Danuta Grygierczyk
Aleksander, L. Sieroń

DZIEŃ 1

(Poniedziałek)

Systemy rekombinowane

  Wiele zastosowań inżynierii genetycznej wymaga wektorów odpowiednich do ekspresji genów w komórkach różnych gatunkach eukariota. Wprowadzenie DNA do komórek eukariotycznych nazywa się transfekcją. DNA może wniknąć do komórki roślinnej dopiero po strawieniu ściany komórkowej. W komórkach zwierzęcych, które są pozbawione ściany komórkowej, DNA wnika do nich, po wytrąceniu fosforanem wapnia na powierzchni błony komórkowej. Poddając komórki działaniu prądu o wysokim napięciu, w wyniku tzw. - elektroporacji, można zwiększyć wydajność wnikania DNA do komórek.

Wektory eukariotyczne określane mianem czółenkowych (wahadłowych) zawierają sekwencje potrzebne do replikacji i selekcji, pochodzące z plazmidów bakteryjnych. Właściwość ta umożliwia przygotowanie konstruktów i wcześniejsze sprawdzenie ich w E. coli.

Do klonowania i ekspresji genów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae zastosowano naturalny plazmid drożdżowy, 2μ (dł. 2 μm = 6 kpz). Charakteryzuje się on obecnością początku replikacji, 2 genami biorącymi udział w replikacji i kodującym białko FLP, odpowiedzialne za ukierunkowaną rekombinację. FLP może powodować także inwersję części sekwencji plazmidu 2 μ. Wektory skonstruowane na bazie plazmidu 2μ nazywa się episomalnymi plazmidami drożdżowymi Yeps (Ryc. 8). Zawierają miejsce początku replikacji plazmidu 2μ, sekwencje czółenkowe i gen drożdżowy jako marker selekcyjny (np. gen LEU2 produkujący leucynę).

Komórki roślinne transfekuje się bakteriami Agrobacterium tumefaciens z plazmidem Ti o długości 200 kpz z wbudowanym genem. Podczas infekcji część plazmidu T-DNA włączona zostaje do genomu roślinnego przejawem, czego jest niekontrolowany wzrost rośliny i powstanie guzowatości szyjki korzeniowej (zrakowacenie). Gen odpowiedzialny za zrakowacenie w rekombinowanym plazmidzie Ti w roślinie ulega ekspresji. Za pomocą wektorów czółenkowych można rozbrojony T-DNA (pozbawiony genu) wprowadzić do genomu roślinnego i z transformowanych komórek odtworzyć kompletną transgeniczną roślinę.

Bakulowirus jest wirusem owadzim, stosowanym do uzyskania nadekspresji białek zwierzęcych w komórkach owadzich hodowanych in vitro. Białkiem tym jest poliedryna, która w dużych ilościach gromadzi się w jądrach zainfekowanych komórek. Można, więc na dużą skalę produkować białko pochodzenia zwierzęcego.

SV40 to specjalny wirus, który wprowadza geny do komórek ssaków. Genom tego wirusa ma długość 5,2 kpz i podobne cechy jak fag λ.

Retrowirusy z jednoniciowym RNA, są kopiowane do dwuniciowego DNA (odwrotna transkryptaza) i integrowane do genomu gospodarza w sposób podobny do transpozycji.

W transfekowaniu komórek ssaków i człowieka odpowiednimi wektorami są również, defektywne parwowirusy, Herpes simplex, Vaccinia i Sandbis. Retrowirusy mają zastosowanie w genoterapii, jednak zanim odpowiedni wirus zostanie wybrany jako wektor należy przeanalizować jego działanie uboczne np. patogenność i onkogenność. Najczęściej, więc używane są defektywne retrowirusy.

Klonowanie genów wykorzystuje się do:

a)     identyfikacji genów związanych z procesami chorobowymi (choroby dziedziczne) onkogenów i genów supresorowych

b)    mapowania genomu - określania pozycji genów w chromosomie

c)     sekwencjonowania DNA

d)    badania funkcji białka - enzymu

e)     biotechnologii (produkcja ludzkiej insuliny, hormonu wzrostu)

f)      terapii genowej

g)     uzyskiwania organizmów transgenicznych (genetycznie zmodyfikowanych)

  Komórki owadzie i ssaków

  I.    Komórki Sf9, pochodzące z komórek jajowych Spodoptera frugiperda sąużywane do rozpowszechniania rekombinowanego AcMNPV wirusowego genomu i produkcji rekombinowanych białek. Komórki Sf9 charakteryzują się:

a)     szybkim czasem powielania (18-24 godz.) w mieszaninie buforowej Gresa

b)    odpowiednim wzrostem kultur, zatrzymanych w rozwoju w celu otrzymania wysokiej produkcji białka zrekombinowanego.

  II.      Komórki SF21 pochodzące od tego samego gatunku co Sf9 są polecane do uzyskiwania wysokiego poziomu produkcji rekombinowanych białek. Komórki te charakteryzują się wyższym poziomem ekspresji niektórych białek zależnie od większych rozmiarów komórki oraz odpowiednim wzrostem zatrzymania komórek w interfazie.

 III.   System ekdyzonowy.

W systemie tym używane są 2 wektory: pVgRXR oraz drugi zbudowany na bazie pIND. PVgRXR wyznacza podjednostki receptorowe dla RXR i VgEcR, które powodują interakcję między formą i funkcją receptorą ekdyzonowego. Zastosowanie 2 wektorów powoduje specyficzne przeznaczenie ich do maksymalnego zwiększenia poziomu indukcji genowej.

IV.  Wbudowanie DNA do komórek ssaków różnego typu jest procesem skomplikowanym. Trzeba uzyskać odpowiednie linie komórkowe by proces ekspresji genu odpowiedzialnego za produkcję białka był wydajny. Stosuje się linie komórkowe MEL, ponieważ w komórkach HeLa ekspresja genu przebiega na niskim poziomie. Komórki MEL używa się do badań nad mechanizmem indukcji.

Obecnie stosuje się 4 techniki mające na celu wbudowanie DNA do komórek ssaków za pomocą kolistego DNA plazmidowego:

1.     Transfekcja przy udziale fosforanu wapnia

2.     DEAE dekstran

3.     Elektroporacja

4.     Liposom jako medium transfekcyjne

   

Schemat stosowania wektorów w systemie ekdyzonowym

do syntezy białka zrekombinowanego

1

---