BIOTECHNOLOGIA 5 WYKŁAD

Transfekcja - w wyniku transformacji przenoszony materiał wirusowy. DNA wirusowe posiadające DNA zrekombinowane jest izolowane i sztucznie podawane biorcom. Występuje bardzo rzadko w przyrodzie.

W wyniku rekombinacji homologicznej ważna jest metoda znalezienia rekombinantów.

Metoda najprostsza: bierzemy szczep dziki o wszystkich cechach, które chcemy przekazać.

W naszym wypadku dawcą jest mikrob warunkujący przekazanie tryptofanu. DNA to pochodzi ze szczepu dzikiego, który charakteryzuje się tym, że ma wszystkie elementy pozytywne pod względem wykorzystania aminokwasów i ma między innymi gen odpowiedzialny za wytwarzanie tryptofanu.

Mutant auksotroficzny - Trp-. DNA ze szczepu Trp+ w wyniku transformacji łączy się z komórkami Trp- i transformuje te komórki. Powstają komórki potomne, które nabędą cechy wytwarzania tryptofanu. W związku z tym na podłożu, w którym brak jest tryptofanu, te komórki mogą spokojnie rosnąć, podczas gdy inne nie urosną.

Trzeba też zrobić doświadczenie kontrolne.

Podłoże, które eliminuje wzrost innych szczepów, a pozwala wzrastać innym nazywamy podłożami selekcyjnymi. W przypadku tworzenia map bakteryjnych metodą klasyczną używano mutantów auksotroficznych i dzikich szczepów, krzyżowano je ze sobą i robiono mapy genetyczne na podstawie mutantów auksotroficznych i szczepów dzikich.

Oceniono, że przeniesienie DNA chromosomalnego bakterii E.coli szczepu K12 od dawcy do biorcy na drodze koniugacji wynosi 100minut. W związku z tym założono, że chromosom E.coli ma 100 minut - jest to DNA koliste. W szeregu laboratoriów izolowano mutanty auksotroficzne pozbawione tworzenia kolejno wszystkich aminokwasów, jakie mikrob posiada, badano również zdolność wykorzystania cukrów. W ten sposób sporządzono pierwsze mapy genetyczne prowadząc koniugacje szczepu dawcy ze szczepem biorcy. Koniugacja była przerywana w odpowiednich odcinkach czasowych i analiza czasu przekazywania danego markera od dawcy do biorcy wyznaczały położenie na chromosomie.

Mając więc marker i czas, można - stosując koniugację przerywaną - przenieść wszystkie cechy bakterii od dawcy do biorcy, oznaczyć czas przechodzenia i umieścić na mapie genetycznej.

Dla bakteriofagów męskich akceptorem jest pilia płciowa. Powoduje to rozbicie pilii i rozerwanie komórek - w ten sposób przerywano koniugację.

Koniugację przerywa się też przez miksowanie zawiesiny bakteryjnej.

Ważne jest określenie typów płciowych bakterii - w różnym czasie w różnych typach płciowych będą przenoszone różne markery genetyczne. Najbardziej znany typem bakterii jest typ Hfr H.

Są to szczepy o bardzo wysokiej częstości rekombinacji genetycznej.

Są to szczepy, gdzie plazmid F jest wbudowany w chromosom bakteryjny, w związku z tym plazmid F, który znajduje się w chromosomie. Plazmid F jak każdy plazmid transportowany w wyniku przenoszenia od dawcy do biorcy w wyniku koniugacji musi zawierać i zawiera cały system genów tra.

Tra, to geny warunkujące przenoszenie DNA. Pozwalają przeniesienie DNA od dawcy do biorcy. Opisano tych genów około 15. Produkty genu tra - białka Tra od TraA do TraL to białka warunkujące przenoszenie tej nici. Warunkują w ten sposób, że odpowiadają za stworzenie tej pilii płciowej, odpowiadają za przeciągnięcie tej nici DNA, są to te geny, które nadają charakter płciowy męski komórce bakteryjnej. Jeżeli czynnik F jest wbudowany do DNA chromosomalnego, to zawsze origin (początek replikacji) - pęknięcie wyzwalającą pojedynczą nic do przeniesienia DNA do komórki biorcy - znajdować się może w różnych typach płciowych w różnych miejscach.

Stąd, gdyby robić koniugację typu H i typu C jako donora DNA, to będziemy mieli różne wyniki... gdyż w typie H i C w różnych miejscach wbudowany jest czynnik F. Origin całego procesu będzie startował z innego miejsca w tym DNA chromosomalnym. Kiedy zaczyna się przenoszenie z jednoczesną replikacją, następuje przeciąganie za sobą kolejnych markerów leżących na DNA. W zależności od miejsca, od którego zaczniemy, i otrzymamy różne markery.

Czynnik F od czasu do czasu może wybudowywać się z chromosomu. Podobnie, jak ma to miejsce przy transdukcji, gdy fag lambda to robi czynnik F może wybudować się pobierając ze sobą kawałek najbardziej zbliżonego do niego DNA o niewielkiej wielkości.

Jeżeli ten DNA pochodzi z operony laktozowego, to wstawi się operon laktozowy, a szczep, który powstał nazwiemy już nie F, a F' Lac

Plazmid F nie mobilizuje chromosomu. Może ulegać koniugacji - ma ori i cały system genów tra, ale nie jest plazmidem mobilizacyjnym, w związku z czym pozwala przejść od dawcy do biorcy, ale tylko sam czynnik F'.

Gdy krzyżujemy ze sobą F'Lac, z F-, nastąpi powstanie par koniugacyjnych przez połączenie się dawcy i biorcy i przeniesienie, ale tylko czynnika F prim. Selekcja jest prosta, bo wystarczy mieć podłoże minimalne, zawierające laktozę. Jeżeli F'Lac przeniesie geny operonu laktozowego, to koniugant będzie umiał wykorzystywać laktozę do swego życia

Jeżeli skrzyżujemy ze sobą szczep F+ (posiada czynnik F, ale nie wbudowany w chromosom, a czysty czynnik F), to ta koniugacja nie ma selekcji. Gdy połączymy te komórki w pary, selekcja jest trudna, bo na plazmidzie nie ma żadnych markerów.

W tym przypadku można użyć bakteriofagów, bo czynnik F niesie chociażby pilie płciowe.

Koniugacja - cały system należący do systemu horyzontalnego.

System horyzontalny - możliwość wymiany Dna w obrębie jednego gatunku lub międzygatunkowo. System horyzontalny jest to podstawowa droga ewolucji bakterii od setek tysięcy lat, a ma to szczególne znaczenie w ewolucji bakterii mocno patogennych. Bakterie patogenne rozprzestrzeniają cechy patogenne na drodze transferu horyzontalnego.

Wyspy patogenności - zbiory genów biorące udział w patogenezie bakteryjnej. Transfer horyzontalny pozwala na powstawanie nowych szczepów, powstawanie nowych układów chorobotwórczych z różnych bakterii. Wyspy patogenności przenoszą się w całości, rzadko częściowo.

koniugacja klasyczna - tylko czynnik F

Transdukcja - przenoszenie Dna za pomocą bakteriofagów.

Chromosom może być mobilizowalny w całości, ale i częściowo - jak F' lac.

W transferze horyzontalnym mogą być przenoszone transpozony - transpozycja. Mutageneza transpozonowa jest motorem ewolucyjnym.

Koniugacja na drodze mobilizacji lub bez mobilizacji.

Plazmid niezależny, wolny od chromosomu jest przenoszony do biorcy. Powstaje nacięcie nici, następuje replikacja (tylko nić replikowana jest przenoszona), nić przenoszona z replikacją i uzupełnieniem nici plazmidu.

W drugim przypadku jest koniugacja przy udziale plazmidu mobilizacyjnego.

Występują 2 plazmidy.

U wielu innych bakterii pojedynczy plazmid mobilizujący chromosom, bo się do niego wbudowuje istnieje bardzo rzadko. Zwykle w komórce znajdują się 2 plazmidy - jeden, który będzie transportowany oraz drugi, który ma na swoim genomie wszystkie cechy konieczne do uruchomienia przenoszenia innej cząsteczki DNA. Jeden plazmid to element przenoszony i element mobilizujący element przenoszony. Bardzo często układy i plazmidy mobilizacyjne wykorzystuje się do przenoszenia układów transpozonowych.

Plazmid F - posiada 100 kpz.

Oprócz tego systemu tra, ważne elementy to replikony - pozwalają na replikację i sekwencje insercyjne, pozwalające się wbudowywać do chromosomu bakteryjnego.

Drugi znany plazmid to plazmid R. Jest znany, bo plazmid ten zapewnia wielu szczepom bakteryjnym chorobotwórczym zapewnia oporność na szereg antybiotyków. Zawiera cały system genów odpornościowych na antybiotyki: geny cat - chloramfenikol, geny str - streptomycyna, sul - sulfonamidy i mer - odporność na rtęć.

Plazmid ten musi mieć też oriT i cały system genów tra. W literaturze opisany jest jako R100. Jest to jeden z bardziej podstawowych plazmidów, które warunkują oporność bakterii skierowaną przeciwko antybiotykom. Jest szereg pochodnych plazmidu R, które dają oporność na inne czynniki - R4, R12 itd.

Duże znaczenie w inżynierii genetycznej. Wykorzystano plazmid R do uzyskania pochodnych służących do klonowania i ekspresji.

Plazmid pBR322 - wyjściowy plazmid inżynierii biologicznej. Do klonowania. Ma duże zasługi dla inżynierii genetycznej. Nie jest to plazmid przenoszony na drodze koniugacji - nie ma genów tra. Stworzono go tylko dla potrzeb klonowani. Może być on przenoszony, ale w przypadku obecności w komórce plazmidu mobilizującego. Jeżeli sam nie ma systemu tra, to potrzebny jest plazmid mobilizujący.

Jak może być przenoszony? Albo dzięki mobilizacji, albo przy pomocy transformacji. Ma gdzieś replikon, jest origin replikacji. Jest to plazmid wysokokopiowy - sporo kopii plazmidu jest w komórce. Im bardziej wysokokopiowy, tym więcej elementów w komórce bakteryjnej w większej liczbie kopii. Wielokopiowość - więcej obcych cząsteczek w komórce biorcy.

Ważny jest cały szereg miejsc restrykcyjnych. Inżynieria genetyczna ywkorzystuje polilinkery - miejsca zawierające miejsca cięcia zgromadzone w jednym odcinku. pBR322 polilinkera nie miał, ale był wskazówką, że polilinker trzeba wymyślić.

Miał on za to pojedyncze miejsca cięcia, które wykorzystywano do klonowania - EcoR1, BamHI, HindIII.

Posiada on geny oporności - na tetracyklinę i ampicylinę.

Pierwsze klonowania genów insuliny były robione na pBR322. Plazmid ten jest ważny, bo jest mały i wielokopiowy - łatwy do klonowania, posiada 2 miejsca oporności na antybiotyki.

Inny ważny plazmid z Agrobacterium tumefaciens - "tumor inducing" - warunkujący powstawanie raka roślin.

Nazywa się P Ti.

Wykorzystanie tego plazmidu sprawiło, że można było przenieść geny warunkujące wykorzystanie azotu z jednych roślin do innych - z motylkowych do niemotylkowych.

Jest to spory plazmid, 200kpz. Posiada zespół genów wir - warunkują wirulencję - choć właściwie jest to przenoszenie DNA z bakterii do rośliny. Region tra - dzięki niemu przenosimy plazmid między różnymi bakteriami.

Wektor wahadłowy - shuttle vector- może replikować się w różnych organizmach. W tym przypadku zarówno w bakteriach, jak i roślinach.

Ważny jest element, który przekazywany jest do rośliny. Są dwie sekwencje flankujące do eukariotycznego. Element wstawiony pomiędzy te sekwencje jest wstawiany do rośliny. A więc jest to plazmid wstawiający dowolne geny do rośliny.

Przekazywanie tego plazmidu jest skomplikowane.

Białka Wir - potrzebne do zakażania. W efekcie uruchomienia systemu wir, ważnym białkiem jest uruchomione białko WirD - w plazmidzie nacina nić w jednym miejscu. Zaczyna więc origin przekazywania. W tym momencie mamy już element plazmidowy zawierający pojedynczą naciętą nić DNA.

Do tej naciętej nici przyczepia się WirE. Tylko w tym układzie, gdy białko WirE łączy się z pojedynczą nicią, nić może być wprowadzona do błony biologicznej komórki roślinnej. Tylko po przyłączeniu białka WirE nić może być przeciągana do komórki, która będzie warunkować to, że ten pożądany element przeniesiony jest do biorcy.

Plazmid ten przyczynił się do różnych modyfikacji genetycznych roślin.

Żeby DNA stransformować do Agcobacterium, to trzeba namnożyć plazmid... a namnaża się go w szczepie E. coli.

W plazmidzie musi być system pozwalający się replikować w E. coli. Transfer, przenoszenie koniugacyjne z E. coli do bakterii, która będzie ten plazmid uznawała jako swój. A.tumefaciens ma tę cechę, że bakteria ta będzie zakażać roślinę, tak jak to robiła zawsze z roślinami motylkowymi i dzięki temu układowi pTI może przenieść dowolny gen do komórki roślinnej.

Binarny wektor - ma 2 systemy replikacyjne - i w E. coli i w roślinie.

Tworzenie różnych typów Hfr.

W związku tym, że plazmid F może się wbudować w różne miejsca.

Jeżeli będzie to HfrH, będą szły te markery znajdujące się za nim.

Detekcja koniugantów

Przykład krzyżówki między Hfr donorem i biorcą. Dawca jest szczepem dzikim - Treoninowy, Leucynowy i Laktozowy układ. Może wytwarzać 2 aminokwasy i wykorzystywać laktozę. Ważne jet to, że jest wrażliwy na streptomycynę. Szczep biorcy - F- jest szczepem auksotroficznym, nie umie syntetyzować treoniny, leucyny - jest to mutant, który nie może bez niej żyć. Nie umie wykorzystywać laktozy, ale za to jest opornym szczepem na streptomycynę

Hfr donor: Thr +, Leu+, Lac+ StrS

F-: Thr-, Leu-, Lac-, StrR

Rekombinanty: Thr+ Leu+

Lub Lac+

Po 100 minutach trwania koniugacji wysiewamy to badziewie na podłoża selekcyjne - najczęściej wykorzystuje się podłoża Davisa, w skład którego wchodzi woda, sole mineralne, musi być źródło węgla i azotu. W przypadku biorcy w takim podłożu wymagana byłaby treonina i leucyna. My stosujemy czyste podłoże. W tym, gdzie selekcjonujemy rekombinanty treoninowo-leucynowe będzie czyste podłoże Davisa z dodatkiem streptomycyny

Jeżeli coś tam wyrośnie, to na pewno nie dawca, bo dawcę zatłucze streptomycyna. Ale nie będą to kolonie biorcy, bo biorca nie umie wytwarzać treoniny i leucyny. Rośnie to, co jest wynikiem rekombiacji między DNA dawcy i biorcy.

Dzięki krzyżówkom powstała mapa geneyczna roślin kwiatowych.

Jest szczegółowa - są tam zawarte poszczególne typy Hfr, zawiera wszystkie możliwe sprawdzone prototroficzne elementy, których geny znajdują się na tej mapie.

Od 15 lat jest to mapa zsekwencjonowana. Ten układ mapy jest wykorzystywany w przemyśle - w laboratoriach nie.

.

Transdukcja: ten typ przenoszenia, który się odbywa zawsze przy udziale bakteriofagów.

Bakteriofag lambda - specyficzny, zawsze przenosi ten sam element z tego samego rejony chromosomu, bo zawsze wbudowuje się w to samo miejsce chromosomu bakteryjnego. Wbudowuje się w operon maltozowy. Podczas transdukcji przenosi geny operonu maltozowego.

Lambda jest przykładem bakteriofaga, który ma cykl lizogeniczny - wbudowuje się do chromosomu bakteryjnego podczas cyklu.

Cykl lityczny i lizogeniczny. Lizogeniczny jest wtedy, gdy bakteriofag wbudowuje się do chromosomu i stanowi profaga. Lityczny - gdy wypada z chromosomu i lizuje.

Są bakteriofagi, które nie mają etapu lizogenicznego, a są lityczne.

Są też takie, które całe swoje "życie" mogą występować w DNA żywiciela i w pewnym momencie sobie wskakują i lizują. Do takich należy wirus opryszczki... działa na UV.

Cykl lityczny w końcu prowadzi do transdukcji.

bakteriofag, który przechodzi cykl dostaje się do komórki biorcy.

Bez lizogenii, bez wbudowania się w postaci profaga, wirus nie może mieć DNA dawcy. Zabiera to DNA od dawcy, uwalnia się przez cykl lityczny i uwalnia się, by zakazić coś swoim DNA.

Następuje rekombinacja homologiczna od dawcy do biorcy.

Transdukujący fag przenosi do 0,5kb par zasad. Mapowanie rozpoczęte przy pomocy koniugacji jest kończone przy pomocy transdukcji, by uszczegółowić elementy przenoszone.

Fagi sip? fagi P? przenoszą w sposób przypadkowy do komórki biorcy.

Transformacja - ten sposób transferu horyzontalnego, który jest bez udziały bakteriofagów, przenoszony do bakterii. Niejaki Griffith to wykrył.

Diplokoki z otoczkami i bez otoczek. Jego odkrycie było przypadkowe.

Transformacja kompetencja: DNA powinno być dwuniciowe. DNA jest pobrane przez komórkę bakteryjną. Przy czym to pobieranie jest dość skomplikowane, bo musi być przeniesienie jednej nici i doreplikowanie drugiej nici, bo inaczej nie zajdzie rekombinacja.

Bakterie, które pobierają Dna muszą nabrać stanu kompetencji.

Jest stan mikrobów, który pozwala pobierać DNA. Kiedyś myślano, że są geny kompetencji i nie udało się ich znaleźć. Stan kompetencji to taki stan, gdzie następuje na tyle rozluźnienie osłon, że DNA w sposób wolny dociera do błony cytoplazmatycznej i jest przenoszony do wnętrza komórki. Aby komórkę uczynić kompetentną można stosować płukanie zawiesiny bakteryjnej w roztworze chlorku wapnia - metoda wapniowa. Pozwala na wymianę jonów magnezowych na wapniowe na powierzchni. Następuje rozluźnienie struktury powierzchniowej i ułatwienie wnikania DNA. U E. coli jest to płukanie w temp 4 stopnie, dodawanie chlorku wapnia, kilkukrotne mieszanie i w ten sposób osiąga się stan kompetencji. Tak jest u E. coli. Jest to też wskazane, gdy zależy nam na wysokiej częstości transformacji.

Możemy stosować wysalanie w solach cezu i rubidu. Rozluźnia to powierzchnię bakteryjną.

Metoda elektroporacji - czysta, przepłukana zawiesina bakteryjna podlega przyłożeniu kilkunastu tysięcy woltów. Reakcję przeprowadza się w naczynkach, które mają dwie elektrody. Szerokość takiej kuwety ma maks 2mm. Jest duża powierzchnia cieczy i przyłożone duże napięcie.

Prąd impulsowy o wartości 12000-15000 wolt. Rozluźnia to powierzchnię błony i DNA łatwo wchodzi do środka. W wyniku elektroporacji również uzyskujemy stan kompetencji.

Gorzej jest w przypadku gram+. U nich transformacja jest albo bardzo prosta - ma to miejsce w przypadku Bacillus subtilis, która bardzo łatwo sama z siebie ulega kompetencji i przyjmuje DNA. Ale już szczep pochodny tej bakterii - asporogenny mutant, w ogóle nie przyjmuje DNA. W związku z tym w przypadku bakterii gram+ stosuje się różne metody w celu pozbawienia struktur powierzchniowych. Zwykle nadtrawia się enzymami mureinolitycznymi, które koszą mureinę. Stosuje się też płukanie w roztworach penicyliny, która łączy się z białkami wiążącymi penicylinę PBP, które biorą udział w syntezie mureiny.

Penicylina łączy się z tymi białkami i blokuje ich aktywność enzymatyczną, konieczną do tworzenia mostków peptydowych w strukturze mureiny. Penicylina powoduje, że mostki peptydowe nie stanowią dużego usieciowania i struktura się rozluźnia

Biotechnologia, wykład V, strona 6

---