WYBRANE ZBIEDNIENIA Z GENETYKI BAKTERII

NUKLEOTYD E. COLI

Kolista, zamknięta cząsteczka DNA. DNA wraz z białkami Histonopodobnymi

tworzy pseudonukleosomy

DNA

Jednostkami strukturalnymi DNA są nukleotvdv

W .skład nukleotydów DNA wchodzą: zasada azotowa, deoksyryboza i grupa fosforanowa.

Odróżniającymi częściami nukleotydów są zasady: adenina, tymina, guanina i cytozyna.

Długa nić DNA powstaje dzięki wiązaniom chemicznym tworzącym się między grupą fosforanową a deoksyrybozą sąsiedniego nukleotydu. W nici DNA każda deoksyrybozą jest połączona z dwiema grupami fosforanowymi.

DNA obecny w komórkach występuje juko połączenie dwóch pojedynczych nici. Trzymają się one razem dzięki słabym wiązaniom chemicznym -wiązaniom wodorowym. Wiązania te powstają między zasadami naprzeciwległych nukleotydów. Tylko określone pary nukleotydów mogą tworzyć takie wiązania: T zawsze łączy się z A, a C z G. W ten sposób sekwencja nukleotydów jednej nici określa w sposób jednoznaczny kolejność w drugiej. O niciach DNA, które utworzyły takimi pary, mówi się, że są wzajemnie komplementarne. Nici komplementarne są przeciwnie spolaryzowane (ukierunkowane) jedna z nici ma kierunek od 3' do 5' a druga - od 5' do 3'

Nici komplementarne różnią się od siebie sekwencją nukleotydów, na przykład:

-------------- >

--ACTGA—

-- TGACT—

< --------------

Dwie komplementarne nici DNA owijają się wokół wspólnej osi, tworząc powszechnie znaną podwójną helisy. Na zewnątrz znajdują się dwie długie nici fosforanów deoksyrybozy (jest to tzw. szkielet fosforanowo-cukrowy. Zasady „sterczą" do środka helisy, gdzie tworzą wiązania wodorowe z komplementarnymi partnerami.

RNA

RNA różni się od DNA zarówno składem budujących go podjednostek, jak i strukturą drugorzędową. Szkielet RNA zbudowany jest z rybozy i fosforanu. Jako zasady występują guanina, adenina i cytozyna oraz uracyl, zamiast tyminy. Poza tym RNA może zawierać rzadziej spotykane zasady, np. psendouracyl. Komórkowy RNA jest przeważnie jednoniciowy; parowanie zasad zwykle występuje tylko na pewnych odcinkach.

REPLIKACJA DNA

• 
  Dobrze poznany jest mechanizm replikacji u E. coli. Proces ten zaczyna się w ori (origin of replication, rozpoznawanym przez specyficzne białka). W ori podwójna helisa DNA otwiera się i zachodzi inicjacja na obu niciach jednocześnie z utworzeniem specyficznej struktury tzw. widełek i replikacvjnvch.

• W kolistym DNA E. coli dwukierunkowa replikacja prowadzi do powstania struktury theta. U bakterii tej są trzy polimerazy DNA I, II i III Polimeraza DNA III działa w widełkach replikacyjnych dodając nowe nukleotydy. W celu zajścia replikacji podwójna helisa DNA jest rozwijana przez helikazę i stabilizowana przez białko SSB (single stranded binding)*

• 
  Pomiędzy syntezą DNA na obu niciach istnieją wyraźne różnice. Synteza na nici wiodącej 5' -3' przebiega w sposób ciągły, gdyż jest koniec 3'OH, do którego można dodać nowy nukleotyd. Na drugiej nici DNA jest syntetyzowane fragmentami, ponieważ nie mai końca 3' OH i konieczne jest zsyntetyzowanie małego primera RNA. aby dostarczyć wolne grupy 3'OH.

• Po syntezie primeru enzym primaza jest zastępowana przez polimerazę DNA III, która dodaje nukleotydy do momentu dojścia do uprzednio zsyntetyzowanego DNA. Wtedy polimeraza DNA III jest odłączana, a pojawia się polimeraza DNA I, która poza zdolnością do syntezy DNA, może usuwać primer RNA znajdujący się przed nią. Po usunięciu primera polimeraza DNA I jest uwalniania i ostatnie wiązanie fosfodiestrowe powstaje przy pomocy i ligazy DNA.

TRANSKRYPCJA DNA

• Przeniesienie informacji z DNA na RNA nazywa się transkrypcja. Powstająca cząsteczka RNA to informacyjny RNA. czyli messenger RNA (w skrócie mRNA). Jest on jednoniciowy. Synteza RNA zachodzi wyłącznie na jednej nici DNA. nici kodującej poczynając od końca 3' mRNA jest więc komplementarny w stosunku do nici kodującej. W wyniku transkrypcji zostaje skopiowana sekwencja zasad występująca wyłącznie w DNA.

• Enzymem katalizującym syntezę mRNA jest polimeraza RNA, Ponadto do rozpoczęcia syntezy RNA potrzebny jest jeszcze czynnik sigma (σ). Czynnik σ bierze udział w rozpoznaniu promotora. czyli sekwencji startowej na transkrybowanych DNA. W czasie transkrypcji podwójna helisa DNA musi ulec rozwinięciu. Synteza RNA zostaje zakończona, gdy polimeraza dotrze do sekwencji DNA zwanej terminatorem.

TRANSLACJA

Przetłumaczenie sekwencji zasad w RNA na sekwencję aminokwasów w białku nazywamy translacją.

PODSTAWOWY DOGMAT BIOLOGII MOLEKULARNEJ

KOD GENETYCZNY

• Każdy gen jest określony sekwencją DNA. Przekaz informacji od zapisu nukleotydowego do aminokwasów odbywa się za pomocą kodu. Sekwencja trzech nukleotydów, zwana trypletem lub kodonem, określa aminokwas, a sekwencja trypletów w kwasie nukleinowym określa sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.

• Niektóre trójki zasad mają specjalne znaczenie: AUG koduje metioninę i służy jako kodon startowy. Trójki UAA, UAG i UGA to kodony „nonsensowne” lub inaczej kodony stop (nie kodują aminokwasów) - sygnalizują one koniec translacji jakiegoś odcinka mRNA.

SYNTEZA BIAŁEK

• Aminokwasy są włączane do łańcucha polipeptydowego w kolejności określającej sekwencję trójek w mRNA. W procesie tym bierze udzaił mRNA, transportujący RNA (tRNA). Rybosomy, rożne enzymy, ATP i inne czynniki. W pierwszym etapie aminokwasy są acylowane przez ATP, w wyniku czego powstaje aminoacyl-AMP. Reszta minocylowa zostaje następnie przeniesiona z AMP na końcowy nukleotyd tRNA.

• Aktywacja i połączenie aminokwasu z właściwym tRNA są przeprowadzone przez enzym - właściwą syntetazę aminoacylo-tRNA, która rozpoznaje zarówno aminokwas, jak i odpowiadający mu tRNA. Każdemu aminokwasowi odpowiada swoista syntetaza aminoacylo tRNA,

• Niektórym aminokwasom odpowiada więcej kodonów; odpowiada im też większa liczba t-RNA. Właściwa syntetaza może też przyłączać więcej rodzajów tRNA. Każdy tRNA zawiera region nazywany antykodonem, który jest komplementarny do właściwego trypletu (kodonu) mRNA. Przyłączenie aminokwasów zachodzi na rybosomach, które przesuwają się wzdłuż mRNA, poczynając od jego końca 5'-OH.

• Aminokwasy zostają poprzez tRNA ułożone w odpowiedniej kolejności i połączone wiązaniem peptydowym. Do danego mRNA może przyłączyc się wiecej rybosomów, tak że mRNA stanowi matrycę do syntezy kilku polipeptydów. Kompleks złożony z mRNA i rybosomów nazywa się polisomem.

TRANSKRYPCJA

U bakterii pojedyncza molekuła mRNA często koduje więcej niż jedno białko ze względu na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego opero nu na pojedynczą molekułę mRNA (tak zwane policystroniczne mRNA).

LAC OPERON U E. COLI

• Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji peronowej u bakterii jest proces rozkładu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegającym rozłożeniu na dwa cukry składowe: galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Jeśli w środowisku nie ma laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cząsteczek tego enzymu. Natomiast w momencie, gdy w środowisku znajduje się laktoza, w komórce pojawiają się tysiące cząsteczek beta-galaktozvdazv. Dodatkowo zwiększa się w komórce ilość pozostałych enzymów zaangażowanych w szlak laktozowy (galaktozydopermeazv i transacetvlazv galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji.

• Geny tych trzech enzymów znajdują się w jednym liniowym odcinku na chromosomie E.coli zostały oznaczone według kolejności występowania:

• Z - beta galaktozydaza

• Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)

• A - transacetylaza galaktozydowa

• Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać może jednoczesnej indukcji przez cząsteczkę laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, że przed tymi genami musi się znajdować niezależny element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.

• Okazało się, ze w regulacji bierze udział kilka genów:

• gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cząsteczkę represora zdolną do przejścia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wyłączający operon,

• gen operatora, który otrzymuje sygnał wyłącza jacy z represora.

• trzy geny kodujące białka, które są transkrybowane na jedno mRNA

• miejsce promotora (częściowo nachodzące na gen operatorowy), gdzie przyłącza się RNA polimeraza i indukuje synteze mRNA.

Gen regulatorowy produkuje cząsteczkę represora która może przenieść się do miejsca występowania operatora, przyłączyć się do niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym operonie. Ma to miejsce w kiedy w środowisku nie ma laktozy.

• Sytuacja staje się nieco bardziej skomplikowana, gdyż komórka bakterii może jednocześnie otrzymać laktozę i glukozę. Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych. Powstał mechanizm tzw. represji katabolicznej, która umożliwia bakterii zużywanie na początku glukozy nawet gdy jest laktoza. Mechanizm represji katabolicznej opiera sie na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z promotorem w o peronie lac dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonymw pobliżu tzw. CBS (CAP binding site).

• Białko CAP wiąże się z tym miejscem, jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy. Jeżeli natomiast glukoza znajduje się w pożywce, spada poziom cAMP, białko CAP zmienia kształt, nie wiąże się z CBS, polimeraza RNA gorzej wiąże się z promotorem i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona. Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonują w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji, gdyż obecność substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.

REKOMBINACJA DNA U BAKTERII

Proces rekombinacji jest to przeprowadzanie wymiany pomiędzy homologicznymi odcinkami DNA. Jest to podstawowy mechanizm wymiany genów pomiędzy chromosomami w żywych organizmach. Powoduje on zwiększenie różnorodności genetycznej, a ponadto w sytuacjach ekstremalnych przy dużym zniszczeniu DNA umożliwia przeżycie organizmu. W organizmach bakteryjnych rekombinacja zachodzi na trzy sposoby:

• koniugacja

• transformacja

• transdukcja

KONIUGACJA

• Koniugacja u bakterii jest to proces transferu genetycznego zachodzący podczas kontaktu dwóch komórek. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany dzięki plazmidowi. W koniugacji jedna z komórek tzw. donor przekazuje informację genetyczną komórce biorcy. Komórki dawcy posiada specyficzną strukturę powierzchniową tzw, pilus, płciowy, który pozwala na kontakt pomiędzy komórkami. Natomiast komórka biorcy posiada na swej powierzchni specyficzne receptory dla pilusa płciowego.

• Znane sa dwu typy dawców

• F+ plazmid w tej komórce funkcjonuje jak typowy plazmid i tylko on jest przenoszony w procesie koniugacji

• 
  Hfr plazmid jeet wintegrowany W chromosom dawcy i umożliwia on przekazanie DNA chromosomalnego podczas koniugacji.

KONIUGACJA

Obecność plazmidu F w komórce powoduje różne zmiany: komórka ma zdolność do syntezy pilii płciowych. Istnieje możliwość przeniesienia fragmentów DNA do innej komórki. Zmiana receptorów komórkowych uniemożliwiająca pobieranie kolejnych plazmidów płciowych

TRANSFORMACJA

• 
  Transformacja jest to proces pobierania przez komórki bakteryjne wolnego DNA z podłoża lub uwolnionego przez inne bakterie. Niektóre komórki mają naturalną zdolność do przeprowadzania tego procesu dzięki specyficznym systemom w błonie, ułatwiającym pobranie DNA. Są to tzw. bakterie kompetentne.

• W inżynierii genetycznej stosuje się różne metody umożliwiające również innym bakteriom przeprowadzenie transformacji. Podczas pojedynczej transformacji może dojść do pobrania niewielkiej ilości DNA, która jednak wydatnie rośnie przy zastosowaniu bakterii kompetentnych.

• W procesie transdukcji DNA między bakteriami jest przekazywane przy udziale bakteriofagów. Wyróżniamy dwa typy transdukcji: ogólną i ograniczona.

• Transdnkcja ogólna polega na przeniesieniu przez faga dowolnych genów zlokalizowanych w przypadkowym miejscu w genomie bakterii do komórki biorcy, z niską efektywnością.

• Transdukcja ograniczona występuje tylko w przypadku fagów łagodnych i polega na tym, że fag wintegrowuje się w specyficzne miejsce w genomie bakterii, następnie jako profag jest replikowany wraz z genomem komórki gospodarza. Potem zachodzi proces uwolnienia profaga, który może być na tyle nieprecyzyjny, że spowoduje wycięcie profaga wraz z pobliskim fragmentem chromosomu. Kolejnym etapem jest liza komórki i uwolnienie cząsteczek fagowych z konkretnymi fragmentami chromosomów.

---