Chemia biologiczna 2014

-----------------------------------------------------------------------

Laboratorium

SPRAWOZADANIE Z ĆWICZENIA

Imię i Nazwisko Piotr Chmielowski Aleksandra Wolak	Tytuł ćwiczenia Izolacja enzymu	Data 27.03.2014
Prowadzący dr. Katarzyna Kurpiewska		Ocena

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia była izolacja enzymu tyrozynazy z roślin (banan i ziemniak) oraz grzyba (pieczarki dwuzarodnikowej)

Odpowiedzi do I części ćwiczenia

Ad 1)

Po dodaniu 0,1 molowego roztworu fluorku sodu do uprzednio przygotowanej miazgi z ziemniaka, zaobserwowano wyraźnie pienienie roztworu. Pienienie spowodowane było niszczeniem błon lipidowych.

Ad 2)

Dodanie (NH₄)₂SO₄ spowodowało rozdzielenie zawartości zlewki. Siarczan(VI) amonu służy do wysolenia białka z badanej próbki.

Ad 3)

Punkt izoelektryczny (pI) to wartość pH równa średniej arytmetycznej wartości pK_a form znajdujących się po obydwu stronach formy izoelektrycznej. Cząsteczka występuję w formie obojniaczej, czyli zawiera cząsteczka zawiera jednakowe ilości dodatnich i ujemnych ładunków, a zatem jest elektrycznie obojętna.

Wartość dla tyrozynazy wynosi: pI=6,95

Ad 4)

Metody stosowane w celu zniszczenia błony komórkowej w procesie izolacji białek z materiału biologicznego. ­­- chemiczna – dodatek odpowiednich substancji, powodujących niszczenie błon komórkowych (NaF)

- mechaniczna/ciśnieniowa – użycie młynków komórkowych lub prasy francuskiej, które to – w wyniku tarcia bądź różnicy ciśnień – powodują rozerwanie mechaniczne błony komórkowej

- soniczna – proces niszczący błonę komórkową za pomocą ultradźwięków

Ad 5)

Ćwiczenie od momentu otrzymania homogenatu prowadzi się w temperaturze bliskiej 0ᵒ C, w celu spowolnienia niekorzystnych procesów w naszym preparacje. Należy do nich m.in.: procesy utleniające (oksydacyjne) białka, proces polegające na odszczepianiu aminokwasów z białek.

Innym sposobem na zminimalizowaniu niekorzystnych zjawisk byłaby praca w warunkach beztlenowych (zatrzymanie procesów utleniania) lub usuniecie niekorzystnych enzymów trawiennych.

Ad 6)

Porównanie stężenia białek w poszczególnych próbkach.

Próbka I NaF

A₂₆₀=0,385
A₂₈₀=0,353

Próbka II NaF+(NH₄)₂SO₄

A₂₆₀=0,055
A₂₈₀=0,048

Próbka III bufor

A₂₆₀=0,221
A₂₈₀=0,193

Stężenie białka obliczono korzystając z poniższej zależności

c = (1,55 * A₂₈₀) – (0,76 * A₂₆₀)

Próbka I

c = 0,328$\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}$

Próbka II

c = 0,049 $\frac{\text{mg}}{\text{ml}}$

Próbka III

c = 0,196$\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}$

Ad 7)

Posiadamy 1l 0,5 molowego roztworu buforu. Stosujemy metodę krzyża:

Do otrzymania 0,5 l roztworu 0,35M potrzebujemy 0,35L buforu 0,5M, tak więc aby otrzymać 150 ml potrzeba:

$$V = \frac{150*350}{500} = 105\ ml\ buforu\ 0,5M$$

Do otrzymania 150 ml buforu cytrynianowego potrzeba 105 ml buforu 0,5M i 45 ml wody.

Odpowiedzi do II części ćwiczenia

Zestaw 3

Ad 1)

Miedz pełni różnorodną funkcje w żywych organizmach. Wchodzi w skład enzymów (dysmutaza ponadtlenkowa) oraz odgrywa ważną role w szlakach metabolicznych. Jej obecność jest wymagana dla prawidłowego działania tyrozynazy. Ma także wpływ na działanie difenolazy.

Ad 2)

Aktywność enzymu mierzono poprzez powstawanie w roztworach L-DOPA i L-tyrozyny L-DOPAchromu. Doświadczenie prowadzono przez 8 min w temperaturze 25ᵒC na 96-wgłębienowych płytkach. Zrąb każdej reakcji stanowiło środowisko zawierające bufor Tris-HCl o stężeniu 50 mM i pH = 7,5; siarczan(VI) miedzi(II) o stężeniu od 0 do 100 μM oraz apoenzym o stężeniu 6 μg/ml. Szybkość przyrostu produktu (L-DOPAchromu) zdefiniowano jako nachylenie prostoliniowej części wykresu zależności absorbancji światła od czasu. Z

apoenzymu usunięto jony miedzi za pomocą 50 mM EDTA.

Ad 3)

Mutacje doprowadziły do powstanie wariantów M61L, M184L, F197A, N205A oraz N205D. Warianty M61L i M184L powstały przez zamianę metioniny na leucynę odpowiednio dla M61L metioniny 61 na leucynę i analogicznie dla M184L. Mutacja N205A polegała na podstawieniu aminokwasu 205 (asparaginy) alaniną. N205D powstał w skutek podmienienia asparaginy kwasem asparaginowym. Wariant F197A to podstawienie fenyloalaniny 197 alaniną.

Ad 4)

Największym powinowactwem do miedzi wykazał się wariant F197A. Powinowactwo zostało zdefiniowane jako zdolność białka do wyciągania miedzi z kompleksu z kwasem bicynchoninowym. Naukowcy tłumaczą ten fakt tym, iż fenyloalanina powoduję zatłoczenie steryczne. Wbudowanie alaniny zmniejsza zatłoczenie steryczne, co związksza szybkość przyjmowania miedzi.

Ad 5)

Naukowcy sugerują, iż jon miedzi napoczątku przylega do reszt metioninowych, a następne zostaje przeniesiony na histydynę (His60). Histydyna zmienia konformację i przenosi CuA na centrum aktywne. Dwie reszty metioninowe podejrzewane są o odgrywanie kluczowej roli w sytuacji niedoboru jonów miedzi, wychwytując je z otoczenia i przekazując dalej. CuB przechodzi zaś między Asp205 oraz Phe197.

Wnioski:

Piotr Chmielowski

Wyniki doświadczenia wskazuję na oprawną izolację enzymu. Próbki I i III zawierają znacznie większą ilość enzymu w porównaniu do próbki II. Potwierdza to poprawną izolację enzymu, ponieważ roztwór na supernatantem zawierał minimalną ilość białek.

Odpowiednie ustawienie obrotów wirówki pozwoliło na odpowiednie rozdzielenie białka od roztworu.

Ćwiczenie pozwoliło na zapoznanie z metodą izolacji enzymu z tkanek organicznych.