Politechnika Wrocławska Strona 1 z 3
Sprawozdanie 1.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/17
Enzymologia (BTC4033l) Anna Dawiec
Ćwiczenie 1.
laboratorium Mateusz Jędrzejewski
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Marta Kłoczaniuk
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrozynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Wstęp
Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane
są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz
glikoneogenezy. KatalizujÄ… reakcjÄ™ rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.)
2- 2-
CH2OPO3 CH2OPO3
C O C O
H O
aldolaza
C
HO C H H C OH
+
H C OH
H C OH H
2-
CH2OPO3
C OH
CH2OPO2-
3
fruktozo-1,6-disfosforan
fosfodihydroksyaceton
aldehyd
3-fosfoglicerynowy
Reakcja 1.  Reakcja katalizowana przez aldolazÄ™
Stężenia enzymu można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie to współczynnik ekstynkcji, a do długość
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.
· · (1)
Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)
w czasie  szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2).
µmol substratu
U (2)
min
Test hydrozynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym
oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.
W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny
w stosunku 1:1.
Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).
(3)
Cel
Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.
Wykonanie {Trzeba dopisać treść instrukcji, sam załącznik to za mało}
Doświadczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji. Do wyznaczenia
stężenia aldolazy użyto po 3000 źl buforu oraz odmierzono 60 źl stężonego roztworu aldolazy.
Politechnika Wrocławska Strona 2 z 3
Sprawozdanie 1.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/17
Enzymologia (BTC4033l) Anna Dawiec
Ćwiczenie 1.
laboratorium Mateusz Jędrzejewski
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Marta Kłoczaniuk
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrozynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Wyniki
Tabela 1.  Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych
pomiar 1° pomiar 2° Å›rednia* uwagi
60 -
µl
odczyt
0,1954
ze spektrofotometru
ald
ald
, %
0,2147
·
mg/ml
ald
23
ald
µl
odczyt z wykresu 1.
0,09 0,08 0,085
odczyt z wykresu 1.
0,265 0,26 0,262
" "
0,175 0,18 0,178
ald
ald
2,866 " 10 3
ald
mg/ml
"t
3 3 3 -
min
Akt ald
Akt ald · 10
0,0214 0,0220 0,0217
· ·"
U/ml
Akt tot Akt tot Akt ald ·
0,0369 0,0379 0,0374
U
Akt ald
Akt spec
Akt spec
7,47 7,68 7,58
ald
U/mg
* Å›rednia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.
gdzie:
masa aldolazy: 5 µg
ald
długość drogi optycznej (szerokość kuwety): 1 cm
, % ml
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 0,91 mg·cm
1
molowy współczynnik ekstynkcji dla hydronazonu GAP (przy 240 nm): 2730 M·cm
objÄ™tość: 1,5 ml 200 µl 23 µl 1723 µl 1,723 ml
µl
rozcieńczenie: 74,9
µl
Politechnika Wrocławska Strona 3 z 3
Sprawozdanie 1.
Wydział Chemiczny Data zajęć: 2008/10/17
Enzymologia (BTC4033l) Anna Dawiec
Ćwiczenie 1.
laboratorium Mateusz Jędrzejewski
Zapoznanie się z metodą określania aktywności
mgr inż. Dominika Bystranowska Marta Kłoczaniuk
aldolazowej wykorzystujÄ…cej test hydrozynowy.
PT, 16:10-18:45, F-4/C3 Aleksandra KorkuÅ›
Tabela 2.  Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy
wykonane na podstawie wartoÅ›ci Å›rednich pomiarów 1° i 2°
uwagi
· · ·
ald ald ald ald
10,9
mg/ml
Akt ald Akt ald · · Akt ald
82,9
U/ml
Akt tot* Akt tot Akt ald ·
82,9
U
Akt ald · ·Akt ald
Akt spec
Akt spec Akt spec
7,58
· · ald
ald
U/mg
* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 1 ml.
gdzie:
µl µl
rozcieńczenie: 51
µl
Wnioski
Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami
spektrofotometrycznymi. Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie,
z dobrym przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,
im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita
(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia
enzymu i wynosi średnio 7,58 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych
od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,15).
{Można było dodać coś o samym teście enzymatycznym.}
Załączniki
1. Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).
2. Instrukcja  Ćwiczenie 1. wraz z bieżącymi notatkami.