Inżynieria
genetyczna
Inżynieria genetyczna&
& polega, na bezpośredniej ingerencji w
DNA w celu zmiany właściwości
dziedzicznych organizmu na pożądane
dla człowieka.
Polega na wprowadzaniu do komórek
organizmu, którego cechy chcemy zmienić
(biorcy), określonego odcinka DNA innego
organizmu (dawcy).
Inżynieria genetyczna
Jest to technika genetyczna łączenia,
(czyli rekombinacji) poza org. biorcy
fragmentów DNA (kwasu
deoksyrybonukleinowego) pochodzących
z różnych organizmów i następnie
wprowadzania ich do bakterii lub innych
komórek.
Inżynieria genetyczna
Inżynieria genetyczna to bezpośrednie
manipulacje materiałem genetycznym dla celów
gospodarczych, lekarskich lub naukowych.
Stanowi jedną z dziedzin BIOTECHNOLOGII.
BIOTECHNOLOGIA - to celowe działania
zmierzające do uzyskania użytecznych
organizmów lub pochodzących z nich
produktów.
Transformacja
Pierwszymi manipulacjami materiałem genetycznym były
transformacje bakteryjne (doświadczenie Griffith a).
W 1927 roku brytyjski lekarz Fred Griffith przeprowadził
doświadczenie, w którym wykazał, że organizmy mogą
przekazywać sobie pewne cechy. Griffith wstrzyknął myszom
żywe bakterie należące do nieszkodliwego szczepu dwoinki
zapalenia płuc razem z zabitymi bakteriami ze szczepu zjadliwego
(wywołującego chorobę). Myszy zachorowały. Oznaczało to, że
cecha zjadliwości została przekazana pomiędzy szczepami
martwych i żywych bakterii. Co więcej: nabyta cecha utrzymywała
się w kolejnych pokoleniach bakterii.
Transformacja jest procesem włączenia do genomu komórki
obcego DNA
 Doświadczenia Griffitha powtórzył
kanadyjski lekarz Oswald Avery. Avery z
zespołem współpracowników
udowodnił, że to właśnie DNA jest
odpowiedzialny za zmianę
(transformację) bakterii. W 1943 roku
Avery ogłosił wyniki swoich wieloletnich
prac. Transformację bakterii udało się
przeprowadzić in vitro, do hodowli
niezjadliwych bakterii dodawano wyciąg z
bakterii zjadliwych.
 Komórki bakterii zjadliwych wytwarzają otoczkę z
wielocukrów, bakterie niezjadliwe nie wytwarzają otoczki. Po
transformacji wyciągiem z bakterii chorobotwórczych bakterie
niezjadliwe zaczęły wytwarzać otoczki i stały się zjadliwe.
Avery poddawał wyciąg z bakterii zjadliwych działaniu różnych
enzymów i sprawdzał, czy nadal zachowuje zdolność do
transformowania. Enzymy trawiące białka (enzymy
proteolityczne) nie zmieniły właściwości wyciągu - nadal
następowała transformacja. Oznaczało to, że białka, wbrew
temu co wówczas sądzono nie są czynnikiem
transformującym, odpowiedzialnym za przekazanie informacji.
Dopiero potraktowanie wyciągu enzymem rozkładającym DNA
(deoksyrybonukleazą) zniszczyło zdolność do transformacji.
W kolejnych doświadczeniach Avery'emu udało się
wyizolować i oczyścić wielkocząsteczkowy DNA i wykazać, że
tylko DNA może transformować bakterie. Był to pierwszy
bezpośredni dowód na to, że DNA może zmienić
informację genetyczną komórki.
Obecnie transformacją nazywa się
wprowadzenie DNA do komórek wszelkich
organizmów za pomocą różnych metod jak
na przykład:
za pomocą wektorów pochodzenia
plazmidowego bądz
wirusowego (transdukcja),
przez traktowanie sklonowanymi genami
komórek pozbawionych błon,
przez wstrzykiwanie DNA mikropipetami wprost
do jąder lub wstrzeliwanie do komórek
preparatów DNA na powierzchni cząsteczek
złota czy też innych metali
Inżynieria genetyczna&
& ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu
zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega ona na
wprowadzaniu do komórek organizmu, którego cechy
chcemy zmienić (biorcy), określonego odcinka DNA
innego organizmu (dawcy).
Inżynieria genetyczna polega na:
izolowaniu fragmentów materiału genetycznego z
komórki,
wprowadzeniu zmian do informacji genetycznej,
przenoszeniu fragmentów DNA do komórek innego
organizmu,
powielaniu (klonowaniu) genów i całych organizmów.
zrekombinowane
(trawienie ligacja (poł. fragmentu
DNA dawcy
DNA
restryktazą) DNA dawcy i wektora)-
komórka
DNA (trawienie
biorcy
wektora- restryktazą)
transformacja
zmieniona komórka
biorcy
Odpowiednie fragmenty DNA wycina się z DNA dawcy za pomocą
enzymów restrykcyjnych. Następnie tak wydzielone fragmenty DNA
wprowadza się do komórek biorcy za pomocą specjalnych
przenośników (wektorów). W tej roli wykorzystywane są m.in. wirusy i
plazmidy. Wprowadzone do komórki biorcy wraz z przyłączonym
fragmentem DNA dawcy umożliwiają namnażanie się w niej genów
zawartych w tym DNA.
Transformacja bakterii:
DNA wprowadza do
komórki nową
informację genetyczną
Znalezienie genu wymaga&
& pofragmentowania DNA dawcy za pomocą
enzymów restrykcyjnych (restryktaz)
RESTRYKTAZY pełnią funkcję inteligentnych
nożyczek molekularnych, rozpoznających i
dokonujących cięć jedynie w obszarach DNA o
specyficznej sekwencji nukleotydów.
Każdy rodzaj restryktaz rozpoznaje tylko jeden
rodzaj obszarów DNA o stałej długości i
sekwencji zasad. Daje to możliwość
powtarzalnego pofragmentowania DNA.
sekwencja palindromowa
LK
miejsce działania restryktazy
* * * * * G A A T T C * * * *
* * * * * C T T A A G * * * *
lepkie jednoniciowe końce podwójnej
LK
helisy DNA powstałe po przecięciu jej
LK
przez specyficzny białkowy enzym
restrykcyjny (tu AATT)
Przykład sekwencji
nukleotydów rozpoznawalnej i
linia przecięcia cząsteczki DNA
nacinanej przez konkretny
enzym restrykcyjny
rozpoznawana przez ten enzym
A A T T
sekwencja nukleotydów
Przeniesienie i wprowadzenie wyizolowanego
genu dawcy do DNA biorcy = transdukcja -
wymaga odpowiedniego wektora.
Wektor to coś w rodzaju opakowania (nośnika) umożliwiającego
przenoszenie fragmentu DNA z jednej komórki do drugiej.
Przenoszony fragment łączy się na czas przeniesienia z DNA
wektora.
Wektorem mogą być:
- plazmidy - pozachromosomalne fragmenty DNA komórek
bakteryjnych, zdolne do niezależnej od chromosomu bakteryjnego
replikacji przekazywania swoich genów innym komórkom;
- bakteriofagi - wirusy bakteryjne, których DNA integruje się z
genomem gospodarza co daje, podobnie jak w przypadku
plazmidów, możliwość włączenia przenoszonego przez nie DNA do
genomu gospodarza.
Mechanizm transdukcji
przecięcie DNA wektora przez ten sam enzym
restrykcyjny, który dokonał fragmentacji
włączanego odcinka DNA;
połączenie się lepkimi końcami przeciętego
wirusa z przenoszonym fragmentem DNA dawcy
za pomocą enzymu ligazy - powstaje kompleks
wektor-fragment DNA.
 Restryktazy tnąc na fragmenty DNA zostawiają tzw.
końce lepkie - jednoniciowe, komplementarne odcinki
liczące kilka nukleotydów.
Te końce, jeśli działamy tą samą restryktazą są zawsze
identyczne i lepkie, co znaczy, że będą się łączyły z
identycznymi końcami cząsteczek DNA
wyprodukowanymi przez ten sam enzym.
Jeżeli podziałamy tą samą restryktazą na dwie różne
cząsteczki DNA, to otrzymamy fragmenty, które będą
miały identyczne lepkie końce
Lepkie końce umożliwiają, więc w praktyce łączenie się
fragmentów DNA pochodzących z różnych organizmów
LK
* * * * * G A A T T C * * * *
* * * * * C T T A A G * * * *
LK
Rozdzielenie fragmentów DNA o różnej
wielkości:
1. za pomocą bakterii
- mieszamy wektory z przyłączonym DNA z
odpowiednio spreparowanymi bakteriami;
- mieszaninę tą wysiewa się na pożywkę;
- każda kolonia, która wyrośnie będzie zawierała
jeden wektor wraz z kawałkiem
przenoszonego DNA w wyniku procesu
transformacji;
- pożywka jest tak dobrana, że zawiera
antybiotyk, na którym nie wyrośnie bakteria
bez wektora, a to dla tego, że wektor niesie
gen powodujący odporność na ten antybiotyk.
Rozdzielenie fragmentów DNA o
różnej wielkości:
2. Elektorofeza
- rozdzielanie fragmentów DNA o różnej
wielkości w żelu za pomocą pola
elektrycznego
Umieszczenia genu we właściwym
rejonie DNA biorcy = transformacja
Wprowadzone do komórki biorcy wraz z przyłączonym
fragmentem DNA dawcy wektory, umożliwiają
namnażanie się w niej genów zawartych w tym DNA.
Umieszczenie genów we właściwym rejonie DNA biorcy
jest największym problemem inżynierii genetycznej i do
dziś nie opanowano do końca metody umieszczania
genu w konkretnym miejscu.
Prowadzi to często do efektów ubocznych takich jak
wyłączenie innego genu (przez przypadkowe wstawienie
nowego genu w środek innego).
Obecnie jedyną metodą jest więc wykonywanie wielu
prób i selekcjonowanie tych komórek, które wykazują
komplet pożądanych cech.
DNA wektora
a określony gen dawcy
DNA dawcy
(plazmid)
fragment DNA z lepkimi
b
a
końcami
przecięcie enzymem lepkie końce
restrykcyjnym
b b
łączenie fragmentów
z lepkimi końcami
połączony DNA
namnażanie bakterii
wektora i dawcy
na odpowiednich
wnikanie wektora do
pożywkach
kom. biorcy
zmieniona
genetycznie
kom. biorcy
Przykłady inżynierii genetycznej
Co można zrobić z wyizolowanym
genem?
Zanalizować sekwencje jego nukleotydów;
Wprowadzić w nim zmiany;
Wprowadzić gen zmieniony do
wyjściowego organizmu;
Zbadać fenotypowy efekt wprowadzonej
zmiany (mutacji genu).
Wprowadzenie wyizolowanego genu lub genów
do jakiegoś organizmu prowadzi do powstania
organizmu transgenicznego
Organizmy transgeniczne to rośliny bądz
zwierzęta
zawierające w swych komórkach włączony do
chromosomów gen obcego organizmu.
Transgeniczne organizmy otrzymuje się metodami
inżynierii genetycznej, np. do jednego z jąder
dwujądrowej zygoty myszy lub innego ssaka (w hodowli
in vitro) przez mikroinjekcję wprowadza się obcy,
poprzednio sklonowany gen np. gen hormonu wzrostu
szczura; następnie zygotę taką wprowadza się do
macicy zastępczej matki, w której następuje jej dalszy
rozwój; wyrasta mysz o nadnaturalnie dużych
rozmiarach.
Organizmy transgeniczne
U roślin najczęściej wprowadza się obcy gen za
pomocą wektora plazmidowego z bakterii i z
transformowanej komórki regeneruje się całą
roślinę.
Transgeniczne organizmy mogą mieć duże
znaczenie hodowlane - mrozoodporność,
odporność na szkodniki, możliwość
przechowywania a wszystko przy zachowaniu
wartości odżywczych np. transgeniczna bawełna
z poliestrem, pomidory o przedłużonej trwałości,
tytoń odporny na herbicydy.
Organizmy transgeniczne&
& zaliczamy do grupy organizmów zmodyfikowanych
genetycznie w skrócie GMO (ang. genetically modified
organisms) czyli organizmów, których geny zostały
celowo zmienione przez człowieka.
Modyfikacje, jakim podlegają organizmy można
podzielić na trzy grupy:
- zmieniona zostaje aktywność genów naturalnie
występujących w danym organizmie;
- do organizmu wprowadzone zostają dodatkowe kopie
jego własnych genów.
 Klonowanie to proces tworzenia organizmów mających
taką samą informację genetyczną jak dawca.
Klonowanie organizmów oznacza procedurę
otrzymywania organizmów o takiej samej informacji
genetycznej, z reguły poprzez procedurę transferu jądra z
komórki somatycznej do komórki jajowej pozbawionej
uprzednio jądra. W przypadku klonowania roślin stosuje się
procedurę odróżnicowania komórek dawcy do komórek
merystematycznych.
Klonowanie genów - w genetyce i biologii molekularnej
proces wyosobniania genu. Polega na łączeniu fragmentów
materiału genetycznego z wektorem molekularnym i ich
namnażaniu w innym organizmie. Otrzymuje się w ten
sposób wiele kopii tego samego genu. Termin klonowanie
genów odnosi się też do identyfikacji genów poprzez
wykorzystanie procedury klonowania genów. Jeśli
pojedynczy fragment genomu jest przenoszony z jednego
wektora do drugiego, taki proces określa się mianem
subklonowania.
Klonowanie całych organizmów:
pobranie komórki jajowej samicy ssaka;
usunięcie z jądra tej komórki jej materiału
genetycznego  DNA;
wprowadzenie jądra komórki somatycznej
pochodzącej z organizmu, który ma zostać
klonowany;
wprowadzenie manipulowanej komórki jajowej
do macicy ssaka, którego klonujemy;
po okresie ciąży przychodzi na świat osobnik,
który jest genetyczną kopią osobnika, z którego
komórek pobrano DNA.
Dolly  pierwszy sklonowany ssak  1997 rok
Plusy i minusy inżynierii
genetycznej:
+ badania porównawcze DNA w medycynie sądowej
+ możliwość i zalety posiadania w przyszłości przez każdego człowieka
paszportu genetycznego
- moralne aspekty problemu klonowania człowieka - obawy o granice
zmieniania natury
+ nadzieja na poprawę stanu środowiska naturalnego; np. zmienione
genetycznie bakterie i grzyby zdolne są do rozkładania stałego szeregu
zanieczyszczeń zawierających siarkę, ropę naftową a nawet niektóre
tworzywa sztuczne
+ organizmy transgeniczne uzyskują właściwości niemożliwe do otrzymania
innymi metodami
+ atrakcyjność pomysłu zmuszenia np. krów do produkowania mleka z
leczniczymi białkami
- stosunek ludzi do wykorzystywania zwierząt i klasyczne metody ich
krzyżowania ograniczają możliwości i potrzebę ich klonowania i tworzenia
organizmów transgenicznych
- moralne i etyczne aspekty wykorzystywania zmienionych metodami
genetycznymi zwierząt do przeszczepów międzygatunkowych
- problemy w stosowaniu inżynierii genetycznej wynikają z używania cząstek
infekcyjnych. Używane do przenoszenia DNA wektory to bakteriofagi i
plazmidy - muszą być one trwale rozbrojone. Nikt przecież nie chce aby
używany jako wektor wirus przypadkiem lub w wyniku błędu człowieka, mógł
zrealizować swój życiowy plan
+ możliwość uzyskiwania substancji brakujących i niezbędnych w wyniku
klonowania pojedynczych genów np. uzyskanie insuliny produkowanej przez
genetycznie zmieniony szczep bakterii E. coli, bakterie te mogą po modyfikacji
produkować leki przeciwzakrzepowe - zmienione genetycznie drożdże
produkują szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B (+)
+ rozwój szczepień ochronnych, farmakogenetyka
- obawa przed skutkami eksperymentów genetycznych (np. choroby u Dolly)
+ zapobieganie niedożywieniu w trzecim świecie
+ badania prenatalne
+ poznanie mechanizmu wielu chorób - diagnostyka genetyczna przy
pomocy sąd genetycznych czyli znakowanych radioaktywnie odcinków DNA
pozwala na wczesne wykrycie takich chorób jak fenyloketonuria i anemia
sierpowata
- obawy przy stosowaniu żywności genetycznie zmodyfikowanej
+ terapia genowa czyli zastępowanie genów wadliwych niezmutowanymi
(substytucja), naprawa uszkodzonych genów - nadzieja na przyszłość- dla
wielu chorych
- groz
ba, że w trakcie naprawy lub wstawiania nowych genów istnieje
możliwość wstawienia ich w niewłaściwe miejsce chromosomu co może
spowodować unieczynnienie innego genu i pojawienie się szeregu
negatywnych skutków