WYKŁAD 14

METODY ELEKTROFORETYCZNE

Elektroforeza - wędrówka jonów w polu elektrycznym i proces rozdzielania tych cząsteczek wskutek różnicy szybkości ich migracji.

Zastosowanie elektroforezy - analiza i oczyszczanie makrocząsteczek/białek/kwasów nukleinowych oraz cukrów, aminokwasów, peptydów, nukleotydów, jonów i in.

Szybkość poruszania się cząstki w polu elektrycznym: υ =μ E

gdzie: υ [cm/s] - szybkość migracji

μ [m²/s V] - ruchliwość elektroforetyczna

E [V/m] - natężenie pola elektrycznego,

Wpływ parametrów środowiska:

Ruchliwość elektroforetyczna (μ) jest charakterystyczna dla danego jonu i jest wprost proporcjonalna do jego ładunku q [C], i odwrotnie proporcjonalna do promienia r [pm]

Podział metod elektroforetycznych:

• Elektroforeza swobodna

• Elektroforeza w nośnikach:

• bibułowa

• żelowa [agarozowy, PAGE]

Etapy elektroforezy:

• przygotowanie próbki

• wybór odpowiedniego nośnika i systemu buforów elektroforetycznych

• rozdział elektroforetyczny

• detekcja

ELEKTROFOREZA BIBUŁOWA:

• Nośnik: bibuła chromatograficzna, octan celulozy

• Technika kombinowana: elektrochromatografia

ELEKTROFOREZA NA ŻELACH AGAROZOWYCH:

• Są to galaretki półprzezroczyste, kruche, nie są tak odporne jak żele poliakrylamidowe

• Ich głównym składnikiem jest agaroza

• Stosowana w biologii molekularnej do analizy kwasów nukleinowych

• Immunoelektroforeza białek

• Elektroforeza kwasów nukleinowych na żelach agarozowych:

• Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą na rozdzielenie, identyfikacje lub oczyszczenie fragmentów DNA.

• Technika horyzontalna - rozdział według rozmiaru cząsteczek

• Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz do 50 000 pz

• Detekcja kwasów nukleinowych w agarozie:

• Barwniki fluerescencyjne - np. lub bromek etydyny pozwalają na uwidocznienie makrocząsteczek po zakończeniu elektroforezy lub wybarwienie przed separacją. Znaczniki uwidaczniają położenie prążków w świetle UV lub widzialnym. Czułość detekcji jest porównywalna z barwieniem srebrem lub jest nieco lepsza.

IMMUNOELEKTROFOREZA BIAŁEK NA ŻELACH AGAROZOWYCH:

Metody wykorzystujące swoiste reakcje Ag-Ig

• Elektroforeza białek i immunodyfuzja Ig - linie precypitacyjne charakterystyczne dla reakcji Ag-Ig

• Immunoelektroforeza rakietowa - elektroforeza w agarozie z dodatkiem Ag

• Immunoelektroforeza krzyżowa - kombinacja zwykłej elektroforezy na żelu agarozowym i elektroforezy rakietowej

IMMUNOELEKTROFOREZA - zależy od specyficznych reakcji antygen-przeciwciało i służy do detekcji rozdzielonych białek. Po niskonapięciowej elektroforezie próbek na żelu agarozowym wprowadza się surowice odpornościowe, które dyfundują przez żel i tworzą widoczne osady z rozdzielonymi antygenami.

Elektroforeza na ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:

• polimer akrylamidu i bisakrylamidu (czynnik sieciujący)

• posiada wysoką zdolność rozdzielczą

• odporny na działanie czynników chemicznych

• przezroczysty, bezbarwny, sprężysty

• zapewnia powtarzalność rozdziałów

• Elektroforeza kwasów nukleinowych odbywa się zazwyczaj w układzie pionowym

Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych stosowana w biologii molekularnej do analizy małych cząsteczek kwasów nukleinowych.

Detekcja kwasów nukleinowych w żelach poliakrylamidowych:

• Barwienie srebrem:

• Utrwalanie żelu

• Barwienie azotanem srebra

• Odbarwianie tła

ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM:

• Elektroforeza natywna -

• Metoda Ornstein'a - Davis'a

• ruchliwość elektroforetyczna jest uzależniona od ładunku i rozmiaru cząsteczki

• układ nieciągły, niedenaturujący

• Elektroforeza w warunkach denaturujących (SDS, mocznik) + reduktor (β-merkaptoetanol, DTT)

• Rozdział na zasadzie sita molekularnego

• Metoda Laemmli'ego: bufor elektrodowy: Tris-glicyna

• Metoda Shagerravona: bufor elektrodowy: Tris-tricyna

• Jest możliwe wyznaczanie masy cząsteczkowej białka:

M - masa cząsteczkowa białka

Metody detekcji stosowane w żelowej elektroforezie:

• Coomasie Brilliant Blue (0,1-1µg)

• sole cynku (10-100 ng)

• sole srebra (1-10 ng)

• SYPRO orange (2-10 ng)

• Selektywne wybarwianie enzymów (wizualizacja enzymów, które w wyniku katalizy produkują barwny substrat)

• barwniki fluorescencyjne (wymagają odpowiednich urządzeń - lamp)

Czynniki wpływające na szybkość migracji cząsteczek w żelu:

• masa cząsteczki

• koncentracja żelu / stopień usieciowania

• napięcie / natężenie prądu

• temperatura

• siła jonowa buforu elektrodowego

• pH buforu elektrodowego

IZOELEKTRYCZNE OGNISKOWANIE (IEF)

• Rozdział przebiega w gradiencie pH wytworzonym przez amfolity (czyli mieszanina kwasów wielokarboksylowych, które wędrują w polu elektrycznym i wytwarzaja pH w żelu)

• Jeśli białko jest naładowane ujemnie to wędruje w kierunku katody, jeżeli dodatnio to w kierunku anody, natomiast jeżeli nastąpi zrównoważenie ładunku białka (pH odpowiada pI) to białko zatrzymuje się w miejscu

• Metoda charakteryzuje się wysoką rozdzielczością

ELEKTROFOREZA 2D - dwuwymiarowa

• Połączenie izoelektrycznego ogniskowania i elektroforezy SDS-PAGE

• 1 kierunek: immobilizowany gradient pH, czyli ogniskowanie izoelektryczne które przeprowadza się na specjalnych paskach, a następnie pasek nakłada na żel i prowadzi elektroforeze SDS-PAGE w kierunku prostopadłym do IEF (2 kierunek)

• dostajemy żel pełen plam → obraz w postaci kropek

• metoda ta służy do badań np. ekstraktów komórkowych, kiedy badamy wszystkie białka jakie się w niej znajdują

• np. może służyć do porównania między komórkami normalnymi, a nowotworowymi (widzimy jakie białka występują w komórkach chorych a nie występują w zdrowych)

• do klasyfikacji białek używamy najczęściej sekwencjonowania aminokwasów

F - siła działająca na cząstkę w polu elektrycznym

q - ładunek cząstki

η - lepkość środowiska

r - promień cząstki

Przykrywa

(─)

(+)

Bibuła

Linia startowa

Roztwory buforowe

Schemat urządzenia do elektroforezy bibułowej:

odległość wędrówki białka

Małe cząsteczki

Duże cząsteczki

Żele poliakrylamidowe

- używane do cząstek mniejszych

Żele agarozowe do 2%

- używane do cząstek większych

ELEKTROFOREZA NA ŻELACH

odległość wędrówki znacznika

---