ENZYMOLOGIA Biotransformacja enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biotransformacja enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery Wstęp Enzymy jako odczynniki chemiczne są szczególnie przydatne w syntezach połączeń o zdefiniowanej budowie przestrzennej, w procesach rozdziału racematów czy syntezie peptydów. Biotransformacje aminokwasów rozdział racematów Selektywne otrzymywanie czystych optycznie form (enancjomerów) aminokwasów możliwe jest w wyniku enzymatycznej ich syntezy z prochiralnych substratów lub enzymatycznego rozdzielenia racemicznych mieszanin ich pochodnych. Do rozdziału racemicznych mieszanin najczęściej stosuje się katalizowane przez esterazy reakcje hydrolizy estrów aminokwasów, selektywną hydrolizę N-acylowanych pochodnych aminokwasów za pomocą acylaz lub katalizowane przez amidazy reakcje hydrolizy amidów aminokwasów (Rys. 1). Rys. 1 Rozdział racemicznych mieszanin pochodnych aminokwasów za pomocą enzymów hydrolitycznych. Wszystkie wymienione enzymy są ściśle stereospecyficzne i katalizują reakcje hydrolizy substratów o konfiguracji L, podczas gdy izomer D substratu nie ulega reakcji. 1 ENZYMOLOGIA Biotransformacja enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery Zastosowanie enzymów do rozdziału racemicznych mieszanin aminokwasów jest znane od roku 1906, kiedy to Warburg uzyskał z 85% wydajnością L-leucynę z mieszaniny racemicznej jej estru propylowego poddanej działaniu ekstraktu z trzustki tak zwanej pankreatyny. Reakcja ta stanowi pierwszy przykład biotransformacji (Rys. 2). Rys. 2 Rozdział racemicznej mieszaniny estru propylowego leucyny za pomocą pankreatyny Enzymatyczna synteza wiązania peptydowego W warunkach fizjologicznych enzymy proteolityczne katalizują hydrolizę wiązania peptydowego, ale zdolne są również katalizować reakcję odwrotną, to jest reakcję syntezy tego wiązania. Synteza zachodzi wówczas stereoselektywnie i nie jest wymagane blokowanie funkcyjnych grup bocznych aminokwasów. W enzymatycznej syntezie peptydów stosuje się proteinazy (endopeptydazy), egzopeptydazy, które katalizują sekwencyjną hydrolizę końcowych reszt aminokwasowych nie są tu używane (wyjątek karboksypeptydaza Y) (Rys. 3). Rys. 3 Enzymy wykorzystywane w reakcjach syntezy peptydów 2 ENZYMOLOGIA Biotransformacja enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery Enzymatycznej syntezy wiązania peptydowego można dokonać na dwa sposoby: w procesie kontrolowanym równowagą reakcji i w procesie kontrolowanym kinetycznie. Ponieważ synteza wiązania peptydowego zachodzi jako reakcja odwrotna do reakcji hydrolizy, należy dążyć do przesunięcia równowagi tej reakcji. Do kontroli równowagi reakcji stosuje się natychmiastowe usuwanie produktu ze środowiska, w którym zachodzi proces katalizy enzymatycznej, bądz przez zastosowanie układu dwufazowego (ekstrakcja produktu do fazy organicznej), bądz też precypitację powstałego produktu. W przypadku procesu kontrolowanego kinetycznie czynnikiem decydującym o przebiegu reakcji jest szybkość tworzenia jej produktów. Zastosowanie lipaz w syntezie organicznej Lipazy mogą katalizować konwersję wielu substratów i to zarówno w wodnym, jak i apolarnym środowisku. W środowisku organicznym enzymy te katalizują reakcje przeniesienia grup arylowych z odpowiednich donorów na akceptory inne niż woda. W zależności od typu donora i akceptora są to reakcje, estryfikacji, transestryfikacji, aminowania, syntezy peptydów czy też reakcje tworzenia monocyklicznych laktonów. Przykładem enancjoselektywnej estryfikacji racemicznych kwasów jest estryfikacja kwasu 2- bromoheksanowego n-butanolem, katalizowana przez lipazę z Candida cylindracea (Rys. 4). Rys. 4 Enancjoselektywna estryfikacja kwasu 2-bromoheksanowego n-butanolem, katalizowana przez lipazę z Candida cylindracea Reakcje enzymatycznego utleniania i redukcji Procesy utleniania i redukcji to jedne z najważniejszych reakcji jednostkowych w chemii organicznej. W wielu przypadkach powinny one zachodzić w jak najdelikatniejszych warunkach i dlatego próby użycia oksydoreduktaz w syntezie organicznej budzą duże zainteresowanie. Zastosowanie znalazło już kilka enzymów z tej grupy m.in. oksydazy aminokwasów i dehydrogenazy alkoholowe. Oksydazy aminokwasów katalizują enancjoselektywne reakcje utleniania aminokwasów, w wyniku czego powstają ą-ketonokwasy. Służą one zatem do otrzymywania jednego z enancjomerów aminokwasu z jego mieszaniny racemicznej. Drugi enancjomer zostaje enzymatycznie utleniony, a więc jest niszczony w procesie rozdziału racematu. Dehydrogenaza alkoholowa z wątroby końskiej używana jest jako odczynnik redukujący ketony do drugorzędowych alkoholi lub jako katalizator reakcji utleniania alkoholi do ketonów. Wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest enzymatyczny rozdział racematu chlorowodorku estru metylowego D,L fenyloalaniny przy użyciu ą chymotrypsyny i izolacja L fenyloalaniny. ą Chymotrypsyna hydrolizuje wiązanie peptydowe po karboksylowej stronie aminokwasów aromatycznych. Jest ona również zdolna hydrolizować estry tych aminokwasów, zarówno naturalnych (fenyloalanina, tyrozyna czy tryptofan), jak i nienaturalnych (chloro- i 3 ENZYMOLOGIA Biotransformacja enzymatyczna separacja aminokwasów na enancjomery fluorofenyloalanina). Hydroliza jest enancjoselektywna, czyli ulega jej tylko ester o konfiguracji L. Materiały i sprzęt Chlorowodorek estru metylowego D,L fenyloalaniny ą chymotrypsyna 0.4 M LiOH etanol wyparka obrotowa polarymetr Przebieg ćwiczenia obejmuje następujące etapy: " Enzymatyczna reakcja hydrolizy chlorowodorku L fenyloalainianu metylu w roztworze racemicznej mieszaniny chlorowodorku D,L fenyloalainianu metylu za pomocą ą chymotrypsyny " Izolacja L - fenyloalaniny " Zbadanie czystości związku poprzez oznaczenie jego skręcalności właściwej 500 mg racemicznej mieszaniny chlorowodorku estru metylowego fenyloalaniny rozpuścić w 3 ml wody destylowanej i doprowadzić przy pomocy roztworu LiOH do pH 5. Do otrzymanego roztworu dodać 20 mg ą chymotrypsyny rozpuszczonej w 1ml wody. W trakcie reakcji obserwuje się szybki spadek pH, wobec czego trzeba je utrzymywać blisko wartości pH 5, dodając kroplami roztwór LiOH. Po ostatecznym ustaleniu się pH reakcję prowadzić jeszcze przez 10 - 20 min. Mieszaninę poreakcyjną zagęścić na wyparce obrotowej do momentu, aż roztwór stanie się mętny. Następnie mieszaninę schłodzić w łazni lodowej. Kryształy L fenyloalaniny odsączyć, przemyć zimnym etanolem i suszyć na powietrzu. Czystość związku zbadać oznaczając jego skręcalność właściwą. Opracowanie wyników Uzyskane wyniki porównać z danymi literaturowymi dotyczącymi skręcalności właściwej L fenyloalaniny. Na tej podstawie oszacować czystość otrzymanego związku. Metodę można zastosować w procesie przemysłowym, jednakże proces ten musi być zmodyfikowany w taki sposób, aby zapewnić jego opłacalność. Zauważ, że w reakcji prowadzonej tak jak podczas ćwiczenia jedynie 50% substratu zostaje przekształcona w produkt. Zaproponuj sposób postępowania, który umożliwia lepsze wykorzystanie substratu (WSKAZÓWKA: dodatkowy etap lub etapy). 4