Ćwiczenie 4 (19.03.2010)

,, Uszkodzenia i naprawa DNA w komórkach nowotworowych"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcja elektrochemiczną (HPLC-ECD);

- markery stresu oksydacyjnego i techniki ich detekcji

- modyfikacje zasad azotowych w kwasach nukleinowych (8-OH-dG i 8-OH-G);

- uszkodzenia oksydacyjne w DNA komórek nowotworowych;

- naprawa DNA.

W trakcie ekspozycji komórek na promieniowanie UV dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie DNA/RNA. Modyfikacjom ulęgają głównie zasady azotowe, w sąsiadujących nukleotydach mogą wytworzyć się wiązania, które są następnie usuwane przez kompleksy enzymatyczne fotoliaz. Zmiany mogą powstawać w obrębie samego pierścienia purynowego/pirymidynowego zasady azotowej, poprzez przyłączenie powstałego rodnika hydroksylowego. Poziom 8-OH-dG w wyizolowanym DNA może być markerem stresu oksydacyjnego w komórkach.

W trakcie ćwiczeń do identyfikacji oksydowanych pochodnych nukleozydowych wykorzystany zostanie system HPLC-High Performance Liquid Chromatography firmy ESA z detektorem elektrochemicznym Coulochem III, połączony z detektorem UV firmy WATERS. Zmiany w ilości wybranych modyfikowanych zasad azotowych mogą świadczyć o aktywacji mechanizmów naprawczych w komórkach, dążących do odtworzenia prawidłowej struktury DNA.

MATERIAŁY I METODY:

- wyizolowane na poprzednich ćwiczeniach DNA z komórek Me45 (czerniak), traktowanych promieniowaniem UV;

- bufor octanowy dla nukleazy (40 mmol/l zawierający 0,1 mmol/l ZnCl₂, pH=5.1);

- bufor Tris-HCl 1 mol/l, pH=8.5;

- nukleaza P1 (Sigma) z Penicillum Citrinum;

- fosfataza alkaliczna z E. Coli (Sigma);

- eluent do HPLC: octan sodu (100 mmol/l), metanol 5 % (v/v), pH=5.0;

- roztwory wzorcowe 8-hydroksy-2'deoksyguanozyny (8-OH-dG);

- roztwory wzorcowe 2'-deoksyguanozyny (dG).

WYKONANIE:

1. Przygotowanie wzorców.

- z otrzymanych roztworów wyjściowych 8-OH-dG i dG sporządzić po 500 µl mieszaniny dwóch wzorców o następujących stężeniach molowych:

8-OH-dG [nM]	dG [µM]	objętość końcowa
33.3	100	500 µl
16.15	50	500 µl
8.3	25	500 µl
4.02	12.5	500 µl

2. Detekcja wzorców w przygotowanych mieszaninach za pomocą HPLC-ECD (krzywa kalibracyjna):

- po uruchomieniu i zaprogramowaniu zestawu do detekcji przystąpić do nastrzykiwania mieszanin na kolumnę (jednorazowo po 20µl).

UWAGA: przed nastrzyknięciem każda próbka powinna być przefiltrowana przez filtr o średnicy porów 22 µm, w celu uniknięcia zanieczyszczenia kolumny!!!

3. Detekcja 8-OH-dG w wyizolowanym z komórek DNA.

Przygotowanie DNA do detekcji:

1. Do wyizolowanego DNA dodać podwójną objętość 70% EtOH.

2. 30 min wytrącać w -20 ºC.

3. Zwirować prze 30 min na max. obrotach w +4ºC.

4. Odrzucić alkohol, a osad suszyć na wolnym powietrzu.

5. Dodać ogrzanego do 37^oC buforu octanowego dla nukleazy (48μl).

6. Inkubować 15 min. na termo mikserze.

7. Dodać 2μl nukleazy P1.

8. Wymieszać.

9. Inkubować 1h w 37^oC, z wytrząsaniem.

10. Dodać Tris 1M o pH 8,5 (15μl), całość zworteksować.

11. Dodać fosfatazy alkalicznej (5,3μl).

12. Inkubować jak w pkt.9.

13. Wirować 1h, 12500rpm. (wirówka wcześniej schłodzona temp. 4^oC)

14. Na kolumnę HPLC podawać po 20 μl ultrafiltratu, detekcje prowadzić przy ustawieniach aparatu:

4. Analiza wyników pochodzących z detektorów UV-VIS oraz EC.

Detektor ECD (Coulochem III):

• potencjał elektrody osłonowej: 750 mV

• potencjał elektrody ekranującej: 130mV

• potencjał elektrody roboczej: 450mV

-czułość 20nA,

-elektrolit (5% metanol, 100mM octan sodu, pH=5,0)

-prędkość przepływu 1 ml/min

Detektor UV:

• długość fali : 254nm

OPRACOWANIE WYNIKÓW:

Na podstawie uzyskanych chromatografów przygotować krzywe wzorcowe dla syntetycznych nukleozydów dG (UV) i 8-OH-dG (EC). Z uzyskanych widm dla prób biologicznych: K (kontrola), 0h (po naświetleniu UV), 1h (po naświetleniu UV), odczytać w odniesieniu do krzywych kalibracyjnych, ilości badanych nukleozydów. Jako ostateczny wynik podać stosunek cząsteczek oksydowanych do nieoksydowanych w każdej próbie. Wyniki przedstawić na wykresie, omówić przebieg zmian i procesów naprawczych zachodzących na terenie traktowanych promieniowaniem UV komórek nowotworowych.

RAPORT:

W ramach zaliczenia przedmiotu, każdy uczestnik kursu zobligowany jest do przedłożenia indywidualnego raportu z ćwiczeń 3 i 4, które należy zamieścić w przeciągu następnego tygodnia na platformie polsl.pl. Raport powinien zawierać wstęp teoretyczny, opis wykonywanej metodyki, otrzymane wyniki wraz z dyskusją.

---