Wykład:
Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w biotechnologii
Po co nam biotechnologia ?
·ð W odniesieniu do produkcji żywnoÅ›ci celem biotechnologii jest:
opracowanie sposobów poprawienia cech organoleptycznych produktów (koloru, smaku, zapachu)
·ð ich wartoÅ›ci odżywczej (zawartoÅ›ci biaÅ‚ek, lipidów i sacharydów)
·ð modyfikacje cech produkcyjnych roÅ›lin (np. opóz
nienie dojrzewania, odporność na suszę, zasolenie
czy też na szkodniki, obniżenie kosztów produkcji roślinnej).
Równie ważne jest:
o zapewnienie bezpieczeństwa zdrowotnego żywności (zwalczanie patogenów i szybkie testy na ich
wykrywanie)
o możliwość pozyskiwania żywności funkcjonalnej, tzn. wzbogaconej np. w witaminy, mikro- i
makroelementy oraz inne cenne składniki odżywcze lub też o obniżonej zawartości składników
antyodżywczych
o produkcja roślin zawierających substancje farmakologiczne, czyli tzw. jadalne szczepionki, rośliny
zawierające określone leki
Wymagania wobec mikroorganizmów stosowanych w biotechnologii:
·ð stabilizacja cech genetycznych, fizjologicznych, morfologicznych i technologicznych
·ð szczególnie przy produkcji z użyciem drogich skÅ‚adników i w dużej iloÅ›ci, gdyż wymienione skÅ‚adniki
rzutują na efektywność ekonomiczną przedsięwzięcia
·ð dotyczy to głównie organizmów zmodyfikowanych genetycznie, gdyż nakÅ‚ady finansowe na
otrzymanie rekombinantu o pożądanych cechach są znaczne, zaś stabilność genetyczna organizmu
labilna
Zaburzenia procesów biotechnologicznych
Mimo zachowania wszelkich zasad GLP (dobrej praktyki laboratoryjnej) lub GMP (dobrej praktyki
przemysłowej) może dojść do zaburzeń procesów biotechnologicznych:
" zakłócenia założonych warunków inżynieryjnych i w efekcie wydajności procesu
" utraty właściwości użytkowych technologicznych przez mikroorganizm stosowany w procesie
biotechnologicznym
" zmiany warunków hodowli lub otrzymywanych produktów
Zaburzenia procesów biotechnologicznych
bakteriofagi straty finansowe
LAB w biotechnologii
Biosynteza aminokwasów:
o L-lizyna (rodzaj LAB: Brevibacterium)
o kwas L-glutaminowy (rodzaj LAB: Brevibacterium)
Wiadomo, że drobnoustroje syntetyzują wiele aminokwasów niezbędnych do budowy specyficznych białek.
Geny odpowiedzialne za biosyntezę poszczególnych aminokwasów  kontrolują aktywność enzymów
biorących udział w biosyntezie danego aminokwasu, aby nie dopuścić do jego nadprodukcji.
W wyniku selekcji drobnoustrojów można uzyskać organizmy przydatne do przemysłowej produkcji
aminokwasów.
Jednocześnie przez dobór warunków hodowli, a zwłaszcza mutagenizację drobnoustrojów metodami
fizycznymi, chemicznymi lub inżynierii genetycznej, można uzyskać organizmy zdolne do nadprodukcji
danego aminokwasu.
Strona 1
Mutagenizacja - wywołuje zmiany kierunków metabolicznych w wyniku zmiany aktywności określonych
enzymów, co powoduje zahamowanie biosyntezy niektórych aminokwasów i nadprodukcję pożądanego.
Umożliwia uzyskanie drobnoustrojów z rozkojarzonym systemem regulacji, nadprodukujących dany
aminokwas ze związku chemicznego, który jest prekursorem
dla zahamowanej biosyntezy innych aminokwasów.
Uwaga:
Aminokwas, którego biosynteza została zahamowana, powinien być dodawany do pożywki.
Przebieg biosyntezy L-lizyny
1. aminotransferaza glutaminianowa przekształca szczawiooctan z cyklu kwasów trikarboksylowych
w L-asparaginian,
2. kinaza asparaginowa przeksztaÅ‚ca L-asparaginian do semialdehydu ²-asparaginowego,
3. enzymem decydujÄ…cym o syntezie L-lizyny z semialdehydu jest syntetaza dihydrodipikolinianowa,
4. jej aktywność jest kilkunastokrotnie mniejsza od aktywności dehydrogenazy homoserynowej, katalizującej
syntezÄ™ L-metioniny, L-treoniny i L-izoleucyny,
5. aktywność kinazy asparaginowej można w 90 % zahamować nadmiarem L-lizyny i L-treoniny, natomiast
L-izoleucyna i L-walina zwiększają jej aktywność o 50 %, znosząc jednocześnie hamujące działanie L-
lizyny i L-treoniny,
6. w biosyntezie mikrobiologicznej L-lizyny używa się mutantów auksotroficznych, które nie syntetyzują
dehydrogenazy homoserynowej lub mutantów regulatorowych, których kinaza asparaginowa jest
niewrażliwa na obecność analogu L-lizyny i L-treoniny,
7. najkorzystniej jest używać drobnoustrojów wykazujących te dwa rodzaje mutacji
Biosynteza kwasu L-glutaminowego
1. powstający w cyklu kwasów trikarboksylowych 2-oksoglutaran ulega przemianie do kwasu L-
glutaminowego w obecności dehydrogenazy glutaminianowej lub też może ulec dalszej przemianie w
cyklu Krebsa zapoczÄ…tkowanej przez dehydrogenazÄ™ 2-oksyglutaranowÄ….
2. u auksotroficznych mutantów aktywność dehydrogenazy oksyglutaranowej jest bardzo mała, natomiast
dehydrogenazy glutaminianowej bardzo duża, co zapewnia nadprodukcję kwasu L-glutaminowego.
Biosynteza antybiotyków i bakteriocyn:
·ð nizyna lantybiotyk obecnie zaliczany do bakteriocyn (niektóre szczepy Lactococcus lactis subsp.
lactis)
·ð bakteriocyny bioutrwalanie żywnoÅ›ci nie tylko fermentowanej (różne rodzaje LAB)
Bakteriocyny bakterii G(+)
Generalnie, bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich dzieli siÄ™ na 4 klasy:
I) lantybiotyki - peptydy o masie cząsteczkowej poniżej 5 kDa, zawierające w swojej cząsteczce tioeterowy
aminokwas lantioninę, a czasem także 3-metylolantioninę. Są to substancje ciepłostabilne, o średnim lub
szerokim spektrum działania, np. nizyna, laktycyny;
II) peptydowe bakteriocyny - małe, nielantybiotykowe peptydy, o masie cząsteczkowej poniżej 10 kDa,
ciepłostabilne, o średnim lub szerokim spektrum działania, np. pediocyna AcH, sakacyna A,
laktokokcyny, leukocyna UAL 187, enterocyna A, mesenterycyna Y105, diwercyna V41;
III) białkowe bakteriocyny - nielantybiotykowe białka, ciepłolabilne, o masie cząsteczkowej ponad 10 kDa,
o wąskim spektrum działania, np. helwetycyna J, helwecyna J, kaseicyna 80;
IV) kompleksy białkowe - zawierające cząsteczkę cukru lub lipidu niezbędną do ich aktywności,
ciepłostabilne, o średnim spektrum działania, np. leukonocyna S, pediocyna SJ-1.
Nizyna
Nizyna (wykryta w 1947 r.) jest jedyną bakteriocyną produkowaną w skali przemysłowej.
Nie hamuje rozwoju Gram-ujemnych bakterii, drożdży i pleśni, natomiast hamuje rozwój szeregu szczepów
Strona 2
bakterii z rodzajów Staphylococcus, Micrococcus, Clostridium, Bacillus, Listeria, Lactococcus i
Lactobacillus.
Uszkadza ścianę komórkową komórek wegetatywnych, ale nie działa na przetrwalniki, chociaż uniemożliwia
przekształcenie się ich w formy wegetatywne.
Jest trawiona przez trypsynę i nie wywołuje oporności oraz jest nietoksyczna dla organizmów wyższych,
dlatego jest bezpieczna dla zdrowia człowieka.
W większości krajów nie ustalono maksymalnego poziomu jej dodatku do żywności.
Znalazła zastosowanie w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w produkcji konserw owocowo-warzywnych,
jako że zachowuje swoją aktywność w temp. 121oC przez 15-20 min. (dodanie jej umożliwia obniżenie
temperatury obróbki konserw warzywnych).
Dodatek nizyny do produktów mięsnych, serów topionych, mleka przy produkcji serów (zapobiega rozwojowi
bakterii masłowych, a tym samym wzdymaniu serów).
W niektórych krajach dopuszcza się stosowanie nizyny w produkcji mleka, serów i deserów mlecznych
oraz innych napojów, co zapobiega ich kwaśnieniu.
Biosynteza nizyny
Selekcja szczepów do produkcji nizyny jest bardzo trudna ze względu na ich wrażliwość na bakteriofagi.
Szczepy Lc. lactis subsp. lactis odporne na fagi syntetyzują mało nizyny.
Ponieważ w hodowli Lc. lactis subsp. lactis często obserwuje się zakażenie dzikimi drożdżarni, przygotowanie
inokulum wymaga szczególnej staranności.
W celu uzyskania wymaganej objętości inokulum prowadzi się wielostopniową hodowlę lub też kilka hodowli
o małej objętości pożywki.
Najlepszą pożywką do hodowli bakterii jest sterylizowane mleko pełne, odtłuszczone lub regenerowane.
Hodowlę prowadzi się w warunkach beztlenowych, utrzymując kwasowość pożywki na stałym poziomie.
W celu wydzielenia nizyny, pożywkę po hodowli zakwasza się do pH 2, aby uwolnić nizynę zaadsorbowaną
na powierzchni komórek.
Po odwirowaniu roztwór doprowadza się pH 4,5 i dodaje chloroform oraz izooktanol.
Warstwę zawierającą chloroform wraz z nizyną oddziela się i dodaje ochłodzonego absolutnego alkoholu,
co powoduje wytrÄ…cenie nizyny.
Osad nizyny w temp. 50oC rozpuszcza się w HCl, a następnie wysala, używając NaCl.
Preparat nizyny w postaci proszku w temp. 18-22oC zachowuje aktywność przez kilka lat.
Biosynteza polisacharydów (egzopolisacharydów, EPS):
·ð polisacharydy otoczkowe(m.in. rodzaj Lactobacillus)
·ð dekstran (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides i Ln. mesenteroides subsp. dextranicum)
Uwaga:
LAB nie są stosowane do biosyntezy m.in. białek i lipidów.
Polisacharydy otoczkowe
Egzopolimery produkowane przez LAB są polisacharydami zbudowanymi z rozgałęzionych, powtarzających
siÄ™ jednostek poÅ‚Ä…czonych wiÄ…zaniami Ä…- i ²-glikozydowymi, wydzielane w wielu odmianach.
Jakkolwiek, skład cukrowy polimerów pozostaje podobny: prawie zawsze są obecne D-galaktoza, D-glukoza,
L-ramnoza, różnią się jedynie wzajemnym stosunkiem molowym.
W polisacharydach mogą być również obecne inne reszty, np. sn-glicerolo-3-fosforan, N-acetyloaminocukry,
grupy fosforowe i acetylowe.
Środowisko i warunki hodowli są jednym z czynników wpływających na skład cukrowy i odmiany wiązań
glikozydowych.
Masa egzopolisacharydów produkowanych przez LAB waha siÄ™ od 1 × 104 do 1 × 105.
Fizyczne i reologiczne właściwości polisacharydów zależą od struktury 3-wymiarowej lub przestrzennej
konformacji.
Strona 3
Natomiast 2- i 3-rzędowa struktura zależy od składu chemicznego polimeru.
Chociaż nawet niewielka zmiana w strukturze 1-rzędowej, może mieć ogromny wpływ na konformację i
właściwości EPS.
Znaczenie przemysłowe EPS wynika z ich właściwości emulgujących i reologicznych.
Heteropolisacharydy produkowane przez mezofilne
i termofilne LABw wpływają na konsystencję i strukturę jogurtów i innych fermentowanych napojów
mlecznych.
Lewan znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym jako doskonały biozagęszczacz.
Polisacharydy otoczkowe produkowane przez LAB mogą wywoływać również niepożądane efekty:
powodują zatykanie filtrów i rur (dekstrany i lewany przyczyniają się do strat sacharozy w przemyśle
cukrowniczym).
Dekstran
Dekstran jest polisacharydem zbudowanym z glukozy połączonej wiązaniami ą-(1-6)-D-glikozydowymi.
Między resztami glukozowymi są wiązania ą-(1-4)-
i ą-(1-3)-D-glukozydowe, tworzące  łańcuchy boczne.
Wiązania ą-(1-6)-D-glikozydowe stanowią 90  95 % wiązań glikozydowych w dekstranie, chociaż występuje
również dekstran, w którym wiązania ą-(1-6)- stanowią poniżej 50 %.
Masa czÄ…steczkowa dekstranu wynosi od 5 x 104 do 3 x 108 Da.
Jest jasnożółtym lub białym proszkiem.
W wodzie tworzy roztwór koloidalny o różnej lepkości, zależnie od ilości i stosunku między wiązaniami ą-(1-
6)- Ä…-(1-4)- i Ä…-(1-3)-D-glikozydowymi.
W technologii żywności może być stosowany jako zagęstnik, dzięki któremu można uzyskać półstałą
konsystencję produktów.
Dotychczas dekstran nie jest dopuszczony jako dodatek do żywności (ang. food additive), chociaż
opatentowano wiele możliwości zastosowania dekstranu.
Bakterie zasiedlające jelita człowieka i zwierząt są zdolne do rozkładu dekstranu, co powoduje szybki wzrost
zawartości cukru we krwi oraz glikogenu w wątrobie (niewydalony dekstran jest metabolizowany w
wÄ…trobie do CO2 i wody).
Dekstran jest polecany jako bezpieczny biodegradowalny składnik opakowań dla żywności.
W 1942 r. Szwed Ingelman zaproponował użycie hydrolizatu dekstranu jako zamiennika plazmy krwi.
Obecnie dekstran o masie cząsteczkowej 70 000 i 40 000 jest stosowany w medycynie, zwłaszcza po urazach
chirurgicznych.
Od 1959 r. dekstran jest również używany do produkcji żeli Sephadex, co przyczyniło się do znacznego
postępu w analityce i technikach rozdziału substancji.
Do produkcji dekstranu na skalę przemysłową, w większości krajów, używa się szczepu Leuconostoc
mesenteroides NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512.
Proces biosyntezy dekstranu przebiega w dwóch etapach:
o nagromadzenie enzymu dekstranosacharazy,
o konwersja sacharozy do dekstranu.
Początkowe pH pożywki wynoszące 6,7 - 7,2 w miarę trwania hodowli obniża się do 6,4 - 6,9. Wówczas
obserwuje siÄ™ syntezÄ™ dekstranosacharazy (najintensywniej w pH 6,7).
Konwersja do dekstranu najintensywniej zachodzi przy pH 5,2.
Duże znaczenie ma zawartość sacharozy w podłożu, która powinna być większa od 2%. Dlatego podczas
hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą.
Strona 4
Biosynteza witamin:
·ð witamina B12 (bakterie propionowe: Propionibacterium shermanii i P. freudenreichii)
W procesie biosyntezy witaminy B12 ważny jest dodatek do pożywki soli kobaltowych, niezbędnych dla
syntezy witaminy, chociaż stężenie kobaltu w pożywce przekraczające 50 ppm hamuje biosyntezę
witaminy.
Również dodatek betainy lub choliny stymuluje syntezę witaminy.
W hodowli niektórych drobnoustrojów stosuje się dodatek 5,6-dimetylo-benzoimidazolu, który odgrywa
znaczącą rolę w syntezie witaminy B12 jako jeden z jej prekursorów witaminy.
P. freudenreichi ATCC 6207 i P. shermanii ATCC 13673 sÄ… zdolne do syntezy 5,6-dimetylo-benzoimidazolu
w znacznych ilościach.
Dlatego biosyntezÄ™ witaminy B12 przez te bakterie prowadzi siÄ™ w 2 etapach:
·ð w warunkach beztlenowych prowadzi siÄ™ namnażanie biomasy i synteza kobinoamidu,
·ð w warunkach tlenowych prowadzi siÄ™ syntezÄ™ prekursora i powstanie witaminy B12
o
Hodowle bakterii propionowych prowadzi siÄ™ przez kilka dni w temp. ok. 30 C przy pH na poziomie 6,5 -
7,0.
W celu otrzymania paszowego koncentratu witaminy B12 całość płynu pohodowlanego wraz z bakteriami
propionowymi (witamina B12 jest nagromadzana wewnątrz komórek) suszy się metodą rozpryskową.
Biosynteza enzymów:
·ð Å‚-D-galaktozydaza (LAB z rodzajów Lactococcus, Lactobacillus) - rzadko stosowane !
Produkcja kwasu mlekowego i mleczanów:
o najczęściej z serwatki, melasy, lub podobnych odpadów przemysłowych
o LAB z rodzaju Lactobacillus (badania nad wykorzystaniem Bifidobacterium)
o LAB heterofermentatywne potrafią wykorzystać do tego celu nie tylko proste cukry i dwucukry , ale także
cukry złożone, np. skrobię
Produkcja kwasu propionowego i propionianów:
·ð najczęściej z serwatki, melasy,
·ð LAB z rodzaju Propionibacterium
·ð jednoczeÅ›nie można wytwarzać witaminÄ™ B12 na cele paszowe
Biosynteza związków aromatotwórczych:
·ð zwiÄ…zki karbonylowe (LAB z rodzajów Lactobacillus, Streptococcus, Propionibacterium) -
wykorzystywane podczas fermentacji żywności
Inne wykorzystanie LAB w biotechnologii:
o hodowla szczepów probiotycznych
o kultury starterowe (w tym GMO)
o wykorzystanie LAB w medycynie
Cel modyfikacji genetycznych - przykłady:
o zdolność do metabolizowania galaktozy
o obniżanie poziomu cholesterolu w serum krwi lub ciśnienia tętniczego
LAB w biotechnologii
Obecnie w technologii produkcji kultur starterowych stosuje się selekcję, która umożliwia dobór szczepów
odpornych na bakteriofagi.
Strona 5
Kryteria doboru i selekcji nowych szczepów są następujące:
·ð Mieszanina szczepów
·ð Przesiewanie
·ð Aktywność syntezy danej substancji
·ð Odporność na bakteriofagi i inne czynniki hodowlane
·ð Identyfikacja plazmidów DNA
·ð Badanie zgodnoÅ›ci steroidów
·ð Test na wytwarzanie innych skÅ‚adników
·ð Próbny wyrób produktu
·ð Ocena i klasyfikacja szczepu
Fagi (bakteriofagi)
Są czynnikiem zakłócającym w prowadzeniu biofermentacji i produkcji fermentowanych artykułów
żywnościowych.
Są pasożytami bakterii.
Współzależność między gospodarzem a bakteriofagiem może być dwojaka:
1. Lityczna (wirulentna, zjadliwa) (ang. lytic bacteriophages)
2. Lizogenna (umiarkowana, Å‚agodna) (ang. temperate bacteriophages).
Współzależność lityczna
o adsorpcja faga na powierzchni komórek (tzw. kompetentnych),
o injekcja DNA do komórek,
o cyrkularyzacja fagowego genomu,
o replikacja (synteza) nowych cząstek fagów najczęściej w liczbie 2 - 100 z 1 komórki,
o liza komórek bakteryjnych po około 40 - 50 minutach i uwolnienie fagów.
Istnieje zjawisko specyficzności - określone fagi zjadliwe atakują określone gatunki lub szczepy bakterii.
Stąd wynika korzyść stosowania wielogatunkowych kultur starterowych.
Współzależność lizogenna (utemperowana)
o po wniknięciu do komórki bakterii, DNA faga wbudowuje się do genoforu tej bakterii i podczas
podziałów jest przekazywany (jako profag) do następnych pokoleń.
o komórki bakterii w tym stanie stają się odporne na ataki identycznych lub pokrewnych fagów, ale mogą
być atakowane przez niespokrewnione fagi.
o w pewnych okolicznościach (działanie UV, antybiotyków, środków chemicznych, środowiska,
spontanicznie) następuje uwolnienie DNA fagowego z genoforu bakterii, tworzenie nowych cząsteczek
faga i zachodzi cykl lityczny komórki bakteryjnej.
o bakterie będące nosicielami faga utemperowanego (łagodnego) zostały nazwane lizogennymi,
o większość bakterii stosowanych w przemyśle znajduje się w stanie lizogenności, co może być przyczyną
zakłóceń w produkcji,
o fagi łagodne, po wniknięciu do komórek bakterii, mogą powodować indukcję innych, obecnych
już profagów i lizę komórek.
Uwaga nie dotyczÄ…ca LAB:
Cechą niektórych lizogennych fagów bakterii (ale nie bakterii mlekowych !) jest obecność w ich genomie
genów kodujących toksyny bakteryjne, np. jadu kiełbasianego, toksyny błoniczej, toksyny cholery,
toksyny E.coli O157:H7.
Bakteriofagi rodzaju Lactococcus należą do rzędu Caudovirales. Są to fagi o izometrycznej lub wydłużonej
główce posiadające ogonek.
Bakteriofagi wykazują takie samo zróżnicowanie pod względem kwasów nukleinowych jak wszystkie wirusy:
mogą mieć DNA w postaci dwuniciowej lub jednoniciowej koliście zamkniętej lub liniowej, RNA
Strona 6
jedno- lub dwuniciowy
Około połowa sekwencji genomu bakteryjnego zawiera sekwencje profaga.
Objawy działania fagów
- Stopniowe osłabianie tempa ukwaszania przez kultury podczas prowadzenia fermentacji we właściwej
temperaturze i po przewidzianym czasie.
- całkowite zahamowanie procesu fermentacji, stwierdzane gdy atak fagów był silny.
y
ródła fagów
·ð surowiec i jego mikroflora
·ð podÅ‚oże, np. mleko, serwatka (i pozostawione resztki)
·ð kurz z powietrza
·ð nie wydezynfekowane urzÄ…dzenia
·ð szczepy lizogenne w szczepionkach
Mechanizmy obrony LAB przed atakiem fagów (najczęściej kodowane na plazmidach):
o zapobieganie wnikaniu faga do komórki  przez maskowanie lub usunięcie z powierzchni komórki
specyficznych białek rozpoznawanych przez faga,
o rozbudowanie systemu enzymów modyfikujących bakteryjne DNA w ten sposób, że jest ono rozróżnialne
od fagowego DNA, które, po wykryciu, jest niszczone enzymami restrykcyjnymi,
o zahamowanie infekcji już po wniknięciu faga do komórki bakteryjnej przez wyrzucenie faga.
Metody zwalczania fagów
- Selekcjonowanie szczepów opornych na fagi ( inżynieria genetyczna)
- Stosowanie metod chemicznych dezynfekujących: do aparatury i pomieszczeń, hodowla lub namnażanie
starterów w podłożach bezwapniowych (antyfagowych)
- Stosowanie metod fizycznych: wyjaławianie aparatury i pomieszczeń (UV, termicznie), filtrowane
powietrze w pomieszczeniach, aseptyczne urządzenia do hodowli, kultury starterowe do bezpośredniego
zaszczepiania surowca (tzw. DVS)
- Stosowanie metod biologicznych: rotacja starterów jednoszczepowych co 2 - 3 dni, stosowanie
starterów wieloszczepowych i wielogatunkowych i ich rotacja na inne, o innej wrażliwości na fagi (np.
co 14 dni)
Strona 7