Chromatografia
gazowa (GC) i wysokosprawna
chromatografia cieczowa (HPLC)
Literatura:
1. Z. Witkiewicz: Podstawy chromatografii. WNT Warszawa, 2000. 2005
2. Z. Witkiewicz, J. Hetper: Chromatografia gazowa. WNT Warszawa, 2001,
2009.
3. W. Szczepaniak: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PWN
Warszawa, 1999, 2002
4. A. Braithwaite, F.J. Smith,: Chromatografic methods. 5th edition
Chapman&Hall 1996.
5. V. R. Meyer :  Practical High-Performance Liquid Chromatography. John
Willey& Sons, 2004.
6. D.A. Skoog, D.M. West, F.J. Holler, S.R. Crouch: Podstawy chemii
analitycznej, 2. Przekład pod red A. Hulanicki, PWN, W-wa 2006
CHROMATOGRAFIA - nowoczesna, najbardziej
rozpowszechniona metoda instrumentalna w analityce
Umożliwia w jednym procesie ;
" rozdział składników złożonej mieszaniny
" analizę jakościową i ilościową składników
Zastosowanie:
- analiza jakości towarów: kontrola żywności, preparatów
(para)farmaceutycznych, kosmetyków, materiałów,
opakowań,
- kontrola zanieczyszczenia środowiska (wody, gleby,
żywności...)
- kontrola i regulacja procesów technologicznych
1
Plan wykładu:
" Podstawy teoretyczne (dotyczą HPLC i GC)
" Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC
" Chromatografia gazowa (GC)
" Interpretacja wyników  analiza jakościowa i ilościowa
(dotyczy HPLC i GC)
Podstawy teoretyczne
GC i HPLC
" Zasada rozdziału chromatograficznego;
współczynnik podziału
" Podział i charakterystyka metod
chromatograficznych
" Podstawowe pojęcia i definicje;
- parametry retencji,
" Jakość rozdziału chromatograficznego:
teoria półek, teoria kinetyczna
2
Zasada rozdziału chromatograficznego
ż�Chromatografia jest metodą polegajacą na rozdzielaniu
składników mieszaniny na skutek różnej szybkości ich
migracji przez kolumnę chromatograficzną
" Rozdział składników mieszaniny następuje w wyniku różnego
podziału zawartych w niej składników między fazę nieruchomą
(stacjonarną) i fazę ruchomą :
- faza stacjonarna: ciało stałe lub ciecz naniesiona na nośnik (GC)
(tzw faza związana (HPLC)
- faza ruchoma: gaz lub ciecz
W wyniku rozdziału otrzymujemy czyste związki chemiczne
które można zidentyfikować i oznaczyć ilościowo.
Schemat rozdzielania chromatograficznego
Składniki w różny sposób oddziałują z fazą ruchomą i stacjonarną
- składnik A odziałuje z fazą stacjonarną słabiej niż B
Cząsteczki obu składników dzielą się między obie fazy w różnych stosunkach,
charakterystycznych dla tych składników:
Współczynniki podziału
CA(S)
KA =�
CA(r)
CB(S)
KB =�
CB(r)
KA ą� KB
3
Współczynnik podziału
Chromatograficzne rozdzielenie składników mieszaniny jest spowodowany
faktem, że poszczególne składniki mieszaniny w niejednakowym stopniu
ulegają podziałowi pomiędzy dwie fazy: stacjonarną i ruchomą; dla każdego
składnika ustala się różny stan równowagi :
Współczynnik
K= Cs / Cr
podziału
Cs  stężenie składnika w fazie stacjonarnej,
Cr  stężenie składnika w fazie ruchomej.
" Mechanizm  selektywny rozdział w wyniku różnego
oddziaływania z fazą stacjonarną (GC), odziaływania z f.s i f r (LC)
Wyższe K - dłuższe przebywanie w kolumnie (w fazie stacjonarnej) 
wolniejsza migracja  póz
niejszy wypływ z kolumny
Rozdział mieszaniny na poszczególne składniki jest wynikiem różnych
szybkości ich migracji spowodowanej różnymi wartościami K
Efekt rozdziału chromatograficznego
Chromatogram  sygnał detektora vs. czas retencji
4
Zastosowanie chromatografii
" Analityczne
" Analityczne  rozdział, analiza jakościowa
(identyfikacja) i analiza ilościowa składników
mieszaniny
" Preparatywne
" Preparatywne  wydzielenie i oczyszczenie
jednego lub więcej składników w mieszaninie
" Do badań fizykochemicznych
Podział metod chromatograficznych
" Metody chromatograficzne dzieli się ze
względu na:
 stan skupienia fazy ruchomej
 rodzaj oddziaływań na granicy faz
5
Podział ze względu na stan skupienia
fazy ruchomej
" Chromatografia gazowa (GC)
" Chromatografia cieczowa (LC)
" Chromatografia nadkrytyczna (fluidalna) (SCFC)
Techniki GC i LC
Chromatografia cieczowa
Chromatografia gazowa
(LC)
(GC)
Kolumnowa
planarna
Na kolumnach Kapilarna
Bibułowa
Kolumnowa Cienkowarstwowa
pakowanych
Klasyczna
Wysokosprawna
Ciśnieniowa Planarna
(HPLC)
6
Podział ze względu na rodzaj oddziaływań
na granicy faz
" Adsorpcyjna (gazowa lub cieczowa)  różne
powinowactwo adsorpcyjne składników mieszaniny
rozdzielanej do fazy stacjonarnej (adsorbentu)
 do rozdziału składników polarnych niejonowych (etery,
estry, mikotoksyny, witaminy rozpuszczalne w
tłuszczach).
" Podziałowa (gazowa lub cieczowa)  różna
rozpuszczalność (współczynnik podziału) składników
mieszaniny pomiędzy dwie nie mieszające się fazy:
ruchomą (gaz lub ciecz) i stacjonarną (ciecz osadzona
na nośniku  GC; tzw. fazy związane - HPLC)
Normalny układ faz (NP = normal phase)  faza stacjonarna jest
bardziej polarna niż faza ruchoma; składnik jest niepolarnym lub
HPLC
średnio polarnym związkiem organicznym
Odwrócony układ faz (RP = reversed phase)  faza stacjonarna jest
mniej polarna niż faza ruchoma; składnik jest polarnym związkiem
organicznym.
7
" Jonowymienna (cieczowa) (IEC, ang. Ion Exchange) -
wymiana jonowa między jonami mieszaniny
rozdzielanej a jonami związanymi z fazą stacjonarną
(jonity)  stosowana dla związków jonowych
(witaminy rozpuszczalne w wodzie, aminokwasy,
barwniki)
 Anionit - faza związana (jonit) ma ładunek dodatni;
składnik rozdzielany jest anionem
reakcja wymiany anionów:
(MR+ Y-) + X- (MR+ X- ) + Y-
 Kationit - faza związana (jonit) ma ładunek ujemny;
składnik rozdzielany jest kationem
" Sitowa lub żelowa (SEC, ang. Size Exclusion) 
o rozdziale decydują rozmiary cząstek. Faza stacjonarna
(wypełnienie kolumny) jest substancją porowatą (żel), na
której składniki rozdzielają się na skutek różnicy mas
cząsteczkowych.
8
Podstawowe pojęcia - parametry retencji
Wielkościami, które w określonych
warunkach rozdziału charakteryzują daną
substancję pod względem jakościowym są:
��czas retencji
��objętość retencji
Parametry retencji
" tR całkowity czas retencji - czas od momentu wprowadzenia
próbki na kolumnę do momentu pojawienia się na chromatogramie
maksimum piku
" to zerowy (martwy) czas retencji - czas przebywania w
kolumnie substancji, która nie oddziałuje z fazą stacjonarną
" t zredukowany czas retencji (charakt. dla substancji)
R
t = tR - to
R
" k współczynnik retencji (współczynnik
pojemnościowy kolumny)
tR -� t0 t'
R
k'=� =�
t0 t0
9
tR (VR)
to (Vo) t (V )
R R
tR (VR)
tR -� t0 t'
R
k'=� =�
t0 t0
" im silniej substancja
oddziałuje z wypełnieniem
kolumny (dłuższy czas
retencji), tym większa wartość
współczynnika
Parametry retencji
" VR całkowita objętość retencji- objętość fazy
ruchomej potrzebna do wymycia danego składnika,
zależy od rodzaju kolumny (długości, średnicy, wypełnienia kolumny),
prędkości wypływu fazy ruchomej
VR = czas retencji * prędkość wypływu fazy ruchomej (ml/min)
" Vo zerowa (martwa) objętość retencji, objętość
fazy ruchomej wewnątrz kolumny
Vo = zerowy czas retencji * prędkość wypływu fazy ruchomej (ml/min)
" V zredukowana objętość retencji
R
V = VR - Vo
R
10
Jakość rozdziału
chromatograficznego
Teorie sprawności rozdziału chromatograficznego
Dla opisu zjawiska rozdziału chromatograficznego, opracowano trzy podstawowe
teorie: teorię półek, teorię kinetyczną oraz teorię kolumn kapilarnych.
Teorie sprawności rozdziału chromatograficznego
Dla opisu zjawiska rozdziału chromatograficznego, opracowano trzy podstawowe
teorie: teorię półek, teorię kinetyczną oraz teorię kolumn kapilarnych.
Teoria półek
O jakości rozdziału chromatograficznego decyduje sprawność kolumny.
Sprawność kolumny określają:
- wysokość półki teoretycznej H (wys. równoważna półce teoret WRPT) -
- liczba półek teoretycznych (N)
Sprawność kolumny rośnie wraz ze wzrostem N i ze zmniejszeniem H
Półka teoretyczna - część objętości kolumny, w której osiągnięty zostaje stan
równowagi pomiędzy stężeniami substancji chromatografowanej w fazie ruchomej
i fazie stacjonarnej
Kolumna chromatograficzna składa się z N półek teoretycznych
L= N��H
gdzie: L - długość kolumny w mm, N - liczba półek teoretycznych,
H (lub inaczej WRPT)  wysokość równoważna półce teoretycznej  najmniejsza
długość odcinka kolumny w której zostaje osiągnięty stan równowagi
11
Doświadczalne wyznaczanie liczby półek (N) w kolumnie
Wysokość półki teoretycznej (H) (lub inaczej WRPT) :
H = WRPT = L/N
N=L/H
Liczbę półek teoretycznych (N) w kolumnie można wyznaczyć z chromatogramu
przy użyciu substancji testowej. W wyniku chromatografowania substancji
testowej otrzymuje się pik i dane, które można zmierzyć.
Krzywa dzwonowa Gaussa: rozkład stężeń subst. po przejściu przez N półek
Y
s�
Wyznaczanie liczby półek
teoretycznych (N) na podstawie
2�s�
parametrów piku: czasu retencji
h
i szerokości piku
2�,�3�5�s�
tR 2
ć� ��
s� s� s� s�
n =� 16
N
�� ��
m x
X
4s�
Ł� ł�
tR tRx
Na podstawie N wyznacza się WRPT, co umożliwia określenie
sprawności kolumny: im wartość WRPT jest mniejsza tym kolumna ma
więcej półek (N) - większa jest sprawność kolumny
Teoria kinetyczna
Określa w jaki sposób prędkość przepływu fazy ruchomej przez kolumnę oraz
zjawiska zachodzące w kolumnie wpływają na parametry N i H (czyli WRPT)
a tym samym na sprawność rozdzielczą kolumny.
Równanie van Deemtera: zależność wysokości półki teoretycznej (H) od
średniej liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej (u) przez kolumnę.
B
H =� A +� +� Cu
u
H - wysokość półki teoretycznej  charakteryzuje sprawność kolumny
k
- średnia prędkość liniowa fazy ruchomej,
A - dyfuzja wirowa (zależy od fazy stacjonarnej kolumny (ziarnistosci
wypełnienia, upakowania w kolumnie, średnicy kolumny)
B/k
- dyfuzja cząsteczkowa (podłużna) w fazie ruchomej (zależy od rodzaju fazy
ruchomej np.w GC-gazu nośnego)
Ck
- opisuje opór fazy stawiany podczas wymiany substancji między fazami
(zależy od K substancji chromatografowanej między fazami stacjonarną i
ruchomą i grubości fazy stacjonarnej
12
Mechanizm dyfuzji wirowej
W każdej upakowanej
kolumnie cząsteczki substancji
chromatografowanej poruszają
się w strumieniu fazy ruchomej
różnymi drogami  ich czasy
przebywania w kolumnie są
różne
cm
0,5
hmin
B
C
A
uopt. 5
10 cm/s
Zależność H (WRPT) od k
ma kształt hiperboli, na której minimum
odpowiada maksymalnej sprawności rozdzielczej kolumny.
Najlepsze efekty rozdzielania (H = WRPT minimum) otrzymuje się przy
optymalnym przepływie fazy ruchomej przez kolumnę.
Sprawność kolumny chromatograficznej można zwiększyć (obniżając H):
��dobór optymalnej prędkości przepływu fazy ruchomej,
��taki dobór kolumny i jej wypełnienia aby parametry A, B i C były możliwie małe
13
Wysokość półki teoretycznej (H)
Teoria kolumn kapilarnych
Kolumna kapilarna - rurka o wewnętrznej średnicy 0.2 - 0.5 mm, której
wewnętrzne ścianki pokryte są cienką warstwą cieczy stanowiącej fazę
stacjonarną.
Przepływ fazy ruchomej ma charakter laminarny (po torach równoległych,
bez dyfuzji wirowej); kolumny mają wysoką zdolność rozdzielczą, gdyż
cienki film fazy ciekłej ogranicza dyfuzję (liczba półek teoretycznych 5000 i
więcej na 1 metr kolumny). Sprawność kolumn może być określona
równaniem Deemtera, zmodyfikowanym przez wyeliminowanie czynnika
dyfuzji wirowej.
Część 1
Wysokosprawna chromatografia
cieczowa (HPLC)
Literatura:
1. Z. Witkiewicz: Podstawy chromatografii. WNT Warszawa, 2000. 2005
2. W. Szczepaniak: Metody instrumentalne w analizie chemicznej. PWN
Warszawa, 1999, 2002
3. A. Braithwaite, F.J. Smith,: Chromatografic methods. 5th edition
Chapman&Hall 1996.
4. V. R. Meyer :  Practical High-Performance Liquid Chromatography. John
Willey& Sons, 2004.
5. D.A. Skoog, D.M. West, F.J. Holler, S.R. Crouch: Podstawy chemii
analitycznej, 2. Przekład pod red A. Hulanicki, PWN, W-wa 2006
14
Chromatografia cieczowa (HPLC)
ż�Chromatografia jest metodą polegającą na rozdzielaniu składników
mieszaniny w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i
fazę stacjonarną
HPLC obejmuje metody, w których fazą ruchomą jest ciecz a fazą
stacjonarną ciało stałe (adsorpcyjna) lub ciecz (ciekła faza
stacjonarna związana chemicznie z nośnikiem (podziałowa ).
FAZA RUCHOMA FAZA STACJONARNA RODZAJ chromatografii
ciecz ciecz (tzw. fazy ch. związane) Podziałowa
ciecz ciało stałe Adsorpcyjna
Żelowa
Jonowymienna
Na kolumnie chromatograficznej następuje rozdział mieszaniny
niesionej przez ciecz ( jeden lub więcej rozpuszczalników), pomiędzy dwie fazy
Chromatografia cieczowa (HPLC)
Określenia (cechy):
��wysokosprawna chromatografia cieczowa
(high performance liquid chromatography (HPLC)
��wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa
(high pressure liquid chromatography (HPLC)
��szybka chromatografia cieczowa
(high speed liquid chromatography (HPLC)
��chromatografia cieczowa wysokorozdzielcza
(high resolution liquid chromatography (HPLC)
15
Wysokosprawna chromatografia
cieczowa (HPLC)
Rozdział (rozdzielanie)na kolumnie chromatograficznej
mieszniny związków pomiędzy dwie fazy:
stacjonarną (nieruchomą) ciało stałe lub ciecz* i
ruchomą ciecz (jeden lub kilka rozpuszczalników).
Efektywność rozdziału poprawia się wykorzystując
wysokie ciśnienie (pompy wysokociśnieniowe)
W jaki sposób następuje rozdział?
 ciecz-ciecz: podział pomiędzy ciekłą fazę ruchomą a ciekłą fazę
stacjonarną chemicznie związaną z nośnikiem (tzw. fazy związane)
 ciecz-ciało stałe: adsorpcja na stałej fazie stacjonarnej (adsorbencie)
Aparatura do HPLC
" Zbiornik z fazą ruchomą (odgazowany
rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników)
" Pompy (stałociśnieniowe, stałoprzepływowe)
" Dozownik
ew.
" Kolumna
termostat
" Detektor
" Komputer
" Ew. kolektor frakcji
16
Schemat blokowy chromatografu cieczowego.
Zasada działania
Zbiornik fazy
ruchomej (cieczy)
Manometr
Dozownik
Pompa
Kolumna
Termostat
kolumny
Kolektor
Kolektor
Detektor
frakcji
frakcji
Faza ruchoma (eluent)
Jeden lub kilka (zwykle nie
więcej niż 3) różne
rozpuszczalniki mieszające się
ze sobą:
" nieszkodliwe w stosunku
do rozdzielanych związków,
wypełnienia kolumny i
przyrządu
" dobre rozpuszczalniki
badanych związków
umożliwiające ich detekcję,
" o wysokiej czystości,
" odgazowane
17
Rozdział mieszanin w HPLC
Izokratyczny - skład fazy ruchomej (eluentu) stały w
trakcie całego procesu chromatograficznego
Gradientowy - skład eluentu zmienia się stopniowo
w trakcie procesu chromatograficznego zgodnie z
określonym programem
Pompy  ważna część chromatografu HPLC
- powodują ciągły, odtwarzalny i z optymalną
prędkością przepływ fazy ruchomej przez
kolumnę
- stałoprzepływowe, tłokowe:
przepływ: 0.1-30 ml/min
cisnienie: do 50 MPa
18
Dozowniki
Typy: strzykawkowy; zawór dozujący z pętlą; pętla ze
strzykawką
Dozownik typu zawór z pętlą: a) napełnienie pętli, b)
wstrzykiwanie do kolumny
1 - pętla, 2  wlot fazy ruchomej, 3  wylot fazy ruchomej do kolumny,
4  wprowadzenie próbki
Kolumny do HPLC
-kolumny wraz z wypełnieniem - element chromatografu w
którym zachodzi właściwy proces chromatograficzny
WYBÓR kolumny  w zależności od jej rozmiarów-
uwarunkowany jest wielkością próbki,
czasem jej rozdzielania, efektem jaki
chcemy osiągnąć
- Analityczne-o średnicy 3-5 mm; mikrokolumny - średnica 3-200�m;
długość 1-35 cm
- Preparatywne o średnicy 4-50 mm; długość 100-300 mm
Prekolumny (przedkolumny)- ochrona właściwej kolumny.
19
Wypełnienia kolumn i fazy ruchome
w HPLC
- Adsorpcyjna HPLC
- Podziałowa HPLC
Normalny układ faz (NP) Odwrócony układ faz (RP)
faza stacjonarna - bardziej polarna faza stacjonarna  mniej polarna
niż faza ruchoma niż faza ruchoma
Fazy nieruchome (wypełnienia kolumn)
i fazy ruchome w HPLC
Adsorpcyjna HPLC Podziałowa HPLC (NP)
FAZY NIERUCHOME =
FAZY NIERUCHOME
tzw.fazy chemicznie związane
" żel krzemionkowy
(adsorbent polarny) " związana faza cyjanowa(-CN )
FAZY RUCHOME
" tlenek glinu (pH 2-12) " aminowa (NH2)
rozpuszczalniki
" diolowa
niepolarne
f. chem związ = fazy pseudociekłe -
układ: ciecz-ciecz
20
Struktura żelu
krzemionkowego
Faza ruchoma (eluent):
w chromatografii adsorpcyjnej i podziałowej w NP
(fazy stacjonarne-polarne)
Fazy ruchome - mniej polarne
- rozpuszczalniki niepolarne (heksan, chloroform,
izopropanol, octan etylu)
- Siła elucji (siła odziaływania z f. stacjonarną):
izopropanol > chloroform > octan etylu > heksan
Klasyfikacja rozpuszczalników wg. mocy elucyjnej - tzw.
szereg eluotropowy
Zastosowanie: związki niepolarne lub średnio polarne
rozpuszczalne w fazie ruchomej; etery, estry, porfiryny,
mikotoksyny, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach.
21
Mechanizm rozdziału w chromatografii
adsorpcyjnej i podziałowej w NP
" Oddziaływania polarne (ale niejonowe) z fazą
nieruchomą
Związek bardziej polarny będzie silniej oddziaływał z
polarnym wypełnieniem kolumny i pozostanie w niej dłużej
(a niepolarny krócej)
Związek z większą liczbą czynnych grup polarnych
pozostanie na kolumnie dłużej.
" Polarność rozpuszczalnika (eluentu) odgrywa
kluczową rolę w procesie rozdziału.
" Eluent bardziej polarny silniej współzawodniczy z substancją
chromatografowaną o miejsce na powierzchni adsorbenta 
substancja krócej pozostanie zatrzymana w kolumnie.
Wypełnienia kolumn i fazy ruchome
W HPLC podziałowej w odwróconym układzie faz (RP)
��Wypełnienia kolumn=faza nieruchoma (niepolarna):
� żel krzemionkowy modyfikowany:
- związana faza metylowa (C2)
- związana faza oktylowa (C8)
- związana faza oktadecylowa (C18)
- faza związana fenylowa
- faza związana cyjanowa
- fazy organiczne (polimerowe)
�� Faza ruchoma: metanol, acetonitryl lub THF w
mieszaninie z wodą lub buforem.
Parametry retencyjne można regulować przez dobór rozpuszczalnika.
Najczęściej: metanol-woda; acetonityl-woda (elucja gradientowa)
22
Schemat żelu krzemionkowego z grupami alkilowymi chem. związanymi
Odwrócony układ faz (RP-HPLC)
" Zasada rozdziału: podział związków analizowanych
(analitów) pomiędzy fazę ruchomą a fazę
nieruchomą wewnątrz porowatej przestrzeni +
adsorpcja na powierzchni fazy związanej.
Zastosowanie: ~80% wszystkich analiz wykonuje
się w układzie RP HPLC.
23
Mechanizm rozdziału w RP-HPLC
" Niepolarne (niespecyficzne) oddziaływania
zw. analizowanego (analitu) z hydrofobową
powierzchnią fazy związanej (C18, C8, C4 itp.)
" Różne powinowactwo sorpcyjne pomiędzy
analitami prowadzi do ich rozdziału:
" Związek bardziej polarny (hydrofilowy) pozostaje na
kolumnie krócej
" Związek z większą częścią hydrofobową pozostaje na
kolumnie dłużej
24
Detektory HPLC
Klasyfikacja:
- detektory w których następuje pomiar właściwości charakterystycznych
dla próbki (np.. spektroskopowe, elektrochemiczne)
stałe l� �(254 nm)
UV zmienne l� �
spektrofotometryczne VIS diode array
IR
detektory spektrofluorymetryczne
spektroskopowe
AAS
spektroskopii atomowej
AES
amperometryczne
woltamperometryczne
właściwość detektory
kulometryczne
próbki elektrochemiczne
potencjometryczne
detektory
radioaktywacyjne
- detektory w których następuje różnicowy pomiar
właściwości wspólnej dla próbki i fazy ruchomej (np.
refraktometryczne)
detektor
refraktometryczny
pomiar
detektor
różnicowy
konduktometryczny
detektor
absorpcyjny
25
Detektory HPLC
Najczęściej stosowane:
- Spektrofotometryczny
- Fluorescencyjny
- Refraktometryczny
- Elektrochemiczny
- Spektrometr mas
sprzężenie(LC-MS)
Detektory spektrofotometryczne
��Spektrofotometryczne UV lub UV-VIS
- pomiar absorbancji przy jednej lub kilku l�
np. 254 nm
- pracujące w całym zakresie UV lub UV-VIS
- typu photodiode array (PDA)  pomiar
absorbancji jednocześnie przy różnych
długościach fal; możliwość pomiaru widm
absorpcji.
Czułość ~ 10-9 g/cm3
26
detekcja przy 280 nm detekcja przy 330 nm
Przykład:
Rozdzielanie HPLC
frakcji albumin rzepaku
przy dwóch l�
1-kwas 2-albuminy
Wima UV :
sinapowy
1- kwasu sinapowego
2- frakcji albumin rzepaku
Przykład: Detekcja związków polifenolowych w ekstrakcie z cebuli
przy użyciu detektora PDA
27
Detektor fluorescencyjny
" Selektywny w stosunku do związków
wykazujących fluorescencję.
" Znacznie czulszy niż inne detektory.
" Możliwość pomiaru widm emisyjnych i
wzbudzeniowych
" Czułość ~ 10-10 g/cm3
Detektor refraktometryczny
- Mierzy różnicę współczynników załamania
światła czystej fazy ruchomej i eluatu (fazy
wypływającej z kolumny).
- Czuły na zmiany temperatury stąd kolumny
powinny być termostatowane.
Czułość ~ 10-7 g/cm3
28
Sprzężenie HPLC
ze spektrometrem
mas (HPLC-MS):
-rozdział
chromatograficzny
składników,
-identyfikacja
(widmo mas)
Parametry wpływające na
rozdział w RP-HPLC
- Wypełnienie kolumny
- Siła elucji rozpuszczalnika
- Rodzaj eluentu
- pH fazy ruchomej
29
Interpretacja wyników GC i HPLC
" identyfikacja składników mieszaniny
" oznaczenie stężenia składników
(II część wykładu )
Zastosowanie HPLC
Rozdział i analiza większości substancji, szczególnie
tych których nie można rozdzielać metodą GC lub
rozdział jest trudny (rozkład termiczny.)
ż� Analityczne
ż� Analityczne  rozdział, identyfikacja i analiza
ilościowa składników mieszaniny
ż� Preparatywne
ż� Preparatywne  wydzielenie i oczyszczenie
jednego lub więcej składników w mieszaninie
30
Najczęściej analizowane związki :
1. Związki biologicznie czynne: białka, polipeptydy, aminokwasy,
polisacharydy, witaminy, sterydy, kwasy nukleinowe
2. Preparaty farmaceutyczne
3. Środki ochrony roślin
4. Węglowodory policykliczne
5. Związki metaloorganiczne i kompleksowe
6. Aniony nieorganiczne
7. Rozdzielanie ziem rzadkich
8. Związki organiczne zawarte w żywności, paszach i w środowisku
naturalnym
Atuty metody: wysoka rozdzielczość
duża czułość: 10-8  10-2g
czas analizy 1-60 min.
Zastosowanie HPLC
- analiza jakości towarów: kontrola żywności (związki
biologicznie czynne: prozdrowotne i toksyczne),
preparatów (para)farmaceutycznych, kosmetyków,
materiałów, opakowań
- kontrola zanieczyszczenia środowiska (wody, gleby,
żywności...)
- kontrola i regulacja procesów technologicznych
31
Chromatografia
gazowa (GC) i cieczowa (HPLC)
Zagadnienia:
(2011/2012):
" Zastosowanie chromatografii gazowej i cieczowej.
" Zasada rozdziału chromatograficznego; współczynnik
podziału
" Podział i charakterystyka metod chromatograficznych
" Podstawowe pojęcia i definicje; parametry retencji
" Chromatografia gazowa (GC): charakterystyka metody,
sposób rozdziału składników -mieszaniny w
chromatografii gazowej adsorpcyjnej i podziałowej,
zastosowanie metody.
" Chromatograf gazowy (GC): schemat blokowy, zasada
działania, kolumny i wypełnienia kolumn, fazy
stacjonarne, fazy ruchome, rozdział izotermiczny i z
programowaną temperaturą, detektory.
Zagadnienia (cd):
" Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC):
charakterystyka metody, sposób rozdziału składników
mieszaniny w HPLC adsorpcyjnej i podziałowej,
zastosowanie metody.
" Chromatograf cieczowy (HPLC): schemat blokowy,
zasada działania, kolumny, wypełnienia kolumn (fazy
stacjonarne), fazy ruchome, elucja izokratyczna i
gradientowa, detektory.
" Analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii gazowej i
cieczowej
32