11. Populacje i subpopulacje limfocytów

- różnicowanie na podstawie cz.CD i profilu cytokin

Limfocyty B

- receptory BCR

- cz.MHC klasy I i II

- CD19, CD20, CD21 (CR2), CD22, CD23, CD35 (CR1)

- CD32 (FcγRII)

- CD80, CD86

- w przebiegu odpowiedzi immunologicznej LimB różnicują się w ośrodkach rozmnażania obwodowych narządów limfatycznych w komórki plazmatyczne i komórki pamięci

- można je podzielić na LimB1 i przeważające liczbowo LimB2

- LimB1 podobnie do limfocytów usytuowanych w strefie brzeżnej śledziony uczestniczą w odpowiedzi na tak zwane antygeny grasiczoniezależne

- u dorosłego człowieka LimB1 stanowią około 20% LimB krwi obwodowej i śledziony, ale mogą przeważać wśród LimB śledziony płodowej i krwi pępowinowej

- LimB1 wytwarzają głównie określone przeciwciała klasy IgM

- w trakcie dojrzewania i rekombinacji genów immunoglobulinowych wykorzystują tylko ograniczony zakres segmentów genów V i wykazują ograniczoną zmienność na złączach

- ich geny immunoglobulinowe nie podlegają hipermutacji

- wytwarzane przez nie przeciwciała charakteryzują się małym powinowactwem do antygenów, są za to wielospecyficzne (wiążą się też z komórkami własnymi)

- wytwarzane prze LimB1 autoprzeciwciała niekoniecznie jednak muszą być szkodliwe, uczestniczące w autoagresji Ig należą zazwyczaj bowiem do klasy IgG

- LimB1 uczestniczą głównie w odpowiedzi pierwotnej

- wytwarzane prze nie przeciwciała (nie pobudzone LimB antygenem) należą do pierwszej linii obrony przeciw mikroorganizmom

- LimB1 nie różnicują się w komórki pamięci!

- stanowią pomost między odpornością swoistą i nieswoistą

- LimB2 - standardowe działanie

- subpopulacje wytwarzające TGF-β i Il-10 określane są jako LimBreg (regulatorowe)

Limfocyty T

- receptor TCR

- cz.MHC klasy I

- CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8,

- CD28 i CD154 (ligand dla CD40)

- tradycyjnie dzieli się je na: pomocnicze LimTh, cytotoksyczne LimTc, regulatorowe LimTreg

- w zależności od różnic w budowie receptor można je również podzielić na LimTαβ i LimTγδ

- w trakcie prezentowania antygenu, CD4 łączy się z cz.MHC II, a CD8 z cz.MHC I

- LimTh mają najczęściej CD4

- LimTc mają najczęściej CD8

- stosunek limfocytów CD4+ do CD8+ we krwi u zdrowego człowieka powinien wynosić 1,3

- niewielki odsetek dojrzałych limfocytów T z receptorem TCRαβ nie ma cząsteczek CD4 czy CD8, mogą one rozpoznawać antygeny prezentowane przez cz.CD1 i pod wieloma względami przypominają limfocyty z receptorem TCRγδ

Subpopulacje limfocytów T pomocniczych (LimTh)

- wspomagają odpowiedź typu komórkowego i humoralnego, zarówno przez bezpośredni kontakt jak i przez wydzielane cytokiny

- ułatwiają aktywację, proliferację i różnicowanie LimB, prekursorów LimTc a także pobudzają makrofagi

- mają na swej powierzchni CD4 i rozpoznają antygen prezentowany w połączeniu z cz.MHC II

- obejmują subpopulacje różniące się pod względem czynnościowym LimTh1 i LimTh2

- LimTh1 wzmacniają odpowiedź typu komórkowego, aktywują makrofagi i LimTc, pobudzają wytwarzanie przeciwciał IgG1 i IgG3 aktywujących dopełniacz i najskuteczniej pośredniczących w immunofagocytozie

- LimTh2 pobudzają wytwarzanie przeciwciał IgA,IgG4, IgE i stymulują odpowiedź na poziomie błon śluzowo-surowiczych oraz wzrost i różnicowanie komórek tucznych i eozynofilów, a tym samym rozwój reakcji alergicznych

	Th1	Th2
odpowiedź humoralna wytwarzanie eozynofilów odpowiedź komórkowa i nadwrażliwość typu późnego aktywacja makrofagów efekty szkodliwe efekty pożyteczne profil cytokin Il-2 Il-3 Il-4 Il-5 Il-6 Il-9 Il-10 Il-13 Il-21 INF-gamma Limfotoksyna alfa GM-CSF pomoc LimB zdolność do aktywacji makrofagów rola w powstawaniu eozynofilów i komórek tucznych	+ - ++ ++ w reumatoidalnym zap.stawóww nadwrażliwości typu I + + - - - - - - + + + + + + -	++ + - - w nadwrażliwości typu I w odpowiedzi przeciw bakteriom - + + + + + + + ++ - - + ++ - ++

- LimTh1 wytwarzają Il-2 (stymulującą cytotoksyczność limfocytów) oraz INF-γ (aktywujący makrofagi) i mają wybitny udział we wspomaganiu odpowiedzi typu komórkowego, pod względem profilu wydzielanych cytokin przypominają LimTc

- LimTh2 wytwarzają Il-4, -5, -10 i -13 będące czynnikami wzrostu i różnicowania LimB i wspomagają głównie odpowiedź humoralną

- antagonizm odpowiedzi immunologicznej, optymalnemu rozwojowi odpowiedzi typu komórkowego towarzyszy na ogół brak odpowiedzi typu humoralnego i na odwrót

- LimTh1 wydzielają INF-γ który hamuje proliferację i czynność LimTh2

- LimTh2 uwalniają Il-10, która hamuje wytwarzanie cytokin przez komórki dendrytyczne, makrofagi i LimTh1 (LimTh2 również)

- dewiacja immunologiczna/rozdwojona tolerancja - intensywna aktywacja LimTh2 i odpowiedź humoralna, która zapobiega rozwojowi odpowiedzi komórkowej, lub rzadziej intensywna aktywacja LimTh1 i odpowiedź komórkowa interferująca z odpowiedzią humoralną

- za rozwój chorób autoimmunizacyjnych z odpowiedzią komórkową odpowiadają Th1, natomiast za rozwój chorób wywołanych głównie przez przeciwciała odpowiadają Th2

- LimTh17 - profil cytokin: Il-17, Il-6, TNF, GM-CSF

- LimTh0 - Il-2, Il-3, Il-4, Il-5, Il-10, IFN-γ, GM-CSF

- do proliferacji, różnicowania się I migracji obydwu subpopulacji LimT (Th1, Th2) ważne są sygnały przekazywane przez obecne na nich cząsteczki CD28 i OX40, których ligandami są odpowiednio cząsteczki CD80/CD86 i OX40L na komórkach prezentujących antygen

- Il-12, -18, -23, -27 i INF-γ i INF-α wydają się kostymulatorami i czynnikami różnicowania LimTh1

- Il-4 jest autokrynowym czynnikiem wzrostu i różnicowania LimTh2

- w początkowym okresie rozwoju LimTh1 mogą pod wpływem Il-4 przejść w LimTh2, a LimTh2 stymulowane przez Il-12 i przy braku Il-4 mogą przekształcić się w LimTh1

Subpopulacje limfocytów T regulatorowych (LimTreg)

- markery charakterystyczne: CD4, CTLA-4, Il-2R, GITR, Foxp3

- zabezpieczenie przed autoreaktywnością - delecja autoreaktywnych LimT w grasicy i LimB w szpiku

- kolejnym zabezpieczeniem LimT którym udało się opuścić grasicę jest stan anergii (dziewiczy LimT rozpoznaje antygen na komórkach prezentujących ale nie otrzymuje kostymulacji)

- oraz zabezpieczenia czynne - aktywność limfocytów Treg

- najistotniejsze procesy w których uczestniczą LimTreg (zarówno korzystne jak i niekorzystne):

• hamowanie aktywności autoreaktywnych limfocytów T, zabezpieczenie przed autoagresją

• tolerancja na antygeny podane doustnie, czyli tak zwana tolerancja pokarmowa

• tolerancja na tak zwane zmienione ligandy peptydowe czyli zmienione antygeny nabierające cech antagonistów

• rozwijająca się u pacjentów tolerancja na antygeny związane z nowotworem

• tolerancja na przeszczepy allogeniczne, czyli tolerancja transplantacyjna (w niektórych sytuacjach)

• blokowanie eliminacji mikroorganizmów co sprzyja infekcji, ale również podtrzymuje aktywność limfocytów pamięci

• hamowanie nadmiernej, uszkadzającej tkanki odpowiedzi przeciwzakaźnej i reakcji nadwrażliwości

• ochrona płodu przed odrzuceniem przez układ odpornościowy matki

- najważniejsze subpopulacje LimTreg:

• limfocyty T CD4+CD25+ Foxp3+ - rozwijające się już w grasicy i znane jako naturalne Treg, których przeżycie i czynność zależą od Il-2

• limfocyty Tr1 - które wydzielają głównie Il-10 i TGF-β

• limfocyty Th3 - które wytwarzają głównie związany z błoną TGF-β

- dwie ostatnie populacje określane jako indukowane regulatorowe LimT

- niektóre limfocyty Treg mogą indukować powstawanie innych regulatorowych limfocytów T, co umożliwia przenoszenie tolerancji z jednego osobnika na drugiego - tak zwana tolerancja infekcyjna

- oddziałują one nie tylko na limfocyty ale również na komórki prezentujące antygen

- wydaje się że w pewnych sytuacjach mogą zabijać efektorowe LimT

- napływając do miejsca, w którym rozwija się odpowiedź immunologiczna, rozpoznają swoiście określony antygen, następnie mogą hamować nieswoiście odpowiedź również na inne antygeny a nie tylko na ten, który pobudził ich powstanie - supresja „przypadkowego przechodnia”

Subpopulacje limfocytów T cytotoksycznych (LimTc)

- do efektu cytotoksycznego zdolne są:

• limfocyty Tαβ CD8+

• limfocyty Tαβ CD4+

• limfocyty Tγδ

• limfocyty NKT

• komórki NK

- LimT CD8+ określane również jako CTL (cytotoxic T lymphocytes) zabijają komórki rozpoznając obce (allogeniczne) cz.MHC I lub antygeny połączone z własnymi (autogenicznymi) cz.MHC I

- ich główna rola to niszczenie komórek zakażonych przez wirusy i inne mikroorganizmy, a także niszczenie komórek nowotworowych

- profil wydzielanych przez nie cytokin przypomina profil cytokin LimTh1

- podział na LimTc1 i LimTc2 (nie wydzielające IFN-γ, wydzielające za to znaczne ilości Il-4 i Il-5)

- cytotoksyczne LimT CD4+ rozpoznają antygeny prezentowane im przez cz.MHC II

- LimT rozpoznające komórkę zakażoną wirusem mogą również jej nie zabijać, ale uleczyć wydzielając INF-γ

- limfocyty dysponują dwoma zasadniczymi mechanizmami zabijania komórek przez indukcję w nich apoptozy:

• zależnej od uwalniania perforyny, granzymów i granulizyny z ziaren cytolitycznych

• zależnej od interakcji cz.nadrodziny TNF w błonie komórki efektorowej (FasL, TNF, limfotoksyna alfa, TRAIL, TWEAK) i cz.nadrodziny TNF-R w błonie komórki docelowej

- LimTc CD8+ zdolne są do zabijania obydwiema drogami, LimTc CD4+ głównie przez FasL

- komórki NK zabijają również obiema drogami, ale przede wszystkim przez wydzielanie ziaren

- limfocyty T (Fas) mogą zabijać bratobójczo pobudzone LimT (FasL) i LimB a nawet zabijać same siebie

Limfocyty T mające receptor TCRγδ

- różnią się nie tylko budową receptora od LimTαβ

- powstają one w grasicy nieco wcześniej

- podczas syntezy ich TCR wykorzystywane są tylko niektóre spośród dostępnych segmentów genów V i J

- rozpoznają one między innymi:

• białka szoku cieplnego

• tak zwane fosfoantygeny

• alkilaminy wytwarzane przez wiele bakterii

• cząsteczki MICA i MICB pojawiające się na komórkach zarażonych wirusami, poddanych szokowi cieplnemu, działaniu rodników tlenowych, na komórkach w których doszło do uszkodzenia DNA i nowotworowych

- uczestniczą w odpowiedzi przeciwzakaźnej i przeciwnowotworowej

- mogą zarówno zabijać komórki zarażona jak i uczestniczyć w regulacji odpowiedzi immunologicznej przez wydzielanie cytokin np. INF-γ

- większość rozpoznaje antygeny nie poddane obróbce w komórkach prezentujących antygen i nie połączone z cz.MHC

- niektóre mają w swej błonie cz.CD8 a tylko nieliczne CD4

- mogą one rozpoznawać antygeny związane z cząsteczkami CD1

- znaczna ich cześć, podobnie jak komórki NK, przejawia zdolność do spontanicznej, nie podlegającej restrykcji MHC cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał ADCC

- podobnie jak limfocyty NKT wydaje się, że są one populacją o cechach pośrednich między limfocytami T i komórkami NK, pomost między odpornością swoistą a nieswoistą

- ekspresja białek szoku cieplnego wzrasta w odpowiedzi na wszelkie czynniki uszkadzające

- limfocyty te rozpoznają białka szoku cieplnego, może dlatego znaczny ich odsetek jest w stanie pobudzenia lub ma cechy limfocytów pamięci

- mogą rozpoznawać i eliminować zarówno komórki poddane stresom jak i uszkodzone oraz, co nie jest charakterystyczne dla LimT, bezpośrednio rozpoznawać pewne niebiałkowe antygeny na mikroorganizmach!

Limfocyty NKT (natural killer T cells)

- są subpopulacją limfocytów mających cechy zarówno LimT jak i komórek NK

- w olbrzymiej większości są to limfocyty Tαβ i do rearanżacji ich genów używana jest bardzo mała pula segmentów genów Vα i Vβ

- rozpoznają głownie glikolipidy prezentowane im przez cz.CD1d

- wydzielają w wyniku aktywacji szczególnie dużo Il-4 oraz INF-gamma, ale także Il-13, GM-CSF, chemokinę CCL3, TNF i limfotoksyny (cytokiny zarówno typu Th1 jak i Th2)

- ważną ich funkcją jest immunoregulacja, a zaburzenia ich czynności sprzyjają rozwojowi chorób autoimmunizacyjnych

- uczestniczą w odporności przeciwzakaźnej

- często są w stanie zabić komórki nowotworowe zarówno przez wydzielanie zawartości ziaren jak i przez FasL

- przez wydzielany INF-gamma aktywują LimTc, komórki NK i makrofagi

- w różnych warunkach mogą one hamować lub stymulować rozwój nowotworu

- występują na ich powierzchni niektóre receptory charakterystyczne dla komórek NK

Komórki veto

- mają zdolność wprowadzania w stan anergii a nawet zabijania rozpoznających je LimT

cecha	komórki NK	limfocyty Tγδ	limfocyty Tαβ
dominujący fenotyp CD TCR wachlarz rozpoznawanych komórek docelowych restrykcja MHC FcγRIII udział w ADCC odpowiedź na PHA i ConA odpowiedź na Il-2	CD2+3-4-8- - szeroki - + + - +	CD2+3+4-8- + szeroki - + + + +	CD2+3+4+/8+ + ograniczony + - - + +

Komórki NK (natural killers)

- limfocyty mające właściwości spontanicznego (bez uprzedniej immunizacji) zabijania komórek docelowych, obejmujących niektóre komórki nowotworowe i zakażone wirusem

- uczestniczą również w procesach immunoregulacji

- efekt cytotoksyczny przez nie wywoływany nie podlega restrykcji MHC

- stanowią kilkanaście procent limfocytów krwi obwodowej

- większość z nich ma morfologię dużych ziarnistych limfocytów (LGL)

- stanowią populację komórek wykształconych dość wcześnie w rozwoju filogenetycznym i pierwotnych w stosunku do Lim T i B

- ich główną rolą biologiczną jest udział w nadzorze immunologicznym, rozumianym jako zespół mechanizmów immunologicznych odporności przeciwnowotworowej i przeciwwirusowej

Cechy morfologiczne

- w populacji komórek NK przeważają duże ziarniste limfocyty (LGL)

- charakterystycznym markerem ludzkich komórek NK jest CD56 - izoforma cząsteczki adhezji komórek nerwowych - N-CAM, warunkującej przyleganie komórek nerwowych i mięśniowych

- inną cząsteczką obecną w dużej liczbie jest CD16 - receptor dla fragmentu Fc przeciwciał IgG (FcγRIII) a także CD161

- definicja najlepiej obrazująca morfologicznie i fenotypowo komórki NK to: duże ziarniste limfocyty CD3-CD16+CD56+

Pochodzenie i subpopulacje komórek NK

- pochodzą z prekursorów dojrzewających w szpiku

- rozwijają się z komórki macierzystej wspólnej dla Lim T i B

- różnicowanie się komórek NK w dojrzałe formy o aktywności cytotoksycznej uzależnione jest od wpływu cytokin wydzielanych przez komórki zrębu szpiku, najważniejsze z nich to: Il-15, SCF, Flt3L i prawdopodobnie Il-4

- fenotypowym odzwierciedleniem dojrzewania komórek NK jest utrata ekspresji CD34 i ujawnienie się na powierzchni cząstki CD56

- różnicowanie niektórych komórek NK zachodzi również w grasicy

- wyróżnia się 2 główne subpopulacje komórek NK u człowieka: komórki o umiarkowanej ekspresji CD56 i dużej ekspresji CD16 określane czasem mianem NK1 (CD56^dimCD16+) i komórki o dużej ekspresji CD56, nie mające na powierzchni cząsteczek CD16 tzw. komórki NK2 (CD56^highCD16-)

- we krwi to w większości NK1

- komórki NK2 wytwarzają duże ilości GM-CSF, TNF, Il-5, IL-13 i charakteryzują się słabymi właściwościami cytotoksycznymi

- komórki NK1 wytwarzają po aktywacji duże ilości INF-gamma i mają silne właściwości cytotoksyczne

- słaba mobilność, wolne tempo krążenia

- część komórek NK może proliferować w taknkach, czynnikiem wzrostowym w tkankach jest przede wszystkim Il-2, a także Il-12, Il-15 i Il-21

Efekt cytotoksyczny komórek NK

- komórki NK mogą wywierać efekt cytotoksyczny bezpośrednio bądź za pośrednictwem przeciwciał w procesie ADCC

- efekt cytotoksyczny w mechanizmie bezpośrednim regulowany jest przez dwa rodzaje przeciwstawnych sygnałów: aktywujące i hamujące przekazywane przez odpowiednie receptory znajdujące się na powierzchni tych komórek

- za pośrednictwem receptorów aktywujących wyzwalane są mechanizmy lityczne prowadzące do śmierci komórki docelowej

- interakcja receptorów hamujących z odpowiednimi cząsteczkami na komórce docelowej prowadzi natomiast do blokowania reakcji cytotoksycznej

- w zależności od tego które sygnały przeważają komórka docelowa jest eliminowana lub oszczędzana

- ligandami dla receptorów komórek NK mogą być cz.MHC I zarówno klasyczne jak i nieklasyczne a także inne nie poznane bliżej cząsteczki

- najlepiej scharakteryzowana trzy grupy receptorów (rozpoznające cz.MHC I):

• receptory z nadrodziny cząsteczek Ig-podobnych, występujące u człowieka (receptory typu KIR z sekwencjami ITIM umożliwiającymi przekazywanie sygnału hamującego, lub sekwencjami ITAM umożliwiającymi aktywację, wśród nich receptory naturalnej cytotoksyczności)

• receptory lektynowe CD94 charakterystyczne dla człowieka i gryzoni (nie mają swoich sekwencji mogą się łączyć z białkami i przekazywać sygnały hamujące lub aktywujące)

• receptory lektynowe Ly-49 charakterystyczne tylko dla gryzoni (sekwencja ITIM - hamowanie, sekwencja ITAM - aktywacja)

- właściwości cytotoksyczne związane przede wszystkim z występowaniem azurofilnych ziaren ze związkami cytotoksycznymi (perforyna, proteazy serynowe - granzymy, granulizyna oraz białko TIA-1)

- reakcje prowadzące do zabicia komórek docelowych są podobne jak w LimTc

- podobnie do LimTc na komórkach NK zidentyfikowano cząsteczki FasL i TRAIL, za ich pośrednictwem komórki NK mogą indukować w komórkach nowotworowych apoptozę (jak TNF)

- w zabijaniu komórek docelowych może uczestniczyć NO

- główną rolę w modulacji aktywności NK odgrywa Il-2 (stymuluje proliferację komórek NK i wzmaga aktywność cytotoksyczną)

- ważnymi cytokinami które stymulują aktywność komórek NK są też: interferony, Il-12, Il-18, Il-21 i Il-15 (stymuluje rozwój w szpiku i umożliwia przeżycie w tkankach i narządach)

- mogą być również aktywowane związkami pochodzenia bakteryjnego za pośrednictwem TLR

- bezpośrednio hamująco na NK działa prostaglandyna PGE₂ (wydzielana przez monocyty i makrofagi)

- działanie hamujące ma również kortyzol (hydrokortyzon) hormon steroidowy u człowieka wydzielany przez trombocyty PDGF

Zróżnicowanie aktywności komórek NK u ludzi zdrowych

- poziom NK u danego osobnika względnie stabilny, różny jednak u różnych osób!

- u osób starszych większa aktywność NK

- aktywność u kobiet mniejsza w porównaniu z mężczyznami (wpływ żeńskich hormonów płciowych - estrogenów)

- u kobiet w ciąży aktywność NK jeszcze bardziej zmniejszona

Fizjologiczna rola komórek NK

- udział w odporności przeciwnowotworowej, im mniej NK tym większe ryzyko nowotworu, u chorych w początkowym stadium nowotworu aktywność NK nieco obniżona, u chorych z zaawansowanym nowotworzeniem i przerzutami aktywność NK znacznie zmniejszona

- uzupełniają działanie LimT - niszczą zmienione komórki których LimT nie są w stanie rozpoznać

- udział w odporności przeciwzakaźnej, wytwarzane miejscowo chemokiny przyciągają komórki NK, komórki NK niszczą bezpośrednio zakażone komórki (efekt cytotoksyczny) lub też wydzielają INF-gamma i TNF

- w zakażeniach grzybiczych bezpośredni efekt cytotoksyczny

- w zakażeniach pierwotniakami silnie aktywują makrofagi

- rola immunoregulacyjna, wzajemne oddziaływanie z komórkami dendrytycznymi

- miejscem znacznej akumulacji komórek NK jest błona śluzowa macicy w drugiej połowie cyklu menstruacyjnego (po owulacji) oraz doczesna w początkowym okresie ciąży (komórki NK doczesnowe/maciczne o słabych właściwościach cytolitycznych)

- komórki trofoblastu (przyrównanie do przeszczepu semiallogenicznego) bronią się przed komórkami NK doczesnej dzięki ekspresji nieklasycznych cząstek MHC klasy I - HLA-G

- uczestniczą w procesie odrzucania przeszczepu szpiku

- zaangażowane w reakcję GVH (graft versus host)

Komórki LAK (lymphokine-activated killers)

- limfocyty uzyskane w warunkach doświadczalnych po stymulacji dużą ilością Il-2

- efekt cytotoksyczny wobec świeżo izolowanych autologicznych komórek nowotworowych

- zakres działania znacznie szerszy niż NK

Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC)

- do zabicia komórki docelowej w ADCC konieczny jest jednoczesny udział przeciwciał i komórek efektorowych

- przeciwciała opłaszczają komórkę docelową warunkując swoistość reakcji, natomiast komórki efektorowe, wiążąc fragmenty Fc tych przeciwciał, warunkują efekt cytotoksyczny

- w zjawisku ADCC może uczestniczyć wielkość leukocytów: komórki NK (LGL), makrofagi, monocyty, niektóre LimT, neutrofile, eozynofile, a także trombocyty

- efekt ADCC mogą również wywierać komórki niektórych linii nowotworowych