Ćwiczenie 9 (MOiŚ)
T: Metody oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml próby badanej (NPL)
a) metoda probówkowa
b) metoda płytek agarowych
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
3) Metoda filtrów membranowych
1) Oznaczanie ogólnej liczby drobnoustrojów w 1 ml (NPL)
a) metoda probówkowa
·ð wykonujemy 6 rozcieÅ„czeÅ„ badanej próby w postÄ™pie dziesiÄ™tnym; rozcieÅ„czenia
wykonujemy w 0,85% NaCl
·ð każdemu rozcieÅ„czeniu próby przyporzÄ…dkowujemy 5 probówek wypeÅ‚nionych 10 ml
bulionu zwykłego. Do każdej z tych 5 probówek wlewamy po 1 ml próby z odpowiedniego
rozcieńczenia.
·ð inkubujemy 24 h
·ð zliczamy probówki z poszczególnych rozcieÅ„czeÅ„ w których obserwujemy wzrost bakterii
(wynik dla każdego z rozcieńczeń będzie od zera do pięciu)
·ð zapisujemy wyniki i ukÅ‚adamy tzw. liczbÄ™ charakterystycznÄ…; liczba charakterystyczna
składa się z 3 cyfr;
Pierwsza cyfra przyporządkowana jest ostatniemu rozcieńczeniu, które daje wzrost we
wszystkich próbach (lub w maksymalnej ilości), a kolejne cyfry liczby charakterystycznej
oznaczają liczbę prób dodatnich z kolejnych rozcieńczeń
Przykład
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
5 5 5 2 0 0
Odczytana liczba charakterystyczna to 520
·ð Porównujemy wynik z tablicami Makrediego:
Dla 520 wynik z tablic to 5
·ð Mnożymy liczbÄ™ odczytanÄ… z tablic razy odwrotność rozcieÅ„czenia odpowiadajÄ…cego
pierwszej cyfrze liczby charakterystycznej (520) czyli 10-3
·ð NPL= 5 x odwrotność rozcieÅ„czenia
NPL= 5x103 = 5 x 1000
NPL = 5000 komórek bakteryjnych
Otrzymana liczba to liczba bakterii w 1 ml badanej próby. Oczywiście nie jest to pomiar co
do jednej komórki bakteryjnej tylko przybliżony odczyt lub nawet rząd wielkości.
[[[[[[]]]]]]]]
!!! WyjÄ…tki w tworzeniu liczby charakterystycznej:
·ð jeżeli wszÄ™dzie sÄ… piÄ…tki to bierzemy 3 ostatnie cyfry, odczytujemy z tablic McCrady ego ale stawiamy znak
większości, a nie równości
·ð 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
5 5 5 5 5 5 --> 555
NPL > odczyt z tablic x 10-4
·ð jeżeli żadne z rozcieÅ„czeÅ„ nie dajÄ… 5 wyników pozytywnych to pod uwagÄ™ bierzemy rozcieÅ„czenie z najwyższÄ…
liczbą prób dodatnich i dwa kolejne rozcieńczenia
2 0 0 0 0 0 --> 200
NPL > odczyt z tablic x 10-1
·ð jeżeli ostatnia cyfra liczby charakterystycznej to 1, a za niÄ… w kolejnym rozcieÅ„czeniu jest również 1 to
sumujemy obie jedynki i wpiusujemy 2 w miejsce ostatniej cyfry liczby charakterystycznej
5 5 3 1 1 0 liczba charakterystyczna to 532
[[[[[[[[]]]]]]]]
b) metoda płytek agarowych (metoda płytek lanych)
·ð wykonujemy rozcieÅ„czenia dziesiÄ™tne badanej próby
·ð każdemu rozcieÅ„czeniu przyporzÄ…dkowujemy 2 pÅ‚ytki Petriego
·ð na każdÄ… pÅ‚ytkÄ™ wylewamy po 1 ml każdego rozcieÅ„czenia i zalewamy 10 ml upÅ‚ynnionego
agaru o temperaturze max. 42°C
·ð inkubujemy 24 h
·ð zliczamy liczbÄ™ kolonii (kolonie na powierzchni i kolonie wgÅ‚Ä™bne) w każdej parze pÅ‚ytek
agarowych
·ð do obliczenia wyniku bierzemy pod uwagÄ™ pÅ‚ytki zawierajÄ…ce 10-300 kolonii; z każdej pary
płytek spełniających wymaganie wyciągamy średnią liczbę kolonii
Przykład:
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
>300 >300 70 9 0 1
>300 270 50 13 2 1
wynik to 60
·ð mnożymy wynik przez odwrotność rozcieÅ„czenia i otrzymujemy NPL jednostek
tworzÄ…cych kolonie (CFU) w 1 ml
·ð jeżeli bÄ™dÄ… 2 rozcieÅ„czenia speÅ‚niajÄ…ce wymagania to oba bierzemy pod uwagÄ™ wyciÄ…gajÄ…c
średnią
2) Oznaczanie liczby bakterii w 100 ml próby badanej
a) metoda posiewów trójkowych
·ð wlewamy po10 ml badanej próby do trzech kolbek zawierajÄ…cych po 100 ml podÅ‚oża
·ð wlewamy po 1 ml badanej próby do trzech probówek zawierajÄ…cych po 10 ml podÅ‚oża
·ð wlewamy po 0,1 ml badanej próby do trzech probówek zawierajÄ…cych po 10 ml podÅ‚oża
A
ącznie 9 kolbek/probówek
·ð inkubujemy 24h w optymalnej temperaturze
·ð Zliczamy liczbÄ™ prób dodatnich w każdym rozcieÅ„czeniu, np:
3 x 10:100 3 x 1:10 3 x 0,1:10
1/3 0/3 1/3
Tworzymy trzycyfrowÄ… liczbÄ™:  101
Odczytujemy z odpowiednich tablic wartość odpowiadającą ustalonym próbom. Wartość
odczytana z tablic to NPL bakterii w 100 ml wody (wskaz
nik wody).
[[[[[[]]]]]]
Inny system posiewu trójkowego:
3 x 100ml próby do 100 ml pożywki
3 x 10ml próby do 100 ml pożywki
3 x 1 ml próby do 10 ml pożywki
W tym wypadku wynik odczytany z tablicy dzielimy przez 10 ponieważ podaliśmy 10x
więcej próby.
[[[[[[]]]]]]
3) Metoda filtrów membranowych
·ð przefiltrować danÄ… objÄ™tość próby przez krążek o odpowiedniej Å›rednicy porów
Można przefiltrować 1ml, 10ml, 50ml, 100ml i inne objętości próby ale zawsze musimy
przefiltrować co najmniej 25 ml płynu przez sączek. Jeżeli chcemy przefiltrować tylko 1ml
próby (bo jest ona bardzo zagęszczona itd.) To dodajemy do tej próby 24 ml 0,85% NaCl i
dopiero wtedy filtrujemy.
·ð krążek umieÅ›cić na pożywce
·ð inkubacja 24h w optymalnej temperaturze
·ð zliczamy kolonie, które rosnÄ… na filtrze; bierzemy pod uwagÄ™ tylko liczbÄ™ kolonii
mieszczÄ…cÄ… siÄ™ w szeregu optymalnym tzn. 6-96 kolonii.
Wskaz
nik = liczba kolonii x 100 / ilość przefiltrowanej wody w ml
Wskaz
nik: liczba kolonii w 100 ml próby
Miano = 100/wskaz
nik
(MIANO: najmniejsza objętość próby, w której znajduje sie 1 komórka bakteryjna)