Grzyby (Mycota) - organizmy eukariotyczne. Nie wykazują zróżnicowania na korzeń, łodygę i liście. Plecha grzybów zbudowana jest ze strzępek (hyphae), które tworzą grzybnię (mycelium). U grzybów niższych grzybnia zbudowana jest z 1 komórki wielojądrowej = komórczak; grzybnia = cenocentyczna. U grzybów wyższych pomiędzy poszczególnymi komórkami występują przegrody poprzeczne = septum, posiadają one pory, które pozwalają na komunikację między komórkami, dzieje się to dzięki cytoplazmie. Mamy wtedy do czynienia z grzybnią wielokomórkową, ale jednojądrową. Ich komórki otoczone są ścianą komórkową zbudowaną z chityny z domieszką celulozy i glukanu. Grzybnia może być podłożowa (substratowa lub wgłębna) i powierzchniowa (powietrzna). Grzybnia powierzchniowa często wytwarza chwytniki które służą do pobierania pokarmu jak i przytwierdzania się do podłoża. Grzybnia niektórych pasożytów roślin może wytwarzać strzępki - ssawki które wnikają do wnętrza komórek żywiciela. Komórki grzybów otoczone są ścianą komórkową, u większości zbudowaną przeważnie z chityny z domieszką glukanu, celulozy bądź innych polimerów. Do ściany komórkowej od wewnątrz przylega plazmolemma - półprzepuszczalna lipoproteidowa błona cytoplazmatyczna otaczająca protoplast. Ma ona czynny udział w procesach transportu do i na zewnątrz komórki. Cytoplazma jest roztworem koloidalnym, mającym zdolność ciągłego ruchu. W cytoplazmie zawieszone są organella komórkowe - jądro komórkowe, rybosomy, mitochondria, wakuole. W komórkach występują substancje zapasowe w postaci kropelek tłuszczu, ziaren glikogenu i wolutyny.
W glebie grzyby występują w postaci grzybni, zarodników, przetrwalników. Brak chlorofilu i niezdolność do fotosyntezy determinują sposób odżywiania grzybów i rzutują na powiązania z innymi organizmami. Można zatem wyróżnić trzy podstawowe formy ich bytowania - symbiozę, pasożytnictwo i saprofityzm. Partnerami w symbiozie najczęściej bywają rośliny zielone, lecz zdarzają się także owady.
Podział:
*Grzyby niższe:
- Zygomycotina - sprzężniaki
- Chytrydiomycotina
*Grzyby wyższe:
- Ascomycotina - workowce
- Deuteromycotina - grzyby niedoskonałe
- Basidiomycotina - podstawczaki
1=Zygomycotina - grzybnia 1-kom, wielojądrowa, pierwotne zorganizowanie grzybni, służy do rozmnażania; ryzoidy - część substratowa - służy do odżywiania; rozmnażanie płciowe lub bezpłciowe; zarodniki - endosporocyt - powstaje wewnątrz zarodni; zarodniki są kuliste o kanciastych brzegach;
2=Deuteromycotina = fungi imperfecti - grupa stworzona sztucznie przez człowieka; zaliczamy do niej niektóre workowce i podstawczaki; nie stwierdzono u nich rozmnażania płuciowego;
- Fusarium sp. - wytwarzają 2 rodzaje zarodników (makro i mikrokonidia); makro - 3 lub więcej przegrody poprzeczne; mikro - od wygiętego do kulistego, max 2 przegrody; wytwarzają 2 rodzaje form przetrwalnych służących do rozmnażania bezpłciowego:
chlamydospory - grubsza ściana komórkowa, często zabarwiona, zawiera dużo substancji zapasowych; mogą powstawać na 2 sposoby: terminalnie (na szczycie strzępki), interminalnie (na całej długości, ale wewnątrz strzępki);
sklerocja - zbite, mocno upakowane strzępki, otoczone ciemną warstwą grubościennych komórek; zawiera 5-10% H2O, dużo substancji zapasowych - głównie lipidów;
- Oidium sp. - należy do rodzaju Oospora, wytwarzają oidie (zarodniki) - komórki luźno odrywające się od strzępek, utrzymują funkcję rozmnażania bezpłuciowego;
3=Ascomycotina - rozmnażanie bezpłciowe dzięki zarodnikom konidialnym - egzospory - powstają na trzonkach - konidioforach; rozmnażanie płciowe dzięki zarodnikom - ascospory w worku - ascus + powst. z zapłodnienia płciowego (lęgnia + plemnik) - następuje częściowe zlanie się jąder - dikariofaza (faza jąder sprzężonych); później następuje mejoza - powstaje 8 zarodników - ascospor;
3 rodzaje otoczni (wewnątrz nich jest schowana zarodnia workowa):
- klejstotecjum - kulisty, zamknięty twór;
- peritecjum - kształt gruszki, na szczycie ma otworek; charakterystyczne dla chetomium;
- apotecjum - występuje u najwyżej zorganizowanych grzybów; kształt talerzyków;
Drożdże - nie posiadają plechy ani grzybni i ich ciało ma postać owalnych komórek; rozmnażanie płciowe takie same, jak u workowców, worek powstaje wewnątrz komórki; rozmnażanie bezpłciowe odbywa się przez pączkowanie uwypuklanie - powstanie nowej komórki - tworzą się przegrody - rozerwanie;
Preparaty dzielimy na:
- przyżyciowe; w kropli płaskiej, w kropli wiszącej;
- martwe,
W kropli płaskiej - na szkiełku umieszczamy kroplę wody, ezą nanosimy bakterie i przykrywamy szkiełkiem przykrywkowym.
W kropli wiszącej - służą do obserwacji ruchliwości bakterii, wykorzystujemy grubsze szkiełka podstawowe z wgłębieniem na środku: szkiełko Lindnera; preparat robimy na szkiełku przykrywkowym, nanosimy kroplę wody, później bakterie lub grzyby, na brzegi szkiełka nanosimy trochę gliceryny, żeby szkiełko się nie ślizgało, przykrywamy je szkiełkiem Lindnera i odwracamy do góry nogami;
Barwienie preparatów
Utrwalanie preparatów - ma na celu przytwierdzenie komórek do szkiełka, by uchronić je przed zmyciem przy dalszych manipulacjach. Podczas utrwalania drobnoustroje zostają zabite, co ułatwia przeniknięcie barwnika do wnętrza komórki. Najczęściej utrwalamy preparat w płomieniu: szkiełko z wysuszonym w temperaturze pokojowej rozmazem przesuwamy 2-3 razy nad płomieniem palnika. Możemy utrwalać preparat odczynnikami takimi jak alkohol bezwodny lub 96%, wodny roztwór sublimatu, 10% roztwór formaliny. Po utrwaleniu preparat jest przygotowany do barwienia. Do stosowanych w mikrobiologii barwników należą: fuksyna, błękit metylenowy, fiolet goryczkowy, nigrozyna.
Barwienie proste - polega na nalaniu roztworu barwnika na powierzchnię utrwalonego rozmazu. Czas pozostawienia barwnika na preparacie jest różny i zależy tylko od rodzaju barwnika np. fuksyna 1-2 min. Nadmiar barwnika z preparaty opłukujemy wodą i osuszamy bibułą.
Barwienie złożone - umożliwia stwierdzenie różnic o charakterze systematycznym w strukturach fizykochemicznych.
Metoda Grama - w tej metodzie wykorzystuje się fakt że w komórkach. niektórych drobnoustrojów po traktowaniu ich roztworem fioletu goryczkowego i płynu Lugola (roztwór J w KJ) - powstają trwałe kompleksy o barwie fioletowej, trudno rozpuszczalne w alkoholu. Bakterie wykazujące tę właściwość nazywamy Gram+ pozostałe u których takie połączenia nie powstają Gram-. Technika barwienia metodą Gram+ jest następująca. Utrwalony preparat zalewa się na 1-2 min roztworem fioletu goryczkowego, płucze wodą i zalewa się płynem Lugola. Po upływie 1-2 min zlewa się płyn Lugola, po czym przemywa się preparat alkoholem etylowym aż do momentu wypłukania fioletu. Po spłukaniu wodą preparat dobarwiamy roztworem 1:10 fuksyny fenolowej i spłukuje wodą. Bakterie gramdodatnie zachowują zabarwienie fioletowe, a gramujemne wskutek dobarwienia kolor różowy charakterystyczny dla fuksyny.
Preparaty przyżyciowe, jak i martwe można barwić; stosuje się błękit metylenowy; barwimy nim komórki żywe; komórki martwe się nie wybarwiają;
Barwienie płynem Lugola - możemy obserwować ziarna skrobi, które zabarwiają się na granatowo i mogą być magazynowane.
Preparaty martwe: oglądamy bakterie; na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę wody lub hodowli płynnej, ezą wykonujemy rozmaz i zostawiamy preparat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, po wyschnięciu preparat utrwalamy przenosząc 3 razy nad palnikiem; takiego preparatu nie da się oglądać, stosujemy barwniki:
- barwniki proste - monochromatyna - jednobarwna - fiolet krystaliczny;
- barwniki polichromatyczne - złożone, wykorzystujemy wiele barwników, barwienie metoda grama:
~fiolet krystaliczny - barwimy nim przez ok. 2 min - spłukanie wodą;
~płyn Lugola - 1 min - spłukanie wodą;
~alkohol (denaturat) - 30 sek - spłukanie wodą;
~fuksyna kwaśna (1:4) - 1 min - spłukanie wodą - delikatnie osuszamy bibułą filtracyjną;
Fiolet krystaliczny - barwi bakterie gram dodatnie (G+) na kolor niebieski.
Płyn Lugola - utrwala barwę.
Alkohol - odbarwia to, co zabarwiło się niepotrzebnie.
Fuksyna kwaśna - barwi bakterie (G-) na kolor bladoróżowy.
Barwienie negatywne - barwimy tylko tło preparatu, co umożliwia dzięki kontrastowi obserwacje kształtów nie zabarwionych komórek. W celu przygotowania preparaty negatywowego kroplę zawiesiny drobnoustrojów mieszamy na szkiełku podmiotowym z zawiesiną tuszu chińskiego lub nigrazyny. Wytworzoną mieszaninę rozmazujemy za pomocą drugiego szkiełka przedmiotowego cienką warstwą po powierzchni szkiełka i suszymy.
Bakterie - to organizmy prokariotyczne (nie posiadają jądra); wielkość komórek 0,5-5μm; posiadają różne formy komórek, które są charakterystyczne dla danego rodzaju lub gatunku:
- formy kuliste (0,5-4 μm);
- formy cylindryczne (5-8 μm).
Kuliste: ziarniak (mogą tworzyć układy), dwoinka (doplococcus), czwórniak (tetracoccus), pakiet (sarcina), paciorkowiec (streptococcus), gronkowiec (straphylococcus).
Cylindryczne: pałeczki (bacterium), laseczki (bacillus). Nie wytwarzają przetrwalników. Wytwarzają przetrwalniki: przecinkowiec (vibrio), śrubowiec (spirillum - rzęski skręcone), krętek (spirochaeta), diplobacillus (2 kom), streptobacillus (wiele kom).
Promieniowce: 1 μm (nie przekracza tej wielkości), tworzą formy nitkowate, tworzą pseudomycelium (twór 1-komórkowy); wytwarzają pseudogrzybnię substratową i powierzną; rozmnaża się wegetatywnie poprzez fermentację grzybni lub przez tworzenie konidiów; promieniowce to bakterie. Promieniowce rozmnażają się wegetatywnie przez fragmentację całej grzybni lub przez tworzenie tzw. konidiów. U przedstawicieli rodzaju Streptomyces (rodzina Streptomycetacea) konidia powstają tylko w grzybni powietrznej wskutek segmentacji strzępek. Strzępki tworzące konidia - konidiofory różnią się na ogół od innych strzępek grubością i wyglądem (np. zgięte, skręcone spiralnie). Wiele szczepów promieniowców produkuje charakterystyczne barwniki, antybiotyki i substancje aromatyczne.
Bakterie: nitkowate, właściwe, archeony.
średnica komórek <1 μm, organizmy typowo prokariotyczne (wyst. nukleoid); skł. chem. jest podobny do składu i budowy bakterii, przejściowe stadium między bakteriami i grzybami; wytwarzają antybiotyki np. streptomyces griseus wytwarza streptomycynę; wytwarzają różne barwniki; wytwarzają geosminę - jej zapach jest podobny do zapachu świeżej gleby.
Pomiar komórek metodą wg Matuszewskiego - to prosta metoda, polega na określeniu wymiarów rzeczywistych komórek; można określić długość i szerokość; określa się je na podstawie rysunku preparatu spod mikroskopu.
[μm] W=a*1000/b
a - wielkość pozorna, b - powiększenie mikroskopu, W - wielkość rzeczywista
Środowisko naturalne: powietrze, woda i gleba.
Powietrze - nie jest środowiskiem, w którym normalnie żyją mikroorganizmy, brak w nim źródeł węgla i azotu - substancji potrzebnych do życia; powietrze jest tylko pośrednikiem mikroorganizmów z jednego środowiska do drugiego; mikroorganizmy dostają się do powietrza z gleby, z powierzchni rośli, wody oraz różnorodnych wydzielin ludzi i zwierząt i dlatego w powietrzu można stwierdzić występowanie wszystkich grup mikroorganizmów.
Skład ilościowy (ile mikroorg. w powietrzu) i jakościowy (jakie grupy mikroorg.) oraz przeżywalność zależą od różnych czynników:
1. temperatury,
2. wilgotności,
3. nasłonecznienia (promieniowanie ultrafioletowe)
W powietrzu wyst. grupy mikroorg. odpornych na przesuszenie i promieniowanie UV:
- wszystkie formy spoczynkowe i przetrwalnikowe grzybów i bakterii,
- formy wegetatywne bakterii i drożdży, które wytwarzają barwniki karotenowe, gdyż barw. karot. chroni przed promieniowaniem ultrafioletowym.
W powietrzu pomieszczeń jest więcej mikroorg. niż w powietrzu na przestrzeni otwartej. Skażenie powietrza wewnątrz pomieszczenia zależy od ilości ludzi lub zwierząt będących w pomieszczeniu, od 3 czynników powyżej, od czystości, od częstotliwości wietrzenia.
Liczebność mikroorganizmów w powietrzu pozwala określić stan sanitarny w powietrzu lub w jakiejś przestrzeni otwartej. Wymagane są badania w salach operacyjnych i zakładach przemysłowych.
Metoda sedymentacyjna Kocha:
- metoda najstarsza i najprostsza w wykonywaniu,
- polega na tym, że na powierzchnię płytki z podłożem swobodnie spadają mikroorg. przez jakiś czas (najczęściej 5, 10, 15 minut); metoda ta ma charakter orientacyjny - w jej wyniku nie otrzymujemy dokładnego wyniku ale orientacyjny (mniej więcej).
- założenie Omeliańskiego - mówi, że w ciągu 5 minut na 100cm3 podłoża osiada tyle mikroorg. ile znajduje się w 10dm3 powietrza.
L=a*5*100/πr2*t
L - ilość mikroorg. w 10dm3 powietrza, a - średnia liczba kolonii, πr2 - powierzchnia podłoża = 63,6cm3, r = 4,5cm, t - czas (5, 10, 15 minut).
Metoda Kocha - ważne są wady i zalety tej metody.
Zalety: łatwa, prosta metoda.
Wady: metoda ma charakter orientacyjny, na płytce osiadają mikroorg. nie tylko z przestrzeni nad powierzchnią płytki, ale osiadają również mikroorg. z sąsiadujących przestrzeni przeniesione prądem powietrza.
Nastawianie doświadczenia na mikroflorę powietrza: podłoże - agar odżywczy 6 płytek, inkubacja 30stC/24-72h.
Mikroflora wody.
- ogólna ilość mezofili w wodzie: woda do kolbki - posiew 1 mm wody na agar odżywczy, posiew wgłębny - przeniesienie pipetą - zalanie agarem odżywczym - inkubacja 37stC/24-48h
- miano coli: 1x50cm3 pożywki wg Eijkmana, 5x10cm3 pożywki, do cylindra dodajemy 50cm3 wody, do probówki po 10cm3.
Mikroflora gleby: posiew wgłębny; ogólna ilość bakterii 10-5 - podłoże wg Bunta - Roviry; ogólna ilość grzybów 10-3 - podłoże wg Martina z dodatkiem streptomycyny
Woda - jako środowisko naturalne charakteryzuje się duża różnorodnością mikroflory; związane jest to z różnym pochodzeniem organizmów m.in. w gleby, z powietrza, ze ścieków przemysłowych oraz odchodów. Przydatność wody ocenia się na podstawie analizy chemicznej oraz badań mikrobiologicznych. W Polsce takimi badaniami zajmuje się SANEPID wg ustalonych norm. Te normy (polskie normy) są aktualizowane, określają co należy badać w wodzie.
1. Ogólna liczba mikroorganizmów metodą płytkową na agarze odżywczym
- mezofili - inkubacja 37stC
- psychrofili - inkubacja 20stC
W wodzie wodociągowej w większych aglomeracjach miejskich nie może być więcej niż 5 komórek w 1ml wody. W mniejszych aglomeracjach nie może być więcej niż 20 komórek w 1ml.
2. Miano coli - ilościowe występowanie bakterii z grupy pałeczki okrężnicy w wodzie z zastosowaniem pożywki wybiórczej wg Eijkmana - pożywka płynna w laktozą, purpurą bromokrezolową (wsk. zmian odczynu)
rurka Durhama - dzięki niej możemy zaobserwować, czy organizmy rozwijające się w pożywce wydzielają gaz, czy nie.
pałeczki okrężnicy - grupa coli - do tej grupy należy e.coli, salmonella sp (powoduje salmonellas), spigella sp (powoduje czerwonkę) - pałeczki gram ujemne zasiedlające jelito.
E.coli wyst. w jelitach - niektóre szczepy mogą być patogenne, gdy wytwarzają odpowiednie toksyny. W mianie coli sprawdza się wyst. e.coli. Skład pożywki dobrany jest tak, żeby można było stwierdzić, czy jest to e.coli. E.coli jest beztlenowcem. Pierwsze, co musimy zaobserwować to zmętnienie w środkowej części probówki. Fermentują cukry proste - zakwaszają środowisko. Barwa purpury zmieni się na żółtą. Produktami ubocznymi są gazy, które można zaobserwować w rurkach Durhama. Jeśli te 3 warunki zostaną spełnione to jest ona pozytywna.
Miano coli - najmniejsza objętość wody, bądź innego badanego środowiska, wyrażone w ml, w której stwierdza się obecność przynajmniej 1 bakterii z grupy coli. Wg norm polskich miano coli powinno w wodzie wodociągowej wynosić >100, a w studziennej >50.
Mikroflora gleby.
Gleba - doskonałe środowisko dla rozwoju wszystkich grup mikroorg. Odpowiedzialne są one za proces humifikacji. Powstaje próchnica. Związki trudno rozkładalne są rozkładane i przyswajane później przez rośliny. Zamknięty obieg materii w środowisku. Rozwój i rozmieszczenie mikroorg. zależy od: temperatury, wilgotności, dostępności źródeł węgla i energii, źródeł azotu i soli mineralnych, odczynu środowiska. Mikroorg. rozwijające się w glebie są najczęściej tlenowe. Ich rozmieszczenie nie jest równomierne. Wyst. do głębokości 30cm. Znacznie więcej mikroorg. wyst. w pobliżu korzeni roślin - strefa ryzosfery.
Mikroflora autochtoniczna - mikroorg. tubylcze, ich środowiskiem życia jest gleba, biorą udział w humifikacji.
Mikroflora allochtoniczna - mikroorganizmy nabyte, czasem żyjące w glebie, uzależnione jest to od dostępu świeżej materii organicznej.
Określenie żyzności - stosunki ilościowe różnych grup mikroorg. np. stosunki bakterii do grzybów. Jeżeli będą przeważały grzyby to będzie to oznaczało, że gleba jest kwaśna - stosunek bakterii właściwych do promieniowców - mówi o zasobności gleby w substancje łatwo rozkładalne; jeśli będzie przewaga promieniowców będzie to oznaczało, że gleba jest uboga w składniki i zawiera związki trudno rozkładalne.
Przygotowanie próbek gleby do badania:
- wybranie próby reprezentacyjnej - pobieramy próbki z kilku miejsc; próbki pobiera się laską Egnera;
- przeniesienie gleby do jałowego pojemnika;
- przesianie gleby przez sita - ostateczne sito ma średnicę oczek = 1mm - oczyszczenie gleby z zabrudzeń i żeby nie było większych, zbitych kawałków gleby;
- określenie wilgotności gleby - wyniki podajemy na 1g/sm;
- wykonanie rozcieńczeń;
w glebie stwierdza się duże ilości bakterii; korzysta się z rozcieńczeń 10-5, 10-10
w przypadku grzybów 10-3
Fałszywe miano coli może być powodowane prze drożdże.
e.coli - zapach odchodów - gramujemne
drożdże - słodki zapach - gramdodatnie