STRUKTURA I EWOLUCJA CHROMOSOMU

(materialy pomocnicze)

Materialy pomocnicze zebrane ponizej zawieraja najistotniejsze elementy wykladow na temat struktury i ewolucji chromosomu, wygloszonych przeze mnie w roku akademickim 2003/2004 dla studentow Wydzialu Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu M. Kopernika w Toruniu.

Jan Filipski

SPIS TRESCI str.

WSTEP V

1. EWOLUCJA PREBIOTYCZNA................................................................. 1

Prekursory replikatora. Introny. Synteza i ewolucja ligazy in vitro.

Synteza i selekcja in vitro rybozymu katalizujacego rybozylacje zasady purynowej.

Synteza i selekcja in vitro rybozymu katalizujacego synteze wiazania peptydowego.

Sprzezenie replikacji z transkrypcja.

2. USZKODZENIA DNA I ICH NAPRAWA......................................................... 19

Mutacje i rekombinacje w DNA. Uszkodzenia DNA. Naprawa uszkodzen

w DNA. Fotoreaktywacja. Naprawa alkilowanego DNA przez

metylotransferazy. Naprawa uszkodzen w DNA z udzialem glikozylaz.

Naprawa uszkodzen przez wycinanie nukleotydow. System SOS.

Mutacje mutatorowe.

3. DRZEWA FILOGENETYCZNE..................................................................... 37

Poczatki badan w dziedzinie ewolucji molekularnej. Drzewa filogenetyczne.

Rozszczepienie. Rekonstrukcja historii zmiany cechy genetycznej lub fenotypu.

Przodkowie. Kladogramy. Drzewa metryczne. Drzewa genow a drzewa

gatunkow. Rozdzial alleli. Sieci. Mierzenie zmian genetycznych.

Homologia sekwencji. Odleglosc genetyczna.

4. METODY KONSTRUKCJI DRZEW FILOGENETYCZNYCH........................ 53

Przyklady filogenetyki molekularnej. Metoda UPGMA. Metoda najblizszych

sasiadow. Metoda Fitcha i Margoliasha obliczania dlugosci galezi.

Metoda maksymalnej oszczednosci. Rekonstrukcja drzew metoda Fitch'a

Analiza spektralna powiazan miedzygatunkowych.

Zakorzenianie drzew filogenetycznych.

5. CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI DNA W CHROMOSOMIE........ 73

Zlozonosc kinetyczna. Sekwencje unikalne. Amplikony. Satelity.

Molekularny mechanizm rekombinacji. Minisatelity. Mikrosatelity.

Pseudogeny. Sekwencje typu LINE. Sekwencje typu SINE. HERV.

Zlozonosc kompozycyjna.

6. ANALIZA FILOGENETYCZNA POPULACJI LUDZKICH......................... 93

Ewolucja molekularna chromosomow czlowieka. Roznice w ewolucji

chromosomu Y i DNA mitochondrialnego. Haplotypy chromosomu Y.

7. STRUKTURA CHROMATYNY...................................................................... 105

Kondensacja DNA w chromosomie. Histony. Nukleosomy. Petle chromatyny.

Kohezyny i kondensyny.

8. ROLA CHROMATYNY W REGULACJI EKSPRESJI GENOW............ 123

Regulatory transkrypcji. Regulacja regulatorow. Dwie formy wlokna

chromatynowego. Jak czynniki transkrypcyjne reguluja ekspresje genu.

Koregulatory jako potencjalne koordynatory regulacji transkrypcji.

Kompleks preinicjacyjny. Metylacja. Izolatory.

9. TELOMERY I CENTROMERY.......................................................................... 141

DNA telomerow. Ochrona konca chromosomu. Chromatyna telomerow

i efekt pozycji. Rekombinacja telomerow. Telomery i starzenie sie komorek.

Centromery. Mikrotubule. DNA centromerow. Zmiennosc DNA satelitarnego

jako przyczyna specjacji. Bialka centromerowe czlowieka. Dynamika

chromosomu mitotycznego.

10. ELEMENTY GENETYKI MOLEKULARNEJ CYKLU ROZWOJOWEGO.... 157

Genetyczny program cyklu rozwojowego. Geny programu cyklu rozwojowego.

Tworzenie sie osi organizmu przod/tyl. Tworzenie sie osi grzbietowo

brzusznej organizmu. Selektory specyficznosci regionalnej segmentow. Pola

morfogenetyczne drugiego rzedu. Selektory specyficznosci pol morfogenetycznych

organow. Tworzenie sie osi wspolrzednych w polach drugiego rzedu. Selektory

specyficznosci komorkowej. Ewolucja genow Hox.

11. GENETYKA ZACHOWANIA........................................................................ 177

Szukanie pozywienia. Zegar dobowy zwierzat. Funkcja receptora

glukokortykoidu w neuronach. Rola receptora NMDA w zapamietywaniu.

Rola receptora dopaminy DRD4 w zachowaniu czlowieka.

UZYWANE SKROTY........................................................................................... 191

LITERATURA UZUPELNIAJACA..................................................................... 199

WSTEP.

Biologia molekularna poczawszy od polowy ubieglego stulecia rozwijala sie w sposob eksponencjalny : wykres przedstawiajacy zaleznosc liczby czlonkow amerykanskich towarzystw biologii doswiadczalnej od czasu, w latach 1920 - 2000, jest linia prosta w ukladzie logarytmicznym. Wynika z tego, ze uczeni biologowie mnozyli sie w tym okresie jak bakterie na bogatej pozywce. Ten eksplodujacy potencjal intelektualny zaowocowal ogromna iloscia odkryc, co z kolei mialo ten skutek, ze inaczej zaczelismy patrzec na zycie i na siebie samych.

To co najbardziej fascynuje w biologii molekularnej to niekoniecznie to, ze zwiekszyla ona nasze mozliwosci modyfikacji dziedzicznych cech gatunkow. W koncu czlowiek od tysiecy lat selekcjonowal organizmy o pozadanych wlasciwosciach. Wiekszym przelomem konceptualnym byla radykalna zmiana w naszym rozumieniu ewolucji organizmow zywych. Zdano sobie mianowicie sprawe z tego na czym polegaja mutacje i rekombinacje, ktore wywoluja zmiany w materiale genetycznym. W licznych przypadkach udalo sie rowniez przesledzic mechanizmy molekularne, dzieki ktorym zmiany te powoduja skutki fenotypowe, pociagajace za soba wielorakie konsekwencje dla osobnikow, populacji i gatunkow.

Miedzy licznymi pytaniami, ktore postawiono w tym okresie bylo rowniez i to: co jest pierwotne a co wtorne w ewolucji? Ewolucja odbywa sie bowiem na wielu poziomach. Powiadamy, ze ewoluuje biosfera, ewoluuja biotopy, w ich obrebie ewoluuja populacje, gatunki, ktore trwaja przez jakis czas po czym znikaja zostawiajac miejsca innym gatunkom, blizej czy dalej spokrewnionym. Ewoluuja linie komorkowe, chromosomy, bialka i geny.

"Ewolucja" (lac. rozwijanie sie) to w pewnym sensie termin techniczny, tak jak np. terminy "sprzezenie zwrotne" czy "reakcja lancuchowa". Okreslamy tym terminem mechanizm odpowiedzialny za zmiane struktury populacji zlozonej z jednostek posiadajacych pewne scisle okreslone wlasnosci. (Mozna go stosowac do populacji zlozonych z objektow nie bedacych objektami biologicznymi, co wykracza jednak poza ramy naszych rozwazan). Glowna cecha jednostek w populacjach ewoluujacych jest ich zdolnosc do replikacji - sa wiec replikatorami. Niezbedna do tego energie, substraty i inne elementy (np. katalizatory) czerpia ze srodowiska zewnetrznego. Replikacja jednostek w populacjach ewoluujacych nie jest calkowicie wierna. Na skutek roznic w budowie rozne kopie replikatora maja rozna sprawnosc i wiernosc replikacji oraz skutecznosc zabezpieczenia sie przed zniszczeniem (spontanicznym lub spowodowanym przez czynniki zewnetrzne). Przy nieograniczonych zasobach srodowiska i w nieobecnosci czynnikow destrukcyjnych populacja replikatora wzrasta w sposob eksponencjalny. W przeciwnym przypadku zachodzi selekcja replikatorow. W jej wyniku, w kolejnych pokoleniach populacji zaczynaja ilosciowo dominowac te warianty replikatora, ktore z takich czy innych przyczyn pozostawiaja wiecej kopii. Interesujaca cecha selekcji jest to, ze jej skutki wydaja sie byc celowo zamierzone, co jest prawda w przypadku selekcji np. rasy agresywnych psow dokonywanej przez hodowcow eliminujacych jednostki lagodne i sympatyczne, ale nie jest prawda w przypadku szczepu bakterii nabywajacego opornosc na przeciwciala gospodarza.

Ewolucje odnajdujemy obserwujac zachowanie populacji wirusow w zaatakowanym organizmie, zachowanie populacji komorek nowotworowych u pacjenta, populacji zwierzat czy roslin w obrebie gatunku czy gatunkow w obrebie wyzszych jednostek taksonomicznych. Replikatorami sa komorki w organizmie i byki w stadzie zawierajacym zwierzeta obojga plci. (Z biologicznego punktu widzenia replikatorem jest w zasadzie w tym ostatnim przypadku para zwierzat, ale mozemy uwazac jedna z plci za "element srodowiska" tak jak np. mozemy uwazac komorki za srodowisko w ktorym replikuja i ewoluuja mitochondria.) Replikatorem, ktory moze dac impuls ewolucji populacji bedzie np. pojedyncza komorka nowotworowa lub szczegolnie agresywny byk (taki jak np. byk Islero, ktory 28 sierpnia 1947 roku pokonal w walce slynnego matadora Manuela Rodrigeza Sancheza zyskujac dzieki temu zycie, prawo reprodukcji i honor zalozenia linii hodowlanej agresywnych bykow "Miura"). Jesli jednak zastanowimy sie nad tym jak to sie stalo, ze wspomniany byk byl lepszym replikatorem niz inne byki, to zdamy sobie sprawe, ze pierwotna przyczyna jego "wyzszosci" bylo pojawienie sie komorki posiadajacej szczegolna kombinacje alleli, w linii zarodkowej np. jego matki, ktora to komorka po polaczeniu sie z plemnikiem rozwinela sie w dorosle zwierze posiadajace "przewage" nad innymi. A wiec w przypadku byka replikatorem nizszego szczebla jest komorka podobnie jak w przypadku nowotworu. Byk jest w pewnym sensie urzadzeniem, ktore zapewnia proliferacje komorek linii zarodkowej, tak jak pacjent jest, z punktu widzenia ewolucji komorek transformowanych nowotworowo, srodowiskiem w ktorym zachodzi ich proliferacja. Posunawszy to rozumowanie dalej, dochodzi sie do wniosku, ze w przypadku istot zywych elementarnymi replikatorami sa funkcjonalne segmenty czasteczki DNA. To one ewoluuja rekombinujac, akumulujac mutacje i tworzac kombinacje z innymi segmentami, zapewniajac sobie, a przy okazji swoim nosicielom na roznych szczeblach (a wiec chromosomom, komorkom, osobnikom, populacjom, gatunkom i wyzszym jednostkom taksonomicznym), "sukces" badz tez porazke reprodukcyjna. W przypadku komorki nowotworowej replikatorem, ktory osiagnal sukces reprodukcyjny moze byc sekwencja zmieniona przez mutacje w genie kodujacym czynnik transkrypcyjny. Sukces ten jest krotkotrwaly i konczy sie wraz ze smiercia pacjenta. W przypadku byka zmutowany allel moze, przy pomocy hodowcow, badz w sposob naturalny, rozprzestrzenic sie w stadzie, w rasie czy wrecz zastapic allel dotychczas przewazajacy w genomach osobnikow rozpatrywanego gatunku i ewentualnie zostac odziedziczony przez nowe gatunki, ktore sie kiedys z niego rozwina.

Molekularne podejscie do ewolucji ma miedzy innymi te zalete, ze o ile statystyczne prawdopodobienstwo spontanicznego pojawienia sie pierwszego replikatora - komorki (a tym bardziej byka) przez przypadkowe polaczenie sie atomow i czasteczek jest praktycznie rowne zero, o tyle jestesmy w stanie wyobrazic sobie jego pojawienie sie na poziomie molekularnym. Potrafimy tez zaproponowac, po czesci doswiadczalnie sprawdzalny, schemat jego dalszej ewolucji. Stalo sie wiec mozliwe odtworzenie drogi jaka przeszla materia nieozywiona aby stac sie ozywiona i myslaca.

Odkrycie Friedricha Wöhlera, ktory wykazal, ze mocznik mozna otrzymac z substancji nieorganicznych, a wiec bez interwencji « sily zyciowej » mialo w drugiej polowie dwudziestego wieku swoj ciag dalszy w doswiadczeniach Millera, ktory udowodnil, ze w atmosferze zlozonej z amoniaku, metanu i pary wodnej zachodzi pod wplywem wyladowan elektrycznych synteza aminokwasow. Podobnie udowodniono, ze lancuchy RNA moga powstawac z monomerow przez polimeryzacje na takim trywialnym katalizatorze jakim jest montmorylonit, mineral znajdujacy sie w glinie, ze RNA moze spelniac role enzymu i ze moze podlegac ewolucji w warunkach laboratoryjnych. Pokazano rowniez, ze wszystkie organizmy zywe posluguja sie w zasadzie tym samym kodem genetycznym, ze mitochondria sa spokrewnione z archebakteriami, a wiec, ze organizmy zlozone moga powstawac przez polaczenie sie dwoch prostszych, ze dystans genetyczny dzielacy szympansa od czlowieka jest niewiele wiekszy niz dystans oddzielajacy dwoch ludzi mijajacych sie na ulicy, itd.

Szkic teorii tlumaczacej w jaki sposob przebiegala ewolucja na poziomie molekularnym, ktory potrafimy dzis przedstawic, jest bardzo niepelny. Zawiera liczne znaki zapytania, a pewne jego etapy sa bardzo spekulatywne. Aby rozwiazac problemy, ktore napotykamy przy konstrukcji takiego szkicu, proponuje sie rozne, niekiedy nawzajem wykluczajace sie hipotezy. Niemniej ogolny schemat procesu powstania i ewolucji materii ozywionej jest w zasadzie znany. Niektore elementy tego schematu zostana tutaj przedstawione w 11 czesciach z polozeniem nacisku na powstanie, strukture i ewolucje chromosomu oraz na aspekty jego funkcjonowania, szczegolnie wazne dla zrozumienia tej ewolucji.

1. Ewolucja prebiotyczna jest to hipotetyczny proces, ktory zachodzil w okresie kilkuset milionow lat po ostygnieciu kuli ziemskiej. W wyniku tego procesu, ktorego rozne etapy uczeni staraja sie odtworzyc w laboratorium, powstaly i ulegaly ewolucji czasteczki bedace skladnikami istniejacych dzis organizmow zywych. Powstal rowniez nieokreslony blizej kompleks makroczasteczek, ktory mial wlasnosci replikatora. Jego glownymi elementami byly prawdopodobnie czasteczki RNA. Hipoteza « swiata RNA » zaklada ze jednym z zasadniczych etapow ewolucji prebiotycznej byl okres gdy czasteczki RNA byly zarowno nosnikami informacji genetycznej jak i katalizatorami, ktore nazwano rybozymami. Powstanie i ewolucje rybozymow udaje sie modelowac in vitro.

2. Powstawanie uszkodzen w DNA to jeden z glownych procesow dostarczajacych surowca ewolucji. W jego wyniku powstaja mutanty, czesto rozniace sie od organizmow wyjsciowych tym, ze jedna para zasad w ich genomie ulega zamianie na inna. Zwykle proces ten zachodzi w ten sposob, ze para zasad w DNA ulega chemicznej modyfikacji, po czym, w wyniku replikacji lub w wyniku procesu nieudanej reperacji uszkodzenia, zmodyfikowana para zostaje zastapiona inna.

3. Dziedzina biologii molekularnej zwana ewolucja molekularna zajmuje sie budowaniem drzew filogenetycznych. Opiera sie ono w duzej mierze na technikach informatycznych, ktore porzadkuja dane dotyczace sekwencji aminokwasow w bialkach lub sekwencji zasad w kwasach nukleinowych roznych organizmow zyjacych obecnie lub w przeszlosci. Techniki te pozwalaja okreslic z duza precyzja stopien pokrewienstwa pomiedzy gatunkami jak rowniez niekiedy pozwalaja odtworzyc przebieg ewolucji.

4. Techniki obliczeniowe ewolucji molekularnej sa skomplikowane i zabieraja duzo czasu nawet maszynom o duzej szybkosci liczenia. Niemniej zasady, na ktorych niektore z tych technik sie opieraja sa stosunkowo proste. Przy ich pomocy mozna modelowac ewolucje, a otrzymane wyniki sa wiarygodne.

5. Struktura materialu genetycznego w chromosomie eukariotow jest o wiele bardziej skomplikowana niz w przypadku bakterii ze wzgledu na ogromna ilosc sekwencji powtarzajacych sie, rozproszonych lub wystepujacych w postaci blokow. Bede mowil o tych sekwencjach jak rowniez o procesach, ktore sa odpowiedzialne za ich tworzenie i utrzymywanie w genomie, a w szczegolnosci o rekombinacji i transpozycji.

6. Ewolucja czlowieka interesuje nas chyba najbardziej. Dokonano w tej dziedzinie wielu odkryc, niekiedy bardzo spektakularnych, stosujac metody ewolucji molekularnej do badania populacji ludzkich. Wspolnie z danymi paleontologicznymi metody te pozwalaja odtworzyc nasze wlasne drzewo filogenetyczne.

7. Struktura chromatyny w chromosomie jest wielopoziomowa. Kazdy poziom ma swoja jednostke elementarna o charakterystycznej budowie. Najnizszy z tych poziomow, poziom nukleosomu jest dosc dobrze poznany. Wyzsze pietra struktury chromosomu : solenoid, petla, rozeta i chromatyda poznane sa znacznie gorzej. Niemniej mamy sporo danych pozwalajacych zrozumiec podstawowe wlasnosci i dynamike tych struktur, z wlasnosciami i dynamika chromosomu metafazowego wlacznie.

8. Chromatyna w jadrze metafazowym spelnia funkcje nosnika materialu genetycznego. Jest ona ponadto, a moze przede wszystkim, zaangazowana w regulacje roznych aktywnosci genomu : replikacji, transkrypcji, rekombinacji czy naprawy uszkodzen DNA. Niektore z tych procesow sa dosc dobrze poznane, tak, ze mozna juz w zasadzie mowic o ogolnej teorii regulacji aktywnosci genu w organizmach eukariotycznych, ktora jest zupelnie inna niz regulacja aktywnosci genu u bakterii.

9. Centromery i telomery od dawna byly zdefiniowane metodami cytogenetycznymi. Obecnie wiemy sporo na temat ich budowy i funkcjonowania na poziomie molekularnym, tak, ze stalo sie mozliwe konstruowanie funkcjonalnych sztucznych chromosomow o pozadanych wlasciwosciach.

10. Poznanie mechanizmow rzadzacych cyklem rozwojowym na poziomie molekularnym bylo ogromnym osiagnieciem biologii molekularnej. Wiele jest jeszcze do zbadania w tej dziedzinie, ale rozumiemy juz podstawowe mechanizmy embriogenezy i organogenezy.

11. Genetyka zachowania jest pasjonujaca dziedzina nauki budzaca zazarte dyskusje. O ile bowiem przyjmujemy bez wiekszych protestow do wiadomosci to, ze nasz kolor oczu, skory czy wlosow jak rowniez sklonnosci do pewnych chorob sa odziedziczone po rodzicach, o tyle trudno jest nam pogodzic sie z tym, ze odziedziczylismy po nich rowniez i sklonnosci do pewnych zachowan. Wychowani w kulturze, ktora kladzie nacisk na indywidualna odpowiedzialnosc niechetnie godzimy sie z mysla, ze to co robimy jest w duzej mierze zdeterminowane przez procesy chemiczne nad ktorymi mamy ograniczona kontrole.

VI

II

---