Aromaty „naturalne”

Obecne przepisy legislacyjne mówią, iż substancje smakowo-zapachowe sklasyfikowane jako „naturalne” mogą być przygotowane tylko poprzez procesy fizyczne (ekstrakcja z naturalnego źródła) lub procesy enzymatyczne/mikrobiologiczne (z użyciem prekursorów naturalnie występujących w środowisku). Taka klasyfikacja wprowadziła pewien podział na rynku - wartościowe i atrakcyjne są produkty opisane jako „naturalne”, natomiast te wytworzone na drodze syntezy chemicznej, opisane jako smak „identyczny z naturalnym”, są mniej doceniane przez konsumentów. Spowodowało to rozpoczęcie wielu badań w kierunku rozwoju biotechnologicznych procesów wytwarzania tych związków.

Istnieją 3 sposoby produkcji „naturalnych” smaków/aromatów:

- biokonwersja naturalnych prekursorów z użyciem biokatalizy

- synteza de novo (fermentacja)

- izolacja z roślin i zwierząt

Dla chemika nie ma różnicy między składnikiem wytworzonym naturalnie a tym wytworzonym w laboratorium, jednak różnica cenowa na rynku jest istotna (cena składnika „naturalnego” jest wielokrotnie wyższa).

WANILINA

- najważniejszy konsumpcyjnie składnik smakowo-zapachowy

- występuje naturalnie w strąkach wielu tropikalnych orchidei (gł. Vanilla planifolia) w ilościach 2% masowych

- mniej niż 1% pokrycia globalnego rynku z ekstrakcji

- cena naturalnie wyekstrahowanej waniliny waha się między 1200-4000$ za kg

- syntetyczna wanilina, wyprodukowana głównie z gwajakolu (org. zw. z gupy fenoli), kosztuje mniej niż 15$ za kg

- z tego powodu opracowano kilka procesów biotechnologicznych produkcji naturalnej waniliny (oprócz zwykłej biosyntezy de novo):

(1) biokonwersja ligniny

(2) biokonwersja fenylopropanoidów (kwas ferulowy, eugenol i izoeugenol)

(3) biokonwersja stylbenów fenolowych (izorapontyna)

KETON MALINOWY i 2-FENYLOETANOL

- fenylopropanoidy używane szeroko w przemyśle jako składniki smakowo-zapachowe

- keton malinowy występuje naturalnie w śladowych ilościach w owocach maliny (mniej niż 4 mg/1kg malin)

- 2-fenyloetanol ma zapach różany i występuje w wielu fermentowanych produktach spożywczych i olejkach

- dla obu związków ekstrakcja nie jest odpowiednim procesem, dlatego też główną metodą produkcji jest biokonwersja naturalnych prekursorów:

(1) 4-(4-hydroksyfenylo)butan-2-ol = betuligenol

(2) O-glukozyd = betulozyd

(3) 4-hydroksybenzalaceton

1. i (2) - biokonwersja przeprowadzana jest przez utlenienie wtórnego alkoholu

(3) - poprzez nasycenie podwójnego wiązania

Wykorzystuje się w tym celu różne systemy mikrobiologiczne. W kontekście biogeneracji ketonu malinowego u grzyba Beauveria bassiana okazało się, że inaktywacja zapachu ketonu następuje wskutek reakcji utlenienia Baeyera-Villigera do tyrozolu. Ponadto,
2-fenyloetanol i jego octan produkowane są obecnie poprzez drożdżową degradację naturalnej L-fenyloalaniny.

LAKTONY i CIS-3-HEKSENOL

- są to również naturalne aromaty używane na skalę przemysłową (wraz z ich analogami do 12 atomów węgla) przy produkcji fermentowanej żywności, produktów mlecznych i owoców (śladowe ilości)

- γ-dekalakton otrzymywany jest poprzez skrócenie łańcucha C-18 kwasu rycynolowego

(z olejku rycynowego) z pomocą różnych mikroorganizmów

- takie ulepszenia procesów spowodowały spadek ceny z 12000$/kg w 1986 roku do 500$ w 1998 roku

- podobnie, niektóre cenne γ-laktony zawierające nieparzystą liczbę atomów węgla stały się dostępne poprzez degradację naturalnych hydroksykwasów

- δ-dekalakton można uzyskać poprzez naturalną modyfikację:

1. ulenienie hydroksykwasów tłuszczowych

2. redukcja enzymatyczna nienasyconego składnika (laktonu massoia,

gł. składnik olejku z kory drzewa massoia)

- kwas linolenowy jest naturalnym prekursorem cis-3-heksen-1-olu (alkoholu z liści) - ma zapach świeżo skoszonej trawy. Zwykle otrzymuje się go przez destylację olejków roślinnych, co jest bardzo kosztowne, więc opracowano biotransformację:

1. utlenienie kwasu linolenowego i linolowego za pośrednictwem lipoksygenazy i liazy hydroperoksydazowej daje:

cis-3-heksen-1-al i heksen-1-al,

które mogą być zredukowane przez drożdże do odpowiednich alkoholi

Opracowano wiele innych biokatalitycznych procesów dla atrakcyjnych aromatów, jednak liczba ich zastosowań w przemyśle jest limitowana, a powyższe przykłady są po prostu najbardziej obiecujące.

Problemem jest łatwa dostępność produktów o smaku czy zapachu „identycznym z naturalnym”, których opisy mogą być zafałszowane. Ważne stało się stosowanie różnych metod identyfikacji i rozróżniania produktów naturalnych i syntetycznych (z zastosowaniem izotopów) w celu określenia ich autentyczności.

Aromat „identyczny z naturalnym”

Metody produkcji smaków i aromatów identycznych z naturalnymi są dyktowane względami ekonomicznymi. Choć ich biokatalityczna produkcja jest kosztowna, znalazły swoje zastosowania. Produkcja jest przyjazna środowisku i wysoce selektywna chemicznie, przez co stała się całkiem atrakcyjna. Są dwa pola zainteresowań - skala przemysłowa i skala akademicka, w której bada się substancje zapachowe pod względem naukowym. Na skalę przemysłową używa się wyizolowanych enzymów, głównie lipaz, ponieważ wykazują niezwykłą chemioselektywność, regioselektywność i enancjoselektywność. Poza tym, są dostępne na szeroką skalę i pozostają aktywne w rozpuszczalnikach organicznych.

Mentol - wybitny przypadek przemysłowy

- stosowany jako dodatek do żywności, w farmaceutyce, przemyśle kosmetycznym, pastach do zębów i gumach do żucia

- jego właściwości organoleptyczne są ściśle uzależnione od konfiguracji absolutnej, przy czym z 8 izomerów, tylko naturalny izomer (-) nadaje się jako odorant

- większość mentolu jest wciąż uzyskiwana poprzez zamrożenie olejku mięty polnej (Mentha arvensis) i następnie krystalizację mentolu

- wykorzystuje się procesy Haarmana i Reimera (H&R) oraz Takasago na skalę przemysłową

- proces H&R rozpoczyna się od niedrogich substratów, m-krezolu i propylenu, z których powstaje tymol. Następuje redukcja (uwodornienie), co daje 8 izomerów mentolu. Destylacja frakcyjna daje mentol racemiczny (2 izomery), który jest następnie przekształcany do odpowiedniego benzoesanu, który z kolei po rozpuszczeniu i krystalizacji daje pożądany (-) mentol

- proces Takasago to asymetryczna synteza, zaczynając od mikrenu. Przekształcany jest on w dietylogeranyloaminę, który izomeryzuje do (+) cytronelalu. Transformacja do
(-) mentolu następuje po uprzedniej cyklizacji (+)cytronelalu do izopulegolu i redukcji do właściwego mentolu

- niedawno zaproponowano 2 inne procesy oparte o rozkład lipazami (np. grzyb Candida rugosa). We wszystkich procesach niepożądane izomery poddaje się izomeryzacji do właściwego mentolu

Drożdże piekarskie - kolejne użyteczne narzędzie biokatalizy

- używa się wielu rodzajów drożdży w biokatalizie (szczególnie przy produkcji aromatów i smaków), gdyż są to mikroorganizmy uniwersalne, łatwo dostępne i tanie

- przeprowadzana przez drożdże piekarskie redukcja prochiralnego podwójnego wiązania alkoholu 28 daje związek o wysokiej czystości enancjomerycznej ((S)-(+)-3-(p-tolilo)-butanol). Wykorzystuje się to do produkcji seskwiterpenów (30, 31, 32 i 33), które są składnikami wielu olejków eterycznych

- kolejna redukcja przeprowadzana przez drożdże: redukcja diastereo- i enancjoselektywna γ-ketokwasów typu 34. W wyniku tej reakcji można otrzymać różne laktony, wykorzystywane przy produkcji aromatów napojów alkoholowych typu whisky, koniak, brandy. Lakton 39 jest głównym składnikiem zapachu orchidei Aerangis confusa

Cenne aromaty - fiołek, ambra i jaśmin

- olejek eteryczny z kosaćca (Iris), ambra (wydzielina z przewodu pokarmowego kaszalota) i jaśmin to od wieków najważniejsze ze składników zapachowych. Jako naturalne zapachy są bardzo kosztowne, jednak wciąż się ich używa, gdyż w porównaniu do syntetycznych zastępników są lepsze

- przewaga ta wynika ze złożoności naturalnej mieszaniny izomerycznej, w której każdy składnik może wykazywać różne właściwości zapachowe

- do końca XIX wieku jedynym źródłem zapachu fiołkowego był olejek z fiołka i irysa. Podstawowymi składnikami zapachowymi są tu jonony norterpenoidowe i irony

- jonony znaleziono również w innych roślinach, podczas gdy irony powstają podczas wzrostu i rozwoju kłączy irysa (korzenie)

- składniki te występują w naturze jako mieszanina regioizomerów alfa, beta i gamma oraz enancjomerów. Ogólnie możliwe jest występowanie 5 stereoizomerów jononów i 10 stereoizomerów ironów. Dzięki zastosowaniu syntezy chemicznej i reakcji katalizowanych enzymatycznie, tworzy się wszystkie z wymienionych izomerów i wykorzystuje dalej w przemyśle (perfumy)

- kluczowym krokiem w powyższych syntezach jest acetylacja odpowiednich alkoholi przeprowadzana przez lipazę

- racemiczne jonole i irole 40, odpowiadające im α-epoksy pochodne 41 oraz diole 42, 43 zostają poddane działaniu lipazy.

- podobne metody biotechnologiczne wykorzystano przy badaniu zapachów ambry i jaśminu

- ambra jest wydzieliną z przewodu pokarmowego kaszalota. Zawiera bezwonny trójterpen - ambreinę (alkohol), który pod wpływem światła słonecznego, powietrza i wody morskiej przechodzi proces rozkładu, uwalniając związki odpowiedzialne za złożony zapach ambry

- najbardziej ceniony wśród nich to trójpierścieniowy eter (-)ambrox, obecnie produkowany poprzez półsyntezę ze sklareolu, diterpenu obecnego w szałwii

- ostatnio ambrox uzyskano poprzez szereg transformacji chemicznych z czystego enancjomerycznie albikanolu 47 i (+) diolu 48. Związki te zostały przygotowane za pośrednictwem lipazy PL-266 (z gatunku Alcaligenes - bakterie gram ujemne) i lipazy PS

- pozostałymi składnikami ambry są (+)-γ-dihydrojonon 49 i (+)-γ-koronal 50. Pierwszy został przygotowany w optycznie czystej formie przez regioselektywną redukcję (+)-γ-jononu (lipaza PS). Kinetyczna acetylacja γ-cyklohomogeraniolu 51 katalizowana była przez lipazę AK (z Pseudomonas AK).

- kluczowymi składnikami olejku jaśminowego, jeśli tylko są w czystej formie enancjomerycznej i w stosunku diastereoizomerycznym 93:3, są (-)-trans-jasmonian 52 i (+)-cis-jasmonian 53.

- Najważniejszymi krokami są: redukcja ketonu, oddzielenie alkoholu 54 jako pojedynczy diastereoizomer i jego rozkład poprzez acetylację lipazą PS.

Uwagi końcowe

Zaprezentowane przykłady ukazują moc biokatalizy w produkcji smaków i aromatów, choć występują znaczne różnice w wykorzystywanych metodach. Dobrze zbadane procesy zostały opisane zarówno po to, aby zwrócić uwagę na ich rzeczywiste znaczenie, jak i zarysować ich perspektywy na przyszłość. Nowe wspaniałe możliwości oferowane przez biokatalizę zostały zilustrowane przez opis niektórych metod stosowanych w przemyśle i badaniach naukowych, ze szczególnym uwzględnieniem prawnych różnic w produkcji aromatów. Związki naturalne i identyczne z naturalnymi ukazują różne perspektywy. Nowe strategie wytwarzania naturalnych smaków i zapachów skorzystają z aktualnych badań w zakresie biotechnologii, szlaków biochemicznych i mikrobiologii, a z pomocą przyjdą zwykli konsumenci, wybierający naturalne produkty. Produkcja aromatów identycznych z naturalnymi z wykorzystaniem biokatalizy poszerzy możliwości oferowane przez syntezy chemiczne, a nie będzie z nimi konkurować. W tej dziedzinie, najbardziej obiecującymi biokatalizatorami wydają się lipazy, ze względu na swoją wszechstronność i wysoką selektywność.

---