Jarosław Grządziel
grupa: poniedziałek, godz. 8.00
Sprawozdanie z ćwiczenia nr 6

FOTOSYNTEZA
Właściwości barwników asymilacyjnych i wykrywanie skrobi asymilacyjnej.

Fotosynteza jest szeregiem anabolicznych procesów biochemicznych, mających na celu wykorzystanie energii świetlnej i przekształcenie jej na energię chemiczną. Efektem jest synteza związków wysokoenergetycznych oraz budulcowych.

Ogólny przebieg fotosyntezy można wyrazić równaniem:

Proces fotosyntezy przebiega początkowo w LHC (light harvesting complex - kompleksach zbierających energię), skąd energia świetlna przenoszona jest na centra reakcji fotosystemu I (PSI) i II (PSII). Cząstki chlorofilu (P680) centrum PSII wysyłają elektrony na kolejne akceptory: feofitynę (Phe), chinony QA, QB, PQ oraz cytochromy (Cyt b6/f)
i plastocyjaninę (PC). Transport elektronów związany jest z tworzeniem gradientu protonowego w poprzek błon tylakoidowych, napędzający produkcję ATP. Cząstki chlorofilu P700 związane z PSI oddają elektrony na szereg przenośników A0, A1, F0, F1, F oraz ferrodoksynę (Fd), która - przenosząc je na PQ - umożliwia produkcję ATP. Proces ten został nazwany fosforylacją cykliczną. Jeżeli jednak do łańcucha fotosyntetycznego
są wprowadzane dodatkowe pary elektronów z PSII, pochodzących z rozkładu wody, okresowo redukujące PQ, to ferrodoksyna przenosi elektrony na NADP. Proces uzyskiwania energii podczas tego transportu elektronów nazywany jest fosforylacją niecykliczną.

Barwniki fotosyntetyczne, umożliwiające zamianę energii fotonów na energię chemiczną to między innymi: chlorofile (a i b), karoteny, ksantofile. Chlorofile są związkami rozpuszczalnymi w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak aceton, etanol, metanol, co wykorzystywane jest w technikach chromatograficznych. Zawierają cykliczny układ czterech pierścieni pirolowych, tworzących układ porfirynowy. Centrum pierścienia porfirynowego stanowi atom magnezu połączony z atomami azotu pierścieni pirolowych. Do czwartego pierścienia pirolowego przyłączony jest łańcuch fitolu. Znanych jest kilka rodzajów chlorofili, oznaczonych literami a-g, jednak głównym barwnikiem fotosyntetycznym jest chlorofil a, pozostałe zaś pełnią funkcję pomocniczą.

Większość karotenoidów zbudowana jest z dwóch pierścieni jonowych połączonych długim łańcuchem węglowodorowym. Dzięki odmiennej budowie chemicznej karotenoidy absorbują światło o nieco innym zakresie, niż chlorofil i przekazują zaabsorbowaną energię na cząsteczkę chlorofilu a. Karotenoidy chronią także aparat fotosyntetyczny przed procesem fotooksydacji. Dzięki obecności układu wiązań sprzężonych w cząsteczce, barwniki fotosyntetyczne wykazują - w zależności od ich rodzaju – zdolność absorpcji światła widzialnego w zakresie 370 - 750 nm. Każdy z barwników ma swoje charakterystyczne widmo absorpcji.

1. Właściwości barwników fotosyntetycznych - chromatografia cienkowarstwowa barwników:

Wykonanie:

Rozdrobnioną masę liściową przeniesiono do moździerza, dodano 20 ml acetonu, szczyptę węglanu wapnia i dobrze roztarto. Otrzymaną masę przesączono przez watę umieszczona w lejku. Przesącz przeniesiono do rozdzielacza, dodano 2 ml benzyny, 5 ml wody destylowanej i delikatnie wymieszano. Po wymieszaniu, w ciągu kilku minut utworzyła się górna warstwa benzynowa, którą rozdzieliliśmy chromatograficznie.

Rozdział:

Benzynowy ekstrakt naniesiono kropelkami na płytkę powleczoną żelem krzemionkowym, tak aby uzyskać ciemnozielone wąskie pasmo. Płytkę z naniesionym przesączem barwników wstawiono do kamery zawierającej rozwijacz. Kamerę szczelnie przykryto. Rozdział zakończono gdy pojawiły się wyraźne rozdzielone poszczególne pasma barwików.

Obserwacje: wyniki rozdziału

Wykreślanie widm absorpcyjnych barwików:

Płytkę z rozdzielonymi pasmami barwników wysuszono. Pasma: β karotenu, chlorofilu a, chlorofilu b i luteiny zdrapano i wsypano do oddzielnych suchych probówek. Po odparowaniu rozwijacza do każdej z nich dodano po 4 ml następujących rozpuszczalników:

Karoten – heksan

Chlorofil a i chlorofil b – aceton

Luteina – alkohol etylowy

Probówki wstrząsano aż do całkowitej ekstrakcji barwników. Żel odsączono przez bibułę filtracyjną nasączoną odpowiednim dla danego barwnika rozpuszczalnikiem. Klarowne ekstrakty użyto do obserwacji zjawiska fluorescencji oraz do wykreślenia krzywych widm absorbancji barwników za pomocą spektrofotometru.

Obserwacje:

Pomiar absorbancji barwników fotosyntetycznych:

1. Tworzenie się skrobi na świetle (próba jodowa).

Wykonanie:

Przygotowaną roślinę (dwa dni pozostawioną w ciemności, w tym czasie skrobia została zużyta) zasłonięto kawałkiem ciemnego papieru z wyciętym otworem. Następnie liść wystawiono na działanie promieni świetlnych. Po wytworzeniu się skrobii asymilacyjnej (2-3 godziny ekspozycji) liść został odcięty. Zdjęliśmy szablon, wrzuciliśmy liść do zlewki z wrzącą wodą i gotowaliśmy ok. 8 minut, po czym włożyliśmy liść do zlewki z etanolem, która z kolei umieszczona została w łaźni wodnej w celu gotowania liścia do jego całkowitego odbarwienia. Tak przygotowany liść włożyliśmy do szalki Petriego i zalaliśmy płynem Lugola, a po wybarwieniu płyn zastąpiliśmy wodą destylowaną.

Obserwacje i wnioski:

Fragment liścia, który nie był zasłonięty (otwór w szablonie) zabarwił się na kolor brunatny. Świadczy to o wytworzeniu skrobii asymilacyjnej w liściu, w miejscu które miało bezpośrednią ekspozycję na światło. Przy braku dostępu promieni świetlnych skrobia asymilacyjna nie może zostać utworzona.