożliwia nie tylko syntezę komplementarnego
cDNA na matrycy RNA, ale również eliminację z roztworu RNA zanieczyszczeń genomowym
DNA. Zestaw ponadto zawiera białkowy inhibitor rybonukleaz. Syntezę cDNA w oparciu o
wszystkie rejony transkryptu mRNA zapewnia mieszanina starterów:  oligo dT i losowych
starterów (ang.  random primers ). Wydajność reakcji w znacznej mierze zależy od jakości
(niezdegradowana) i ilości matrycy RNA. Optymalna ilość matrycy dla odwrotnej transkryptazy
mieÅ›ci siÄ™ w przedziale 10 pg - 1 µg RNA (enzym o wysokim powinowactwie do RNA).
Umożliwia to efektywną syntezę cDNA, nawet na matrycy o wysokiej zawartości par GC, czy
też o złożonej strukturze II-rzędowej. Na aktywność i procesywność enzymu (ile nukleotydów
wbudowuje polimeraza do nowo powstałego konstruktu w trakcie jednorazowego przyłączenia
się do matrycy) wpływają negatywnie zanieczyszczenia chemiczne (białka, sole, etanol, fenole).
Oprócz aktywności polimerazy DNA zależnej od RNA, enzym ma także aktywność RNazy H
(egzorybonukleazy), co powoduje wytrawienie nici RNA w powstałej hybrydzie RNA : DNA
(nie powoduje to jednak degradacji substratu - jednoniciowego RNA) (Ryc. 34 i 35).
Ryc. 34. Schemat reakcji odwrotnej transkrypcji
Odczynniki i materiały:
- QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)
- sterylne, wolne od rybonukleaz końcówki do pipet i probówki typu  ependorf
UWAGI WST
PNE
1. Aby zmniejszyć ryzyko degradacji RNA wszystkie kroki procedury należy wykonywać
na lodzie.
2. Należy używać wyłącznie końcówek do pipet oraz probówek o odpowiednim stopniu
czystości.
Ryc. 35. Schemat procedury odwrotnej transkrypcji sprzężonej z reakcją eliminacji genomowego
DNA z użyciem zestawu QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen).
Procedura:
1. Przygotować reakcję eliminacji genomowego DNA na lodzie według poniższego schematu
(Tab. 2):
Tabela 2. Skład mieszaniny reakcyjnej- Trawienie genomowego DNA
Składnik mieszaniny objętość/reakcję
gDNA Wipeout Buffer*, 7x 2 µl
matryca RNA 2 µl
woda wolna od RNaz 10 µl
Suma 14 µl
* bufor do eliminacji zanieczyszczeń genomowym DNA
2. Przeprowadzić inkubacjÄ™ przez 2 minuty w temperaturze 42°C.
Po inkubacji mieszaninę niezwłocznie umieścić na lodzie.
3. Przygotować  master-mix dla procesu odwrotnej transkrypcji według poniższego
schematu (Tabela 3):
Tabela 3. Skład mieszaniny reakcyjnej - Reakcja odwrotnej transkrypcji.
Składnik mieszaniny Objętość/reakcję
odwrotna transkryptaza 1 µl
Quantiscript RT Buffer, 5x 4 µl
RT primer mix 1 µl
matryca RNA 14 µl
Suma 20 µl
4. Do  master mixu dodać matrycę RNA (całość z poprzedniej reakcji). Wstrząsnąć.
5. Przeprowadzić inkubacjÄ™ przez 15 minut w temperaturze 42°C.
6. Przeprowadzić inkubacjÄ™ przez 3 minuty w temperaturze 95°C w celu inaktywacji enzymu.
7. Produkt tej reakcji może bezpośrednio służyć jako matryca w reakcji PCR, może być
również przechowywany w temperaturze -20°C.
PCR w czasie rzeczywistym
Real-Time PCR jest techniką umożliwiająca (między innymi) pomiar ekspresji genów na
poziomie transkryptu. Technika ta tym różni się od  konwencjonalnego PCR , że istnieje
możliwość monitorowania przyrostu produktu w czasie rzeczywistym, a pomiaru dokonuje się w
początkowej fazie przyrostu produktu, kiedy to kinetyka reakcji wchodzi w fazę wykładniczego
wzrostu. Umożliwia to specjalnie zaprojektowany składnik mieszaniny reakcyjnej - sonda
sprzężona z fluoroforem, która generuje fluorescencję o intensywności proporcjonalnej do ilości
powstałego produktu PCR.
Odczynniki i materiały:
- TaqMan MGB Probes
- Sequence Detection Primers
- TaqMan Universal PCR Master Mix
- sterylne, wolne od rybonukleaz końcówki do pipet, probówki typu  ependorf , płytka do
reakcji PCR, folia adhezyjna
- woda wolna od nukleaz
Procedura:
1. Przygotować  master-mix dla procesu PCR według poniższego schematu (Tab. 4):
Tabela 4. Skład mieszaniny reakcyjnej- Reakcja PCR.
Składnik mieszaniny Objętość/reakcję Stężenie w reakcji
TaqMan Universal PCR 12,5 µl 1x
MasterMix
starter  forward 2,5 µl 900 nM
starter  reverse 2,5 µl 900 nM
sonda 2,5 µl 250 nM
woda 2,5 µl -
cDNA 2,5 µl zależnie od wydajnoÅ›ci
poprzednich etapów
Suma 25 µl -
2. Płytkę umieścić na lodzie.
3. Przygotować dokument RQ Plate w programie 7500 System Software wersja 1.3.
4. Sprecyzować warunki reakcji (profil termiczny, objętość reakcji) i po włożeniu płytki
reakcję uruchomić.
5. Analiza wyników w dokumencie RQ Study (odcięcie tła, wyznaczenie wartości CT).
Sporządzenie krzywych kalibracyjnych dla każdego genu. Wyznaczenie względnych
wartości ekspresji metodą ""CT oraz z krzywych standardowych. Interpretacja wyników.
ENZYMY
1. Oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy (fosfomonoesterazy)
Zasada:
Fosfatazy są enzymami hydrolizującymi estry fosforanowe różnych metabolitów. Specyficzność
fosfataz jest bardzo zróżnicowana. Jednym ze standardowych substratów dla pomiaru
aktywności fosfatazy jest p-nitrofenylofosforan (PNP): O2N-C6H4-O-PO3H2. Związek ten jest
hydrolizowany przez fosfatazę, która uwalnia z niego cząsteczkę kwasu fosforowego
pozostawiając p-nitrofenol, związek o intensywnie żółtym zabarwieniu, uwidaczniający się
zwłaszcza w alkalicznym środowisku (Rys. 36). Umożliwia to spektrofotometryczny pomiar
iloÅ›ci uwolnionego p-nitrofenolu przy lð = 400 nm. Przebieg analizy jest nastÄ™pujÄ…cy: w pro-
bówce miesza się enzym i PNP jako substrat w odpowiednim buforze, a następnie przetrzymuje
się mieszaninę przez określony czas w stałej temperaturze, po czym zatrzymuje się reakcję pop-
rzez nagłą alkalizację mieszaniny inkubacyjnej i wykonuje pomiar spektrofotometryczny.
Wynik aktywności enzymu, tj. masa przetworzonego substratu zależy między innymi od stężenia
substratu, ilości enzymu oraz czasu reakcji. Przedłużenie czasu reakcji prowadzi do zużycia
substratu, w wyniku czego szybkość reakcji maleje asymptotycznie do zera (zbliża się do tej
wartości, ale nigdy jej nie osiąga). Zwiększenie stężenia substratu przy zachowaniu stałości
pozostałych parametrów prowadzi początkowo do wzrostu szybkości reakcji aż do uzyskania
maksymalnej prędkości, przy której wszystkie cząsteczki enzymu są maksymalnie aktywne i
dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przyspiesza reakcji. Osiągnięta została tzw.
maksymalna aktywność enzymu.
Rys. 36. Schemat reakcji katalizowanej przez fosfatazÄ™
Wykonanie:
a) Otrzymywanie ekstraktów z ziemniaka
Sporządzenie ekstraktu w buforze: Zetrzeć na tarce 10 g ziemniaka, dodać ok. 15 cm3 0,1 M
buforu octanowego o pH = 5,5, wycisnąć sok przez warstwę płótna, po czym odwirować przez
15 min przy ok. 10.000 obr/min.
Sporządzenie ekstraktu wodnego: przygotować jak wyżej, ale zamiast buforu octanowego użyć
wody.
b) Dobranie czasu inkubacji
Do trzech probówek wlać po 0,1 cm3 ekstraktu enzymatycznego w buforze, dodać po 0,9 cm3 0,1
M buforu octanowego o pH = 5,5 i po 1 cm3 0,4% roztworu PNP w tym samym buforze,
zamieszać, odstawić na czas inkubacji reakcji enzymatycznej (odpowiednio: 3, 6 lub 9 min w
temperaturze pokojowej), po czym zastopować reakcję 1 cm3 0,3 M NaOH i zmierzyć
absorbancję przy  = 400 nm. Wynik wyrazić jako liczbę optycznych jednostek aktywności
enzymu (rozcieńczenie razy absorbancja). Za optymalny uznać należy czas inkubacji, po którym
absorbancja osiągnie wartość pomiędzy 1 a 1,5. Jeśli żaden z czasów inkubacji nie okaże się
odpowiedni, należy dokonać interpolacji liniowej.
Jednostką optyczną nazywamy taką ilość danej substancji, która rozpuszczona w 1 cm3 roztworu
wykazuje absorbancję równą 1,0 na drodze optycznej 1 cm (w naczynku pomiarowym o grubości
1cm).
Dodajemy 0,1 cm3 ekstraktu, 0,9 cm3 buforu, 1 cm3 PNP oraz 1 cm3 NaOH, razem otrzymujemy
3 cm3. Absorbancja roztworu była mierzona w kuwetce spektrofotometrycznej o grubości 1 cm,
zatem liczbę jednostek optycznych uzyskujemy mnożąc uzyskaną absorbancję przez 3.
c) Wyznaczenie zależności aktywności kwaśnej fosfatazy od stężenia substratu
Zastosować uzyskany w poprzednim doświadczeniu ekstrakt z ziemniaka w buforze octanowym.
Do probówki pobrać 4 cm3 roztworu substratu (PNP) o stężeniu 4% w buforze octanowym. Z tej
probówki pobrać do kolejnej 2 cm3 roztworu substratu (PNP) a następnie dodać 2 cm3 samego
buforu octanowego (pH 5,5) uzyskując tym samym stężenie 2% PNP. Uzyskany roztwór
zamieszać i pobrać z niego 2 cm3 do kolejnej probówki, do której ponownie dodajemy 2 cm3
samego buforu octanowego (pH 5,5). Tym razem uzyskaliśmy stężenie 1% PNP. Procedurę
powtórzyć jeszcze 7-krotnie, uzyskując w efekcie końcowym 10 probówek zawierających po 2
cm3 PNP o dalszych stężeniach: 0,5; 0,25; 0,125; 0,064; 0,032; 0,016 i 0,008% (w ostatniej
probówce będą 4 cm3 roztworu). Następnie do nowych 10 probówek pobrać po 1 cm3
przygotowanych roztworów PNP oraz po 0,9 cm3 buforu octanowego o pH 5,5. Reakcję
enzymatyczną rozpocząć przez dodanie do każdej probówki po 0,1 cm3 ekstraktu z ziemniaka w
buforze octanowym. Inkubację reakcji przeprowadzić w czasie dobranym w podpunkcie b) i w
tej samej temperaturze.
d) Określanie zależności aktywności kwaśnej fosfatazy od pH
W 11 probówkach przygotować mieszaniny 0,4 M kwasu octowego i 0,4 M octanu sodu w
proporcjach podanych w tabeli. Bufor (np. octanowy) składa się ze składnika kwaśnego (kwas
octowy) i alkalicznego (octan sodu). Zmieszanie tych składników w różnych proporcjach poz-
wala uzyskać różne wartości pH buforu, w którym jest mierzona aktywność enzymu. Zmierzyć
wartości pH każdego z buforów.
Nr probówki
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
octan sodu [cm3] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kwas octowy 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
[cm3]
pH buforu
Do nowych 11 probówek pobrać po 0,9 cm3 poszczególnych buforów oraz po 1 cm3 0,4%
wodnego roztworu PNP. Reakcję enzymatyczną rozpocząć przez dodanie po 0,1 cm3 wodnego
ekstraktu z ziemniaka. Następnie przeprowadzić inkubację w czasie i temperaturze jak w
poprzednim doświadczeniu. Reakcję zastopować przez dodanie po 1 cm3 0,3 M NaOH.
Sprawozdanie
a) Na podstawie otrzymanych wyników wykreślić funkcję zależności aktywności enzymu od
stężenia substratu. Wykres zinterpretować.
b) Na podstawie otrzymanych wyników wykreślić wykres zależności aktywności enzymu od pH.
Wykres zinterpretować.
2. Wykazanie aktywności oksydaz w ziemniaku
Zasada:
W tkankach występują różne enzymy powodujące utlenianie substratów, a wśród nich oksydazy
(utleniajÄ…ce substraty przy udziale tlenu czÄ…steczkowego) i peroksydazy (wykorzystujÄ…ce
nadtlenek wodoru jako z
ródło tlenu dla utleniania substratów). Produkty utlenienia mają zwykle
ciemne zabarwienie, stąd ciemnienie przekrojonego i poddanego działaniu powietrza jabłka lub
ziemniaka. Zwilżenie powierzchni tkanki substratem dla działania enzymów utleniających (p-
fenylenodiamina), jak i rozcieńczonym, ok. 0,1% roztworem nadtlenku wodoru przyspiesza
proces ciemnienia tkanki. Oksydazy i peroksydazy są enzymami, w których istotną rolę
odgrywają jony aktywujące. Stąd też zwilżenie powierzchni ok. 1% roztworem EDTA (kwasu
etylenodiaminotetraoctowego) wiążącego w trwały kompleks różne dwuwartościowe kationy,
opóz
nia zjawisko ciemnienia powierzchni przekrojonej tkanki.
Wykonanie:
Połówkę jabłka lub ziemniaka zwilżyć roztworem p-fenylenodiaminy, inną zwilżyć roztworem
nadtlenku wodoru, jeszcze inną zwilżyć roztworem EDTA i wreszcie ostatnią pozostawić jako
kontrolną. Porównać szybkość ciemnienia poszczególnych połówek.
3. Wykazanie obecności katalazy w ziemniaku
Zasada:
Katalazy są enzymami rozkładającymi nadtlenek wodoru powstający jako produkt uboczny w
niektórych procesach metabolicznych. Ponieważ nadtlenek wodoru jest szkodliwy ze względu na
jego utleniające właściwości, przyjmuje się, że katalazy pełnią w organizmie funkcję ochronną
przed szkodliwym działaniem nadtlenku wodoru.
Wykonanie:
Do miazgi ziemniaczanej dodać kroplami wodę utlenioną. Następuje burzliwe wydzielanie się
pęcherzyków tlenu świadczących o aktywności katalazy. Wydzielanie pęcherzyków tlenu
następuje również podczas przemywania wodą utlenioną skaleczenia; oznacza to, że katalaza
występuje nie tylko w tkankach roślinnych.
4. Spektrofotometryczne oznaczanie aktywności peroksydazy niespecyficznej
Zasada:
Peroksydazy są powszechnie występującymi enzymami utleniającymi różne substraty przy
udziale nadtlenku wodoru H2O2. Nazwą peroksydaza niespecyficzna określa się całkowitą pulę
peroksydaz cytoplazmatycznych i apoplastycznych. Najczęściej substratem dla peroksydaz są
różne związki fenolowe oraz diaminy, których produkty utleniania charakteryzują się wyraz
nÄ…
barwą. Zasada tej analizy polega na zmieszaniu enzymu z substratem, a następnie powtarzaniu
pomiaru gęstości optycznej mieszaniny, co pozwala na wykreślenie zależności absorpcji od
czasu inkubacji. Liniowy odcinek krzywej służy do wyznaczenia linii regresyjnej, której
nachylenie jest miarą aktywności enzymu.
Wykonanie:
Odważyć 350 mg świeżej masy liści. Ucierać w ciekłym azocie dodając stopniowo (3 x 0,5 cm3
= 1,5 cm3) bufor ekstrakcyjny (0,05 M bufor fosforanowy pH 7,0 z 0,01 M EDTA). Następnie
ekstrakt wirować przy 14000 × g przez 10 min w temp. 4°C. Aktywność peroksydazy mierzy siÄ™
spektrofotometrycznie jako wzrost absorbancji przy długości fali 460 nm.
Pomiar aktywności
Do kuwety jednorazowej o pojemności 3 cm3 dodajemy:
2 cm3 buforu ekstrakcyjnego, 12 µl 0,5% roztworu p-fenylenodiaminy w buforze ekstrakcyjnym,
12 µl ekstraktu, a nastÄ™pnie  zerujemy spektrofotometr. Natychmiast dodajemy 12 µl
zbuforowanego H2O2 (50 cm3 buforu ekstrakcyjnego + 0,15 cm3 30% H2O2). Należy odczytać
początkową wartość absorbancji oraz po upływie 1 minuty. Aktywność enzymu wyrażamy w
różny sposób. Można np. podawać ilości (mg, źg, źmole, nmole) rozłożonego substratu lub
powstającego produktu w reakcji w przeliczeniu na świeżą lub suchą masę, bądz
też na mg
białka w jednostce czasu. W tym przypadku aktywność peroksydazy niespecyficznej podajemy
jako "ABS/g świeżej masy/minutę.
6. Oznaczanie aktywności katalazy w ekstrakcie z roślin (EC: 1.11.1.6.)
Zasada:
Katalazy są enzymami rozkładającymi nadtlenek wodoru powstający jako produkt uboczny w
niektórych procesach metabolicznych. Ponieważ nadtlenek wodoru jest silnym utleniaczem,
podobnie jak inne reaktywne formy tlenu, stąd też katalazy pełnią w organizmie funkcję
ochronną przed jego szkodliwym działaniem.
Wykonanie:
Odważyć 350 mg świeżej masy liści. Ucierać w ciekłym azocie stopniowo dodając bufor
ekstrakcyjny (3 x 0,5 cm3 = 1,5 cm3 0,05 M buforu fosforanowego pH 7,5 z 0,01 M EDTA).
NastÄ™pnie ekstrakt wirować przy 14000 × g przez 10 min w temp. 4°C.
Pomiar aktywności: do kuwety spektrofotometrycznej (kwarcowej!) dodajemy kolejno: 2 cm3
zbuforowanego H2O2 (50 mM buforu fosforanowego o pH 7,5 + 0.3 cm3 30% H2O2), a następnie
bardzo szybko mieszajÄ…c 200 µL ekstraktu. Odczytujemy tzw. slope (kÄ…t nachylenia krzywej) i
notujemy jego wartość. Aktywność katalazy mierzy się spektrofotometrycznie jako spadek
absorbancji przy długości fali 240 nm. Spadek absorbancji o 0,0145 odpowiada rozkładowi
1µmola H2O2. Aktywność katalazy wyrażamy w µmolach H2O2 " mg-1 biaÅ‚ka " min-1.