INSTYTUT CHEMII I OCHRONY ŚRODOWISKA WYDZIAA MATEMATYCZNO PRZYRODNICZY AKADEMIA im. JANA DAUGOSZA CZSTOCHOWA Instrukcja do ćwiczenia: Chromatografia Cienkowarstwowa Kierunek: Biotechnologia Rok II Przedmiot: Procesy rozdzielania i oczyszczania produktów biotechnologicznych laboratorium Opracował dr Tomasz Girek Częstochowa 2008 1. Wprowadzenie Chromatografia adsorpcyjna jest najstarszą metodą chromatograficzną. Wykorzystuje różnice w adsorpcji związków chemicznie podobnych na powierzchni sproszkowanego i nasyconego rozpuszczalnikiem adsorbentu. Adsorbent nie może reagować z substancjami rozdzielanymi ani z rozpuszczalnikiem, musi być nierozpuszczalny w danym rozpuszczalniku i wykazywać odpowiednią aktywność w wiązaniu rozdzielanych substancji. Rozdział zależy od natury adsorbentu i rozpuszczalnika. Poniżej podano najczęściej używane adsorbenty i rozpuszczalniki uporządkowane według wzrastającej aktywności: Adsorbenty: sacharoza < skrobia < talk < węglan sodowy < węglan potasowy < węglan wapniowy < fosforan wapniowy < węglan magnezowy < tlenek magnezowy < tlenek wapniowy < żel krzemionkowy < krzemian magnezowy < tlenek glinowy < węgiel aktywny < ziemia Fullera. Rozpuszczalniki: eter naftowy (benzyna lekka) < czterochlorek węgla < cykloheksan < dwusiarczek węgla < eter etylowy < aceton < benzen < estry kwasów organicznych < chloroform < etanol < woda (zależnie od pH i rozpuszczonych soli) < pirydyna < kwasy organiczne. Najsilniej adsorbuje węgiel aktywny i ziemia Fullera, najsłabiej sacharoza i skrobia. Najlepiej adsorbują się związki rozpuszczone w eterze naftowym, a najsłabiej w pirydynie, wodzie i kwasach organicznych. Do elucji lepiej nadają się rozpuszczalniki polarne (etanol, woda, pirydyna) niż niepolarne, takie jak eter naftowy czy chloroform. W chromatografii adsorpcyjnej rozdział zależy od siły, z jaką dana substancja jest adsorbowana z rozpuszczalnika otaczającego fazę stałą. Warunkiem uzyskania dobrego rozdziału jest równomierne wypełnienie kolumny suchym i odpowiednio oczyszczonym adsorbentem oraz właściwe wymiary kolumny. Najczęściej stosunek średnicy rurki szklanej do jej długości wynosi 1:20. W trakcie sączenia badanego roztworu przez kolumnę substancje silniej adsorbowane przesuwają się wolniej, a słabo adsorbowane szybciej. W przypadku barwników roślinnych, na różnej wysokości kolumny powstają barwne pasma odpowiadające poszczególnym barwnikom. W celu lepszego rozdzielenia pasm kolumnę przemywa się tym samym rozpuszczalnikiem, albo innym o większej sile wymywania, wskutek czego warstwy szybciej przesuwają się ku dołowi i lepiej się rozdzielają. II. Cel i wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest chromatograficzne rozdzielenie barwników organicznych i nieorganicznych, oraz poszukiwanie najlepszego eluentu w chromatografii TLC. Ćwiczenie 1. Wykrywanie kwasu askorbinowego (witaminy C) w soku z pomarańczy lub cytryny Sprzęt: probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, kapilary, bagietki, cylinder miarowy 10ml Odczynniki: substancja wzorcowa (tabletka witaminy C rozpuszczona w wodzie), sok z cytryny lub pomarańczy, eluent: etanol i benzen w stosunku 3:1, wywoływacz chromatogramu - jod. Wykonanie: Niewielką ilość badanego soku wlać do probówki i dodać wody do połowy jej objętości. Po wymieszaniu bagietką, roztwór nanieść przy pomocy kapilarki na linię startową płytki chromatograficznej. W pewnej odległości od powstałej plamy nanieść krople substancji wzorcowej. Po wysuszeniu plam, płytkę umieścić w komorze chromatograficznej zawierającej etanol i benzen. Gdy mieszanina rozpuszczalników znajdzie sie w odległości ok. 2 cm od górnej krawędzi płytki, należy ją wyjąć z komory chromatograficznej i przenieść do drugiej komory, na dnie której umieszczono niewielką ilość jodu. Chromatogram nasycony parami jodu identyfikuje witaminę C zawartą w soku. Na podstawie otrzymanego chromatogramu, wyznaczyć współczynnik Rf (współczynnik przesunięcia) dla poszczególnych składników mieszaniny i substancji wzorcowych, korzystając z zależności: A Rf = B gdzie: A - odległość plamy substancji rozdzielonej od miejsca (środka) nałożenia na płytce. B - odległość frontu rozpuszczalnika od miejsca nałożenia próbki. Ćwiczenie 2. Poszukiwanie najlepszego eluentu dla mieszaniny amin aromatycznych Sprzęt: płytki chromatograficzne, probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, kapilary, bagietki, cylinder miarowy 10ml, lampa UV Odczynniki: o-nitroanilina, p-nitroanilina, heptan, heksan, izopropanol Wykonanie: Na płytki z żelem krzemionkowym nanieść plamki startowe orto-nitroaniliny i para- nitroaniliny w heptanie. Plamki nanosimy na żel za pomocą kapilary. Płytki należy wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać w kilku alternatywnych układach rozpuszczalników (heksan z 5%, 10%, 15%, 20%, 25% zawartością izopropanolu v/v). Płytki rozwijać do linii mety. Po rozwinięciu płytki TLC oglądać w świetle lampy UV, przy długości światła 254nm i 360 nm. " Na podstawie uzyskanych chromatogramów wyznaczyć wartości Rf analizowanych substancji, oddzielnie dla poszczególnych warunków rozdzielania. " Na podstawie wartości Rf uzyskanych z zastosowaniem różnych eluentów zaproponować optymalny skład fazy ruchomej do rozdzielania mieszaniny amin aromatycznych Ćwiczenie 3. Chromatografia cienkowarstwowa tuszów flamastrów na żelu krzemionkowym Sprzęt: płytki chromatograficzne, probówki, zlewki 100ml, szkiełka zegarkowe, płytka porcelanowa z wgłębieniami, kapilary, bagietki, cylinder miarowy 10ml, Odczynniki: octan etylu, etanol, woda, różne mazaki Wykonanie: Na płytki z żelem krzemionkowym nanieść plamki startowe mazaków o różnych kolorach, w razie problemów z naniesieniem plamek zanurzamy na moment końcówkę mazaka w niewielkiej ilości etanolu lub acetonu w zagłębieniu płytki porcelanowej. Plamki nanosimy na żel za pomocą kapilary. Płytki należy wstawić do komory chromatograficznej i rozwijać w eluencie o składzie: octan etylu, etanol, woda 5:3:2. Płytki rozwijać do linii mety. Po rozwinięciu płytki TLC oglądać w świetle dziennym oraz pod lampą UV, przy długości światła 254nm i 360 nm.