Barbara Matyśkiewicz

grupa 7 zootechnika

Replikacja, translacja i transkrypcja DNA

NAJWAŻNIEJSZE INFORMACJE:

Właściwośći,rola i działanie.

Kod genetyczny

To zasada, reguła, według której informacja genetyczna, zawarta w sekwencji nukleotydów kwasu nukleinowego (DNA lub RNA), w komórkach wszystkich organizmów może ulegać "tłumaczeniu" na kolejność (sekwencję) aminokwasów w ich białkach (w procesie biosyntezy białek czyli translacji).

Kod ten ma następujące właściwości:

1. Jednej trójce nukleotydów odpowiada jeden aminokwas (triplet, inaczej kodon) w DNA lub RNA. Kod genetyczny jest więc kodem trójkowym.

2. Prawie wszystkie aminokwasy mogą być zakodowane na kilka sposobów, tj. przez kilka różnych kodonów, różniących się na ogół tylko trzecim nukleotydem. Np. lizyna kodowana jest zarówno przez kodon AAA, jak i AAG. Dzięki temu część zmian informacji genetycznej w wyniku mutacji nie znajduje swojego odbicia w sekwencji aminokwasów. Kod genetyczny jest więc zdegenerowany.

3. Każdy nukleotyd w obrębie sekwencji kodujących wchodzi w skład jakiegoś kodonu i tylko jednego kodonu - kod genetyczny jest bezprzecinkowy.

4. Ponadto kodony nie zachodzą na siebie - np. biorąc pod uwagę powyższe dane, cząsteczka AAGAAA koduje sekwencję dwupeptydu lizylolizyny. Taki sam dwupeptyd może być zakodowany jako AAAAAA.

5. Trzem kodonom (UAA, UAG i UGA) nie odpowiadają żadne aminokwasy. Kodony te, zwane nonsensownymi albo kodonami STOP, kodują polecenie przerwania biosyntezy peptydu (białka). Jeśli więc powyższa sekwencja miałaby oznaczać końcowy odcinek jakiegoś białka to mogłaby mieć postać AAAAAAUAA, gdzie UAA jest kodonem STOP (w mRNA; jego odpowiednikiem w DNA jest TAA).

6. Powyższe zasady są przestrzegane dość dokładnie przez układy biosyntezy białek u wszystkich organizmów - kod genetyczny jest uniwersalny, jakkolwiek zdarzają się niewielkie odstępstwa od tej prawidłowości wśród wirusów, bakterii, pierwotniaków, grzybów i w mitochondriach ^[1]. Na przykład kodon UAA odczytany przez rybosomy mitochondriów powoduje nie zakończenie syntezy białka (jak to ma miejsce w rybosomach cytoplazmy podstawowej i siateczki śródplazmatycznej), ale dobudowanie do niego tryptofanu; natomiast kodon UGA zamiast przerwania translacji może powodować dołączenie selenocysteiny (wymagane jest do tego występowanie w mRNA dodatkowego sygnału, tzw. SECIS), a kodon UAG - dobudowanie pirolizyny (ang. pyrrolysine) do tworzącego się łańcucha polipeptydowego (białka).

Model DNA, nośnika genów

Zachodzące w procesie translacji dopasowanie kodonu w mRNA z odpowiadającym mu antykodonem w tRNA (cząsteczce dostarczającej aminokwas) nie zawsze musi być idealne. Zgodnie z zasadą tolerancji (hipotezą tolerancji) zawsze musi być zachowana jedynie zgodność (komplementarność) pomiędzy dwoma pierwszymi nukleotydami kodonu i antykodonu. Na ostatniej pozycji kodonu dopuszczalne jest czasami wiązanie tRNA przez nukleotyd niekomplementarny. Na przykład zarówno adenina, jak i cytozyna na trzeciej pozycji kodonu mogą tworzyć parę z uracylem w antykodonie. Tak więc ta sama cząsteczka tRNA, połączonego z aminokwasem, czyli tworzącego aminoacylo-tRNA może przyłączać się do kilku kodonów, choć zawiera tylko jeden antykodon.

Cząsteczki tRNA, różniące się sekwencją i kodowane przez odrębne geny, ale przenoszące taki sam aminokwas nazywamy cząsteczkami izoakceptorowymi. Im więcej jest w komórce genów kodujących jakiś wariant izoakceptorowego tRNA, tym więcej jest tego typu cząsteczek w tej komórce. Różne warianty izoakceptorowego tRNA występują więc w różnych stężeniach. Regułą jest, że komórki kodują białka ulegające najszybszej translacji przy pomocy kodonów rozpoznawanych przez najliczniejsze warianty izoakceptorowego tRNA. Rozkład częstości poszczególnych form tRNA i ich preferowanych kodonów u różnych organizmów jest różny, może to utrudniać doskonalenie organizmów metodami inżynierii genetycznej - obcy gen w komórkach organizmu biorcy może wykazywać niższą lub wyższą aktywność niż to przewidywał eksperymentator.

Replikacja DNA

To proces, w którym podwójna nić DNA (podwójna helisa) ulega skopiowaniu. Replikacja jest semikonserwatywna (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa. Nie licząc niewielkiego prawdopodobieństwa (ok. 1 błąd na 10⁹ nukleotydów, dla porównania błąd transkrypcji - 1 na 10⁴) wystąpienia błędu obie cząsteczki DNA będą identyczne.

Substratami tego procesu są:

• matryca DNA;

• trifosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP);

• ATP - energia dla helikaz.

W procesie tym stwierdzono wiele aktywności enzymatycznych (udział enzymów) tj.:

• helikazy - rozrywają wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA, rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu;

• prymaza - syntetyzuje starter;

• polimerazy DNA - polimeryzuje zgodnie z zasadą komplementarności fosforany deoksyrybonukleotydów;

• egzonukleaza - usuwa startery RNA z nici;

• ligaza DNA - uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie nowo-zsyntezowanej nici DNA;

• różne enzymy pomocnicze.

Zasady replikacji są podobne u wszystkich organizmów, przy czym największe różnice występują między bakteriami z jednej strony, a archeowcami i eukariontami z drugiej.

U bakterii replikacja zaczyna się w ustalonym miejscu i postępuje bardzo szybko, z prędkością rzędu 1000 nukleotydów na sekundę. U eukariotów replikacja jest o wiele wolniejsza, ok. 50 nukleotydów na sekundę, jednak zachodzi równocześnie w wielu miejscach.

Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntetyzuje nową nić w kierunku od 5' do 3'). Z tego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły, druga (ta, którą chcielibyśmy zsyntezować w przeciwną stronę) fragmentami (tzw. fragmenty Okazaki).

Schemat replikacji DNA

Szczegóły procesu

Kopiowanie podwójnej helisy DNA jest procesem złożonym. Proces dzieli się na fazy inicjalizacji, elongacji (wydłużania) i terminacji. W kolistych cząsteczkach DNA replikacja rozpoczyna się w miejscu inicjacji, o długości ok. 200-300 par nukleotydów. Miejsce to oznacza się skrótem ori od ang. origin. W liniowych chromosomach aktywnych przebiegać może wiele (tysiące) jednoczesnych procesów replikacji. Aby replikacja przebiegła prawidłowo, podczas rozdzielenia obu nici nie może dojść do zaburzenia ich struktury podstawowej (I-rzędowej). Muszą także zostać spełnione następujące warunki:

• matryca DNA musi zostać dokładnie odczytana,

• dostępna musi być odpowiednia ilość wolnych nukleotydów,

• podczas procesu musi zostać zachowana komplementarność nici.

Na koniec musi dojść do terminacji replikacji, ewentualnego uzupełnienia braków na końcu nowo powstałego łańcucha i połączenia nowego łańcucha z łańcuchem macierzystym w helisę. U bakterii zakończenie replikacji następuje niemal automatycznie (po skopiowaniu całego kolistego DNA, który jest pojedynczym replikonem). U eukariotów miejsc replikacji (replikonów) jest wiele. Terminacja replikacji następuje w momencie ukończenia procesów przebiegających jednocześnie w różnych miejscach replikujących się cząsteczek DNA. Do terminacji dochodzi, gdy widełki replikacyjne replikonu natkną się na specjalną sekwencję terminacyjną. Proces replikacji niekolistych (eukariotycznych) cząsteczek DNA wiąże się z problemem wolnych zakończeń powstających cząsteczek DNA. Zakończenia te, zwane telomerami składają się z krótkich wielokrotnie powtórzonych sekwencji. Replikazy wydłużają jedynie istniejące już nici, nie są natomiast w stanie zsyntetyzować końcowych odcinków telomerów. W rezultacie odcinki te narażone są na regularne skracanie. Skracaniu temu zapobiega obecność telomerazy, która przeprowadza odwrotną transkrypcję tych odcinków, posługując się jako "matrycą" nie DNA, ale RNA, będącym częścią składową tego enzymu. Zapobiega to usunięciu znaczących fragmentów DNA.

Grupa białek rozwijających widełki replikacyjne to prymosom

Różnice między grupami organizmów

Replikacja DNA u bakterii oraz archea i eukariotów (które prawie zawsze mają takie same mechanizmy przetwarzania informacji) różni się w istotny sposób. Nie wszystkie enzymy uczestniczące w tym procesie są uważane za homologiczne, co może sugerować, że u ich ostatniego uniwersalnego wspólnego przodka proces replikacji DNA był tylko częściowo wykształcony.

Replikacja RNA

To proces powielania cząsteczek RNA zawierających informację genetyczną. Występuje tylko u niektórych wirusów. Należy odróżnić go od procesu powielania się retrowirusów (np. wirusa HIV), gdzie podczas powstania nowych cząsteczek RNA obecne jest pośrednie stadium przepisywania informacji genetycznej na DNA. W procesie tym bierze udział enzym replikaza RNA, czyli polimeraza RNA zależna od RNA.

Replikacja semikonserwatywna

Sposób replikacji cząsteczki DNA; w nowej cząsteczce DNA (po replikacji) jedna nić pochodzi ze starej cząsteczki DNA, a druga (nowa) nić jest dobudowana na zasadzie komplementarności. Synteza nowych nici może zachodzić tylko z udziałem nici rodzicielskich, służących jako matryce. W procesie tym wykorzystuje się zdolność zasad azotowych, wchodzących w skład nukleotydów, do tworzenia komplementarnych par. Dzięki tej właśnie własności wystarczy rozplątać podwójną helisę DNA, następnie do uwolnionych w ten sposób nici dobudować komplementarne nukleotydy, aby otrzymać dwie identyczne cząsteczki DNA (każda z otrzymanych w ten sposób cząstek będzie miała jedną nić rodzicielską i jedną dosyntetyzowaną na nowo). We wszystkich organizmach replikacja DNA jest zawsze semikonserwatywna, co udowodniono, stosując metodę znakowania DNA różnymi izotopami.

Replikacja DNA jest procesem zapewniającym przekazywanie informacji genetycznej z komórek rodzicielskich do komórek potomnych w sposób prawie doskonały. Doskonałość ta jest uzyskiwana nie tylko dzięki precyzyjnemu mechanizmowi samej replikacji, lecz również za sprawą systemów ochronnych, zdolnych do wykrywania i naprawy błędów. Dzięki tym systemom błędy powstałe w procesie replikacji pojawiają się najwyżej raz na miliard nukleotydów.

Bez względu na to, czy komórka ma tylko jeden chromosom, czy też ma ich wiele, DNA ulega replikacji zawsze tylko jeden raz na każdy cykl podziałowy.

Aby dobudować komplementarną nić DNA musi zadziałać cały kompleks różnych enzymów. Pierwsze, helikaza DNA rozbija wiązania wodorowe pomiędzy zasadami azotowymi, przez co powstają dwie odrębne nici, które będą stanowiły matryce przy dobudowywaniu nowych nukleotydów. Kolejnym enzymem jest prymaza. Syntetyzuje ona krótkie, zaledwie 10 nukleotydowe odcinki RNA, które nazywamy starterami. Potrzebne one są, by kolejny enzym, polimeraza DNA, mógł dobudowywać kolejne nukleotydy (w kierunku od 5' do 3'). Ponieważ nici DNA są antyrównoległe, jedna nić będzie rozbudowywana w sposób ciągły i będzie to nić wiodąca, druga natomiast fragmentami - nić opóźniona. Każdy taki fragment nazwano fragmentem Okazaki. Kiedy polimeraza skończy dobudowywać nukleotydy, kolejny enzym-nukleaza musi usunąć niepotrzebne już startery. Fragmenty Okazaki łączone są ze sobą przez enzym ligazę.

Mówiąc o replikacji należy wprowadzić pojęcie replikonu. Replikon jest to jednostka replikacji, za którą przyjęto uważać odcinek DNA, zawierający miejsce startu oraz przylegające sekwencje uczestniczące w kontroli tego procesu.

W procesie replikacji można wyróżnić trzy zasadnicze etapy:

• inicjację (jest to początek procesu. Miejsce o specjalnej sekwencji nukleotydów mierzy ok 200-300 par nukleotydów; tu przyłącza się białko inicjatorowe i działają helikazy w celu rozdzielenia obu nici-powstają widełki replikacyjne, przesuwające się z prędkością 1000-3000 nukleotydów na minutę),

• elongację (jest to proces wstawiania nowych nukleotydów na zasadzie komplementarności czyli syntezy nowych nici DNA w sposób ciągły na nici skierowanej do poruszających się widełek replikacyjnych i nieciągły - tzw. fragmenty Okazaki - na nici drugiej),

• terminację (brakujące odcinki są uzupełniane prze polimerazę DNAa połączenie nukleotydów w ciągłą nić katalizowane jest przez ligazy DNA)

Podział komórki - proces zachodzący u wszystkich żywych organizmów, w którym komórka macierzysta dzieli się na dwie lub więcej komórek potomnych. Najpierw następuje podział jądra komórkowego poprzez mitozę, mejozę lub amitozę. Po podziale jądra dzieli się cytoplazma - cytokineza. Podział komórkowy jest jedną z faz cyklu komórkowego.

Podział komórki może być uważany za formę rozmnażania. Prosty podział komórki (monotomia) jest pospolity u organizmów jednokomórkowych i prowadzi do powstania dwóch identycznych jak komórka macierzysta organizmów potomnych, które przed rozpoczęciem podziałów dorastają wielkości komórki macierzystej. Ten typ rozmnażania spotyka się u bakterii, sinic, glonów, grzybów i pierwotniaków. Tylko niektóre komórki zachowują zdolność do podziału inne są wyspecjalizowane i nie dzielą się.

Transkrypcja

W genetyce oznacza proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA. Inaczej - przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA.

Matryca jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a nowa cząsteczka RNA powstaje w kierunku 5' → 3'. Transkrypcję można podzielić na trzy etapy:

• inicjację

• elongację

• terminację

Transkrypcji podlega odcinek DNA od promotora do terminatora. Nazywamy go jednostką transkrypcji.

Podczas transkrypcji polimeraza RNA buduje cząsteczkę RNA łącząc zgodnie z zasadą komplementarności pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA.

Transkrypcja u prokariota

Inicjacja transkrypcji u prokariontów polega na związaniu się polimerazy RNA z odpowiednim odcinkiem pasma matrycowego DNA - tzw. promotorem. Polimeraza rozpoznaje sekwencje -35 i -10 promotora (a transkrypcja zaczyna się od nukleotydu +1). Specyficzność wiązania zapewnia czynnik σ (sigma). Rozsunięcie nici DNA na odcinku kilkunastu nukleotydów (czyli powstanie tzw. kompleksu otwartego) umożliwia wstawianie (włączenie) kolejnych, odpowiednich nukleotydów. Substratami są trifosforany rybonukleozydów (ATP, GTP, CTP i CTU i UTP). Transkrypcja zaczyna się od produkcji kilku krótkich (kilka nukleotydów) transkryptów. Dopiero po oddysocjowaniu czynnika σ może rozpocząć się kolejny etap - elongacja transkrypcji (wydłużanie RNA). Polimeraza RNA przesuwa się systematycznie wzdłuż helisy DNA, rozplatając ją (na odcinku kilkunastu par zasad) i wydłużając łańcuch RNA, przy czym nukleotydy włączane są zgodnie z zasadą komplementarności. Powyżej aktualnego miejsca syntezy powstający hybrydowy kompleks DNA - RNA ulega rozpadowi, DNA powraca do swojej pierwotnej dwuniciowej struktury, a łańcuch powstającego mRNA oddziela się. Etap elongacji kończy się, gdy polimeraza RNA dotrze do terminatora - sekwencji kończącej, wyznaczającej miejsce terminacji (zakończenia) transkrypcji. Sekwencja taka tworzy strukturę szpilki do włosów (hairpin), która zatrzymuje polimerazę RNA, co powoduje rozpad kompleksu enzym - DNA - RNA. Drugim mechanizmem terminacji wykorzystywanym przez bakterie jest terminacja rho-zależna, gdzie do terminacji transkrypcji potrzebne jest działanie czynnika rho (ρ). Transkrypt prokariotyczny nie wymaga dalszej obróbki, a translacja rozpoczyna się, zanim transkrypcja dobiegnie końca.

Transkrypcja u eukariotów

U eukariontów występuje kilka rodzajów polimeraz RNA, w tym zbudowane z wielu podjednostek polimerazy RNA działające w jądrze komórkowym oraz specyficzne dla mitochondriów i chloroplastów polimerazy RNA, które budową przypominają polimerazy RNA prokariontów. Różne jądrowe polimerazy RNA biorą udział w transkrypcji różnych klas RNA. Polimeraza RNA II (Pol II) syntetyzuje pre-mRNA i większość snRNA, polimeraza RNA I (Pol I) transkrybuje część rRNA, a polimeraza RNA III (Pol III) odpowiada za syntezę tRNA, 5S rRNA i innych małych jądrowych RNA.

W przeciwieństwie do polimerazy RNA bakterii, jądrowe polimerazy RNA organizmów eukariotycznych potrzebują do rozpoczęcia transkrypcji zestawu właściwych dla danej polimerazy podstawowych czynników transkrypcyjnych, ponieważ rozpoznają nie sekwencję promotora, ale kompleks kwas nukleinowy-białko. Sterowanie transkrypcją - przez związanie czynników białkowych czy hormonalnych - może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mogą leżeć w obrębie genów (promotory), lub też w odległości kilku tys. nukleotydów (enhancery, silencery). Pierwszym etapem transkrypcji jest powstanie kompleksu preinicjacyjnego (PIC) składającego się z ogólnych czynników transkrypcyjnych, który wiąże się z sekwencją promotora. Na dostępność miejsc wiązania się czynników transkrypcyjnych wpływa struktura (upakowanie) chromatyny. Należy jednak zaznaczyć, że białka remodelujące chromatynę mogą wpływać na jej strukturę przed, w trakcie i po powstaniu PIC.

Wiele promotorów genów transkrybowanych przez jądrową polimerazę RNA II zawiera sekwencję TATA (ang. TATA box) położoną ok. -25 par zasad przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Sekwencja ta jest rozpoznawana przez białko TBP (ang. TATA-box binding protein), które staje się zalążkiem kompleksu preinicjacyjnego. Drugą sekwencją rozpoznawaną przez ogólne czynniki transkrypcyjne jest sekwencja otaczająca miejsce startu transkrypcji (+1). Polimeraza RNA II wiąże się do kompleksu preinicjacyjnego i rozpoczyna transkrypcję. Do inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo konieczny jest też kompleks białkowy zwany Mediatorem. W regulacji transkrypcji u eukariontów mogą brać udział także inne czynniki transkrypcyjne wiążące się z sekwencjami enhancerów i silencerów, często położone w znacznej odległości od miejsca inicjacji transkrypcji. Do rozpoczęcia transkrypcji przez polimerazę RNA I i III potrzebne są inne sekwencje oraz zestaw ogólnych czynników transkrypcyjnych specyficznych dla tych polimeraz.

Następny etap transkrypcji to elongacja. Polimeraza RNA przesuwa się dalej, a ogólne czynniki transkrypcyjne są uwalniane. Terminacja transkrypcji nie wymaga białek uwalniających, a jej sygnały są inne, niż u prokariontów. Zaproponowano dwa modele terminacji transkrypcji u eukariotów. Według pierwszego po transkrypcji miejsca poliadenylacji w polimerazie zachodzi zmiana konformacji, która ułatwia terminację transkrypcji. Według drugiego modelu w terminacji transkrypcji bierze udział trawiąca RNA egzonukleaza, która przecina cząsteczkę mRNA, a następnie niszczy ten fragment RNA, który ciągle jest związany z polimerazą.

Transkrypt jest komplementarny do nici matrycowej i homologiczny z nicią kodującą. Należy jednak pamiętać, że jakkolwiek homologami G, C i A w pre-mRNA są rybonukleotydy niosące te same zasady azotowe, to homologiem T jest rybonukleotyd zawierający uracyl (U) a nie tyminę.

Porównanie sekwencji pre-mRNA z sekwencjami nici kodującej i matrycowej genu:

• 1) 5'- A A T C G G C A T G C C A T G G C C T T G C G C T A - 3' Gen

• 2) 3'- T T A G C C G T A C G G T A C C G G A A C G C G A T - 5'

• 3) 5'- A A U C G G C A U G C C A U G G C C U U G C G C U A - 3' pre-mRNA

1 - nić kodującą 2 - nić matrycową 3 - transkrypt

Należy pamiętać, że informacje o strukturze (budowie) kodowanego białka zawarte są jedynie we fragmentach genu zwanych egzonami, natomiast introny to fragmenty będące najczęściej nic nie znaczącymi wtrętami (są usuwane przed zajściem translacji.

Obróbka posttranskrypcyjna

Taki pierwotny transkrypt - pre-mRNA - musi jednak zostać poddany obróbce posttranskrypcyjnej, aby można go było wykorzystać do translacji. W przeciwnym wypadku mRNA po wydostaniu się z jądra zostałoby zniszczone w cytozolu przez białka, których zadaniem jest niszczenie kwasów nukleinowych. Jest to obrona przed dostaniem się do komórki obcego kwasu nukleinowego np. wirusa. Aby mRNA był rozpoznawany jako "swój" ma miejsce obróbka posttranskrypcyjna. Polega ona na:

• Dołączeniu czapeczki guanylowej na 5'-końcu mRNA. Czapeczka guanylowa to nietypowy nukleotyd (7-metyloguanozyna). Umożliwia odnalezienie "fabryki białkowej" w cytozolu. Ten etap obróbki odbywa się równocześnie z transkrypcją.

• Dołączeniu ogonka poliA na 3'-końcu mRNA. Ogonek poliA jest krótką nicią złożoną z kilkudziesięciu nukleotydów z adeniną. Dzięki temu mRNA jest rozpoznawana jako własny, a nie obcy kwas nukleinowy. Niektóre wirusy, np. wirus grypy potrafią dołączać do swoich nici mRNA ogonek poliA, przez co nie są zabijane w cytozolu.

• Splicingu, czyli usuwaniu intronów.

• Edycji RNA.

Translacja

W biologii molekularnej translacja (łac. translatio - tłumaczenie) to proces syntezy łańcucha polipeptydowego białek na matrycy mRNA. W jego wyniku dochodzi do ostatecznego przetłumaczenia informacji genetycznej zawartej pierwotnie w kodzie genetycznym DNA na konkretną strukturę białka, zależną od uszeregowania aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.

Translacja jest drugim (po transkrypcji) procesem w biosyntezie białka. Powstawanie łańcucha polipeptydowego sterowane jest przez sekwencję mRNA. Translacja odbywa się w cytoplazmie lub na błonach szorstkiej siateczki wewnątrzplazmatycznej. Proces ten jest katalizowany przez rybosom obejmujący podjednostkami przesuwającą się nić mRNA. Rybosomy składają się z dwóch podjednostek, większej i mniejszej, które są zbudowane z białek i rRNA, a funkcję katalityczną pełnią enzymy (rybozymy) zawarte w dużej podjednostce rybosomu. Translacja na jednej cząsteczce mRNA może być prowadzona przez wiele rybosomów równocześnie. Taki kompleks mRNA związanego z wieloma rybosomami nazywa się polisomem lub polirybosomem.

Translacja składa się z czterech faz:

• aktywacji

• inicjacji

• elongacji

• terminacji

W aktywacji właściwy aminokwas jest dołączany do właściwego tRNA za pomocą wiązania estrowego, powstałego przez reakcję grupy karboksylowej aminokwasu i grupy OH przy końcu 3' tRNA. Taki zespół określa się mianem aminoacylo-tRNA. Inicjacja translacji ma miejsce, kiedy mała podjednostka rybosomu przyłącza się do końca 5' mRNA. Do małej podjednostki przyłącza się duża podjednostka rybosomu. Na podjednostce 50s uaktywniają się dwa miejsca: P - miejsce peptydowe i A - miejsce akceptorowe. Pierwszy aminoacylo-tRNA ustawia się w miejscu P. Elongacja ma miejsce, kiedy następny aminoacylo-tRNA przyłącza się do rybosomu w miejscu A. Następnie proces translacji zachodzi na zasadzie komplementarności kodonu mRNA z antykodonem na tRNA. Rybosom i tRNA są tak ukształtowane, aby dwa aminokwasy, przyłączone do tRNA zajmujące w rybosomie miejsca A i P znajdowały się blisko siebie. Dzięki temu zachodzi reakcja między resztą aminową i karboksylową - dwa aminokwasy łączą się. Ten proces - tworzenie wiązań peptydowych jest katalizowany przez peptydylotransferazę - rybozym (rRNA) wchodzący w skład rybosomu. Po syntezie, tRNA szybko zwalnia miejsce P i wraca do cytoplazmy, z kolei aminoacylo-tRNA ulega przesunięciu z miejsca A na miejsce P. Proces ten nazywamy translokacją. Jednocześnie przesuwa się także mRNA. Wielkość tego przesunięcia wynosi zawsze trzy nukleotydy. Na miejsce A nasuwa się nowy tRNA zawierający antykodon odpowiadający kolejnemu kodonowi na mRNA. Proces elongacji powtarza się aż do napotkania przez podjednostkę mniejszą rybosomu w miejscu A kodonu stop (UAA, UAG lub UGA). Tych trójek kodonowych, w normalnych warunkach, nie koduje żaden tRNA. W tym momencie następuje terminacja translacji. Łańcuch polipeptydowy zostaje uwolniony do cytoplazmy, tRNA zostaje oddzielone od mRNA, a rybosom rozpada się na podjednostki, które mogą zostać ponownie wykorzystane do inicjacji translacji kolejnego mRNA.

Translacja u Prokariota

U organizmów prokariotycznych inicjacja translacji wymaga małej i dużej podjednostki rybosomu, czynników inicjacji translacji, GTP jako źródła energii, oraz inicjatorowego aminoacylo-tRNA (ze związanym aminokwasem formylometioniną). Mała podjednostka rybosomu wiąże się z czynnikiem inicjacji translacji IF3. 16S rRNA z małej podjednostki rybosomu 30S rozpoznaje i wiąże komplementarną sekwencję Shine-Dalgarno w mRNA. Czynnik inicjacji translacji IF2 wiąże się z fMet-tRNA i pomaga mu związać się z małą podjednostką rybosomu. W rybosomie są trzy miejsca, w których może znajdować się tRNA: miejsce A, przez które wchodzi aminoacylo-tRNA (z wyjątkiem pierwszego aminoacylo-tRNA - fMet-tRNA, które wchodzi przez miejsce P), miejsce P, gdzie tworzy się peptydylo-tRNA, oraz miejsce E, przez które tRNA opuszcza rybosom po oddaniu aminokwasu. Aminoacylo-tRNA (fMet-tRNA) znajdujące się w miejscu P rybosomu rozpoznaje kodon inicjujący AUG. Inicjacja kończy się przyłączeniem dużej podjednostki rybosomu i uwolnieniem czynników inicjacji translacji.

Po wejściu fMet-tRNA do miejsca P miejsce A otwiera się i umożliwia związanie się kolejnego aminoacylo-tRNA. W tym wiązaniu bierze udział czynnik elongacji translacji EF-Tu. W ten sposób rozpoczyna się elongacja. Rosnący polipeptyd odłącza się od tRNA w miejscu P, a między ostatnim aminokwasem a aminokwasem przyłączonym do tRNA w miejscu A tworzy się wiązanie peptydowe. Reakcja ta jest katalizowana przez rybozym peptydylotransferazę - 23S rRNA w podjednostce 50S rybosomu. Rybosom przesuwa się o trzy nukleotydy na nici mRNA, z którą są związane tRNA. Dzięki temu polipeptyd przesuwa się z miejsca A do miejsca P, a nienaładowane tRNA trafia do miejsca E. Powstające białko wysuwa się z rybosomu przez otwór w dużej podjednostce. Elongacja trwa, dopóki rybosom nie natrafi na jeden z kodonów STOP w mRNA.

Kiedy kodon STOP znajdzie się w miejscu A rybosomu, następuje terminacja translacji. Kodony STOP nie są rozpoznawane przez żadne tRNA, tylko przez czynniki uwalniające, które są odpowiedzialne za hydrolizę wiązania estrowego peptydylo—tRNA i uwolnienie nowo powstałego białka z rybosomu. U Prokaryota za proces terminacji translacji odpowiedzialne są dwa czynniki — RF1 i RF2. Czynnik RF1 rozpoznaje kodony UAA i UAG, a RF2 rozpoznaje kodony UAA i UGA^[1].

Po terminacji mRNA i tRNA są uwalniane z rybosomu, a on sam dysocjuje na podjednostki, które mogą zostać ponownie wykorzystane do inicjacji translacji kolejnego mRNA.

Translacja u Eukariota

U organizmów eukariotycznych inicjacja translacji może przebiegać na dwa sposoby.

Pierwszy z nich to inicjacja zależna od czapeczki. Złożony z czynników inicjacji translacji eIF4E, eIF4G i eIF4A kompleks eIF4F wiąże się z czapeczką i z białkiem PABP wiążącym ogon poli-A. Mała podjednostka rybosomu 40S wiąże eIF1, eIF3, eIF5 i kompleks eIF2-GTP-Met-tRNAi. Następnie eIF3 wchodzi w interakcje z eIF4G związanym z czapeczką. Taki kompleks inicjacyjny zaczyna przesuwać się wzdłuż cząsteczki mRNA w kierunku od 5' do 3', aż natrafi na kodon start AUG. Wtedy następuje uwolnienie niektórych czynników i związanie się dużej podjednostki rybosomu 60S z małą. Powstaje funkcjonalny rybosom i rozpoczyna się elongacja.

Inicjacja niezależna od czapeczki u eukariotów nie wymaga wędrówki rybosomu od czapeczki do kodonu start. Czynniki ITAF umożliwiają małej podjednostce rybosomu 40S związanie się z sekwencją IRES (ang. internal ribosome entry site - wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu). Sekwencje IRES występują m. in. w genach ulegających ekspresji pod wpływem czynników stresowych. Można je znaleźć także u wirusów.

U Eukaryota występuje tylko jeden czynnik terminacyjny eRF1^[1].

Kwasy rybonukleinowe-RNA

RNA - polimery kondensacyjne rybonukleotydów, występujące zarówno w jądrze komórkowym, jak i w cytoplazmie. Nukleotydy połączone są typowym dla kwasów nukleinowych wiązaniem fosfodiestrowym. W komórce występuje wiele klas kwasów rybonukleinowych różniących się pełnioną funkcją, a także masą cząsteczkową i strukturą, m.in.:

• informacyjne zwane matrycowymi (mRNA)

• rybosomowe (rRNA)

• transferowe (tRNA)

• heterogenne jądrowe (hnRNA lub Pre-mRNA) - głównie produkty transkrypcji DNA i przetwarzania surowego transkryptu do mRNA

• antysensowne RNA albo interferencyjne RNA (siRNA i miRNA) - produkowane w celu precyzyjnej regulacji ekspresji genów kodujących białka (za pomocą mechanizmu wspólnego lub bardzo zbliżonego do systemu zwalczania wirusów RNA)

• małe cytoplazmatyczne (scRNA)

• małe jądrowe (snRNA) pełniące funkcje enzymatyczne przy wycinaniu intronów z transkryptów

RNA jest zazwyczaj jednoniciowy; postać dwuniciowa, analogiczna do dwuniciowego DNA, występuje głównie jako materiał genetyczny niektórych wirusów i wiroidów (porównaj też Retrowirusy). Jednak w wypadku cząsteczek jednoniciowych, szczególnie pełniących funkcje enzymatyczne, lub współdziałających w tych funkcjach (np. rRNA, tRNA) tworzenie fragmentów dwuniciowych przez parowanie różnych odcinków tej samej nici decyduje o strukturze całej cząsteczki.

Ułożenie zasad azotowych w RNA nie jest dowolne. Ich kolejność jest lustrzanym odbiciem kolejności ułożenia zasad azotowych w jednej z nici DNA.

W przypadku wirusów RNA zawierających pojedynczą nić kwasu nukleinowego można mówić o polarności nici. Nić o dodatniej polarności to taka, która może pełnić funkcję mRNA, zaś nić o ujemnej polaryzacji to taka, która jest komplementarna do mRNA.

rRNA

Rybosomalny, rybosomowy RNA (z ang. Ribosomal RNA). Cząsteczki kwasu rybonukleinowego wchodzące w skład rybosomów, które biorą udział w procesie biosyntezy polipeptydów.

rRNA powstaje w wyniku procesu transkrypcji DNA. U organizmów eukariotycznych za jego transkrypcję odpowiada polimeraza RNA I (pol I). Wyjątkiem jest 5S rRNA transkrybowany przez polimerazę RNA III (pol III). rRNA występuje w rybosomach, a u eukariontów także w jądrze komórkowym (gł. w jąderku, gdzie odbywa się jego synteza). Jego struktura przestrzenna jest bardzo rozbudowana, tworzy go 100-4500 nukleotydów. W jego budowie występują zarówno fragmenty dwuniciowej spirali jak i łańcuchów jednoniciowych. rRNA stanowi ok. 80% całkowitego RNA komórki. Rybosomalny RNA występuje w kilku rodzajach (najczęściej trzech u prokariontów i czterech u eukariontów). U prokariontów mała podjednostka rybosomu zawiera 16S rRNA, a duża 5S i 23S rRNA. U eukariontów mała podjednostka rybosomu zawiera 18S rRNA, a duża 5S, 5.8S i 28S rRNA.

Rybosomalnym RNA towarzyszą w rybosomach liczne białka rybosomowe.

rRNA jest rybozymem. Katalityczna aktywność rybosomu związana jest właśnie z zawartym w nim rRNA, natomiast białka budują strukturę rybosomu i działają jako kofaktory zwiększające wydajność translacji.

tRNA

Transportujący, transferowy RNA (z ang. transfer RNA) - cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), których zadaniem jest przyłączanie wolnych aminokwasów w cytoplazmie i transportowanie ich do rybosomów, gdzie w trakcie procesu translacji zostają włączone do powstającego łańcucha polipeptydowego. tRNA cechuje wysoka specyficzność w stosunku do aminokwasów. Każdy z aminokwasów syntetyzowanego białka może być transportowany przez jeden, a niektóre przez kilka różnych tRNA. Cząsteczki tRNA występują w komór­kach w stanie wolnym bądź też związane ze specyficznym aminokwasem. Kompleks tRNA-aminokwas nosi nazwę aminoacylo-tRNA.

W każdej komórce organizmu znajduje się przynajmniej 20 rodzajów cząsteczek tRNA i przynajmniej jedna odpowiada swoistemu aminokwasowi. U człowieka są 22 geny mitochondrialne kodujące tRNA i około 500 funkcjonalnych genów tRNA w genomie jądrowym. U organizmów eukariotycznych za transkrypcję genów kodujących tRNA odpowiada polimeraza RNA III.

Cząsteczki tRNA zbudowane są z ok. 74 do 95 nukleotydów. W skład cząsteczki wchodzą również zmodyfikowane zasady azotowe (pseudourydyna i dihydrourydyna).

Wzór strukturalny tRNA ma budowę palczastą i przyjmuje kształt czterolistnej koniczyny w którym można wyróżnić 4 ramiona. Każde z tych ramion pełni inną funkcję:

• ramię DHU - struktura spinki z dihydroksyuracylem (nukleotyd nietypowy dla RNA), zawiera informację jaki rodzaj aminokwasu może być przyłączony do danego tRNA,

• ramię akceptorowe - sparowane zasady końców 3' i 5', oprócz końca CCA-3' niesparowanego, do którego przyłączają się chemicznie aktywowane aminokwasy za pomocą wiązania estrowego,

• ramię zmienne - tylko w niektórych tRNA

• ramię Tψc - rybotymidowe, psi to modyfikowana zasada zwana pseudouracylem. Ramię służy do łączenia się z rybosomem i umocowania tRNA na matrycy

• pętla antykodonowa - odpowiedzialna za rozpoznanie i związanie z kodonem w mRNA. Sekwencja antykodonowa rozpoznaje komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA (w taki sposób następuje odczyt informacji genetycznej).

tRNA stanowi 10—12% ogólnej ilości kwasów rybonukleinowych w komórce i charakteryzuje się wśród innych rodzajów RNA najmniejszą masą cząsteczkową, zawartą w granicach od 25 do 30 kDa.

mRNA

Matrycowy (lub informacyjny) RNA (ang. messengerRNA) - cząsteczki kwasu rybonukleinowego zawierające przepisaną z genów, zakodowaną informację genetyczną o sekwencji poszczególnych polipeptydów.

Cząsteczki te po przyłączeniu się do rybosomów stanowią matrycę - kolejne trójki nukleotydów mRNA (tzw. kodony) są rozpoznawane przez odpowiednie fragmenty (tzw. antykodony) cząsteczek transportujących aminokwasy (tRNA), dzięki czemu w procesie translacji powstaje właściwa sekwencja peptydu.

mRNA u prokariotów ma od końca 5' niekodujące sekwencje liderowe (mogące brać udział w regulacji ekspresji genów), kodon AUG (metionina- aminokwas zapoczątkowujący każdą biosyntezę białka), inicjujący syntezę białek, a następnie rejon kodujący (kodony) zakończony kodonem terminacyjnym STOP (UAA, UAG, UGA - nie kodują żadnego aminokwasu).

mRNA u eukariotów powstaje podczas transkrypcji jako heterogenne hnRNA (pre-mRNA), a następnie ulega obróbce posttranskrypcyjnej, podczas której dodawana jest czapeczka, wycinane są introny (splicing), i dodawany jest ogon poli-A. Dojrzała cząsteczka mRNA składa się zatem z czapeczki na 5'-końcu, 5'-obszaru nieulegającego translacji (5'UTR), sekwencji kodującej, 3'-obszaru nieulegającego translacji (3'UTR) i ogona poli-A.

Niepotrzebne lub uszkodzone mRNA jest degradowane przez rybonukleazy. Regulacja czasu półtrwania mRNA w komórce jest jednym z poziomów kontroli ekspresji genu. U bakterii czas półtrwania cząsteczki mRNA wynosi od kilku sekund do ponad godziny. U ssaków czas półtrwania cząsteczki mRNA wynosi od kilku minut do dni. Cząsteczka mRNA może zawierać sekwencje, które wpływają na jej stabilność poprzez wiązanie specyficznych białek. Na stabilność mRNA wpływa także obecność modyfikacji post-transkrypcyjnych (czapeczka, ogon poli-A). Również związanie się cząsteczki mRNA z siRNA lub miRNA może być sygnałem do jej degradacji.

mRNA mono- i policistronowe

Cząsteczka monocistronowego mRNA to taka, która zawiera informację genetyczną tylko o jednym białku. Jest to sytuacja dla większości mRNA eukariota. Z kolei mRNA policistronowe zawiera na pojedynczej nici informację o kilku białkach, które podlegają skład jednego operonu.

W przypadku nici mRNA kodującej dokładnie dwa białka, używa się czasem terminu mRNA dicistronowe.

Bibliografia:

• Smale ST, Kadonaga JT (2003). The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem. 72, 449-479. PMID 12651739 (PDF)

• Thomas MC, Chiang CM. The general transcription machinery and general cofactors. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2006 41(3):105-78

• Jan Kutner. Terminacja translacji u Prokaryota i Eukaryota Postępy Biochemii. Tom 53. nr 4. Ss. 420-430. 

---