Å›ð Alergen
Å›ð Alergen główny
Å›ð Ekstrakt alergenowy
Å›ð Szczepionka alergenowa
Å›ð Desensytyzacja
Celem standaryzacji jest jednoczesne utrzymanie
składu i mocy wyciągów na stałym poziomie
Standaryzacja wyciągów alergenowych obejmuje:
Å›ð pomiar mocy wyciÄ…gu
Å›ð przyporzÄ…dkowanie wyciÄ…gowi jednostek
standaryzacyjnych
Å›ð identyfikacjÄ™ i charakteryzacjÄ™ materiaÅ‚u z
ródłowego
Obejmuje metody in vivo i in vitro.
Do metod in vivo należą: punktowe testy skórne oraz
testy śródskórne
Zaś do metod in vitro należą: blokowanie RAST, test
uwalniania histaminy, test ELISA, ocena aktywności
enzymatycznej
Test RAST (radioalergosorpcji) służy do pomiaru stężenia przeciwciał
klasy IgE reagujących z określonym alergenem.
Blokowanie tego testu opiera się na współzawodnictwie o przeciwciało
zawarte w surowicy między antygenem w ekstrakcie i alergenem
związanym z fazą stałą np. krążkiem celulozowym.
Im mniej przeciwciał zwiąże się z fazą stałą, tym wyciąg alergenowy
jest mocniejszy.
W celu określenia mocy ekstraktu, używa się średnich
wartości z rozcieńczeń jednostkowych dotyczących
poszczególnych grup.
Średnie te wyliczane są dla całej badanej grupy.
Im dany wyciąg jest słabszy, tym niższe jego rozcieńczenie
daje ten sam efekt biologiczny co najwyższe
rozcieńczenie w przypadku najmocniejszego wyciągu.
1. Metoda Noona 
przyporządkowanie 1 gramowi pyłku traw 1 milion
jednostek Noona
2. Metoda wagowo/objętościowa 
określenie stosunku wagi materiału wyjściowego do
objętości płynu służącego do sporządzenia wyciągu
3. Metoda oceny azotu białkowego 
ocenienie wyciÄ…gu alergenowego na podstawie
ilościowego pomiaru zawartości wszystkich białek
występujących w roztworze
Standaryzacja alergenów
System Nordycki System Amerykański
BU/ml BAU/ml
biological unit bioequivalent allergy unit
Å›ð elektroforeza noÅ›nikowa (SDS-PAGE)
Å›ð ogniskowanie izoelektryczne (IEF)
Å›ð immunoelektroforeza (CIE)
Å›ð Western Blotting
Å›ð Potraktowanie czÄ…steczki biaÅ‚ka przez SDS skutkuje
powstaniem kompleksów białko - SDS o ustalonym stosunku
Å‚adunku elektrycznego do masy
Å›ð 1 g biaÅ‚ka wiąże 1,4 g SDS
Å›ð W takim kompleksie SDS skutecznie maskuje oryginalny
ładunek białka  białko uzyskuje ładunek ujemny
Å›ð SDS-PAGE pozwala na Å‚atwe i dokÅ‚adne oznaczenie Mcz
rozdzielonych białek
Obecność SDS przynosi szereg korzyści:
Å›ð zdecydowana wiÄ™kszość biaÅ‚ek jest rozpuszczalna w
elektrolitach zawierajÄ…cych SDS
Å›ð separacja biaÅ‚ek odbywa siÄ™ zgodnie z ich Mcz
Å›ð barwienie kompleksów biaÅ‚ko- SDS jest znacznie
wydajniejsze niż samego białka
Å›ð Obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatycznÄ…
degradację białek w trakcie separacji
Å›ð umożliwia rozdziaÅ‚ biaÅ‚ek w gradiencie pH
utworzonym w porowatym nośniku
Å›ð podczas ogniskowania, polipeptydy wÄ™drujÄ… pod
wpływem przyłożonego napięcia do miejsca w żelu
gdzie pH = ich pI
Å›ð odbywa siÄ™ w noÅ›niku, w którym wartość pH buforu
zmienia się w sposób ciągły od wartości najwyższej
przy katodzie do najniższej przy anodzie
Å›ð gradient pH tworzy mieszanina syntetycznych
niskocząsteczkowych związków alifatycznych
zwanych amfolitami
Å›ð WykazujÄ… przewodnictwo elektryczne
Å›ð wykazujÄ… bardzo dużą pojemność buforowÄ…
Å›ð nie sÄ… toksyczne dla biaÅ‚ek
Å›ð nie wykazujÄ… absorpcji przy =280 nm
Å›ð można je Å‚atwo oddzielić od preparatu biaÅ‚ka
Å›ð Opiera siÄ™ na zjawisku precypitacji kompleksów
antygen  przeciwciało i pozwala na detekcję
obecności antygenu oraz określenie ilości
antygenu w próbce
Å›ð JednÄ… z jej odmian jest elektroforeza rakietkowa
Å›ð Prowadzona jest w noÅ›niku wysyconym
przeciwciałem w warunkach pH= pI przeciwciała
Å›ð W kierunku od katody do anody elektroforetycznie
migruje próbka zawierająca antygen
Å›ð W miejscu kontaktu antygen  przeciwciaÅ‚o dochodzi
do precypitacji kompleksów  widocznych jako
charakterystyczne linie o kształcie startującej
rakiety
Jeśli całkowita ilość alergenów głównych jest znana wówczas
na drodze porównania wysokości względnych rakietek
możliwe jest półilościowe zmierzenie zawartości jednego lub
większej ilości alergenów głównych
Å›ð Metoda sÅ‚użąca do wykrywania okreÅ›lonych biaÅ‚ek
Å›ð Rozdziela zdenaturowane biaÅ‚ka wedÅ‚ug ich mas
oraz natywne według ich struktury 3D
Å›ð NastÄ™pnie biaÅ‚ka sÄ… przenoszone na membranÄ™
nitrocelulozowÄ… (lub PVDF)
Å›ð Obecność okreÅ›lonych biaÅ‚ek jest sprawdzana za
pomocą barwników lub przeciwciał przyłączających
się do ich epitopów.
Å›ð PowstajÄ… w wyniku modyfikacji chemicznej alergenu, w
której znaczna część epitopów wiążących przeciwciała nie jest
już rozpoznawana
Å›ð Uzyskuje siÄ™ je w wyniku np. polimeryzowania alergenu pod
wpływem formaldehydu, aldehydu glutarowego, formaliny lub
ciepła jako czynnika fizycznego
ALERGOIDY
Alergoidy wysokomolekularne Alergoidy niskoczÄ…steczkowe
Mcz> 100 kDa Mcz ~ 30 kDa
Å›ð Alergoidy sÅ‚abo reagujÄ… z przeciwciaÅ‚ami IgE i nie indukujÄ…
reakcji IgE zależnych
Å›ð Jest natomiast zachowana immunogenność preparatu
Å›ð Wykazano korzystne zmiany w wytwarzaniu cytokin (IL-10 i
IFN-Å‚) przez limfocyty Th w trakcie immunoterapii alergoidem
Zmniejszona reaktywność alergenowa tych szczepionek
wpływa na:
Å›ð skuteczność i bezpieczeÅ„stwo jej stosowania
Å›ð szybkość osiÄ…gania maksymalnej dawki
Å›ð komfort i dobrÄ… współpracÄ™ lekarza z pacjentem
Wadą natomiast jest to, iż:
Å›ð alergoidy nie mogÄ… być prezentowane przez wiÄ™kszość
komórek prezentujących antygen,
Å›ð proces ich produkcji może doprowadzić do usuniÄ™cia
epitopów dla limfocytów T, co skutkuje zmniejszoną
aktywnością immunologiczną
SÄ… syntetyzowane przez obcy organizm,
wykorzystujÄ…cy wprowadzonÄ… zewnÄ…trz
informacjÄ… genetycznÄ…
1. Z materiału macierzystego alergenu izoluje się
kodujÄ…ce go fragmenty DNA lub RNA
2. Tak przygotowany gen wprowadza się do komórki
np. bakterii, drożdży, owadów, ssaków za pomocą
plazmidów, bakteriofagów
Metoda ta pozwala na uzyskiwanie nieograniczonej
ilości czystej substancji.
Można w ten sposób uzyskiwać potrzebne
przeciwciała, alergeny, cytokiny, hormony
Zastosowanie alergenów rekombinowanych i ich
pochodnych pozwala:
Å›ð Wyeliminować biaÅ‚ka niealergenowe
Å›ð Zmniejszyć ryzyko wprowadzenia alergenów z innych z
ródeł
Å›ð Zmniejszyć ryzyko wprowadzenia materiaÅ‚u infekcyjnego z
materiału wyjściowego do ekstrakcji
Å›ð Zapewnić wiarygodnÄ… standaryzacjÄ™ szczepionek
Å›ð ZwiÄ™kszyć bezpieczeÅ„stwo leczenia odczulajÄ…cego
Metodami służącymi w tworzeniu zrekombinowanych
mogą być:
Å›ð metoda sÅ‚użąca do oddzielenia dzikich alergenów od
innych fragmentów wyciągu a następnie użycie tych
fragmentów jako indywidualnych cząstek
modyfikujÄ…cych odpowiedz
immunologicznÄ… albo
wykorzystywanie ich do fuzji w celu generowania
nowej molekuły
Å›ð Ukierunkowana mutageneza prowadzÄ…ca do
sztucznego wywołania mutacji w ściśle
określonym miejscu genomu
Adiuwant ma za zadanie
wzmacniać proces
immunizacji a
jednocześnie być
bezpieczny.
Jego zadanie polega na:
Å›ð Prezentacji antygenu, co prowadzi do wzrostu iloÅ›ci
przeciwciał blokujących, wzrostu syntezy IL-1, IL-4, IL-
10, IL-12, INF-Å‚, TNF-Ä…, GM-CSF, hamowanie
aktywności limfocytów Th2 i eozynofilów
Å›ð Przyczynić siÄ™ stworzenia antygenu o przedÅ‚użonym
działaniu w miejscu szczepienia i powolnym jego
uwalnianiu
Å›ð DziaÅ‚aniu noÅ›nikowemu
Å›ð DziaÅ‚aniu immunostymulujÄ…cemu
Å›ð DziaÅ‚aniu modulujÄ…cemu przez stymulacjÄ™ subpopulacji
Th1
Obecnie w charakterze adiuwantów wykorzystywane są:
Å›ð Monofosforylowany lipid A (MPL-A)
Å›ð IL-12
Å›ð IL-18
Å›ð ImmunostymulujÄ…ce oligosacharydy z niemetylowanymi CpG
Å›ð zabite poprzez ogrzewanie bakterie Listeria monocytogenes
Å›ð Zabite poprzez ogrzewanie bakterie Lactobacillus platnarum
Jednak najczęściej stosowane są:
Å›ð Sole glinu
Å›ð L-tyrozyna
Å›ð Sole wapnia