Wykład 4 15.01.2007
Zasady pobierania próbek Roz. 2073 art. 5
Plan pobierania próbek
- badanie produktu n=1
- badanie partii n=5
- analiza trendu n…. - im więcej tym lepiej
- metoda referencyjna do pobierania próbek z obszarów produkcyjnych oraz ze sprzętu ISO 18593
Są wyjątki odnośnie pobierania próbek z partii. Na ogół jest to 5, ale czasami należy pobrać 10, a nawet więcej.
Plan poboru próbek
Plan dwóch klas - interpretacjia
Higiena procesu kryteria:
- zadawalający - w odniesieniu do kryteriów higieny procesu
- niezadawalajacy - w odniesieniu do kryteriów higieny procesu
Bezpieczeństwo żywności kryteria:
- zadawalający - w odniesieniu do kryteriów bezpieczeństwa żywności
- niezadowalający - w odniesieniu do kryteriów bezpieczeństwa żywności
Plan trzech klas - interpretacja
Higiena procesu kryteria:
- zadawalający - w odniesieniu do kryteriów higieny procesu
- dopuszczalny - w odniesieniu do kryteriów higieny procesu
- niezadawalający - w odniesieniu do kryteriów higieny procesu
Poniżej m-zadawalający
m - M - dopuszczalny
powyżej M - niezadawalający
plan trzech klas - liczba próbek powyżej 5
Procedura planu poboru próbek
Tuszki drobiowe
Salmonella
N=50 - liczba próbek
C=7 (maximum 14% niezgodnych) - może być zanieczyszczonych
Dzień produkcji (d) 1
15 tuszek
10g skóry i szyi/Tyszka
Skomasowanie skór z szyi 3 tuszek
5x25g próbek końcowych
N=50 - sytuacja 1
d1=0; d2=2(niezgodne); d3=0; d4=1; d5=0; d6=0; d7=1; d8=0; d9=1; d10=1
n=5
c=6
Higiena procesu = zadawalający
N=50 - sytuacja 2
Odrzucam dzień 1 - dodajemy dzień 11
d2=2(niezgodne); d3=0; d4=1; d5=0; d6=0; d7=1; d8=0; d9=1; d10=1; d11=2
n=50
c=8
Higiena procesu - niezadowalająca
(Zapoznać się z rozporządzeniem 2073/2005 sugestia pani doktor przed egzaminem)
Analiza trendu
- producent żywności powinien analizować wynik trendu
- kiedy analiza trendu wskazuje powinowactwo w kierunku wyniki niezadowalającego, należy podjąć odpowiednie działania (zapobiegające wystąpieniu ryzyka mikrobiologicznego)
Udoskonalenie
- podnoszenie higieny uboju
- przegląd kontroli procesu
n=5 =>53% niepewność
n=10 =>31%
n=20 =>18%
n=60 =>6%
n=100 =>4%
Rutynowe badania mikrobiologiczne
- określanie poziomu mezofilnej mikroflory saprofitycznej
- poszukiwanie drobnoustrojów potencjalnie chorobotwórczych
- wykluczenie obecności drobnoustrojów patogennych
Metody referencyjne a metody alternatywne
- Rozporządzenie 2073, art. 5
- Dopuszcza stosowanie metod alternatywnych zamiast referencyjnych o ile zostały zwalidowane według normy PN EN ISO 16140
Metody:
- referencyjne
- alternatywne
- laboratoria akredytowane
Metody analityki mikrobiologicznej
1) Standardowe
- metoda płytkowa
- NPL - najbardziej prawidłowa liczba
- ELISA
2) Instrumentalna
- molekularna: PCR, DNA, chip, sonda
- impedymetria
- cytometria
- fluorymetria
Metody analityki mikrobiologicznej
- mikrobiologia prognostyczna - matematyczne modelowanie predyktywne z wykorzystaniem krytycznych czynników wzrostu lub przeżywalności mikroorganizmów
1. Mechanistyczne
2. Empiryczne
Obecne metody i technologie
67% ELISA + ELFA
30,8% PCR + DNA Pr
2,1% chips, DNA, Arrays
0,1% inne
Metoda płytkowa
Wzrost jtk (CFK) na płytkach
Metoda z wykorzystaniem płytek kontaktowych
- płynna próbka zostaje zaabsorbowana przez podłoże wzrostowe
NPL - 3 probówki, używamy przy niskich poziomach zanieczyszczeń, poniżej 10 koloni na 1cm3
Metody alternatywne
- Automatyzacja w laboratorium
- zwiększona ilość prób
- wzrost efektywności pracy personelu
- standaryzacja przygotowywania prób i odczytu wyników
- zapewnienie wiarygodności
- powtarzalność wyników
- szybki zapis i transfer danych
- umożliwienie stałego monitorowania procesu produkcji
ELISA czyli test immunoenzymatyczny, immunosorbcyjny
- Test ELISA należy do grupy tzw. Testów fazy stałej
- Pierwszą metodą z tej grupy, w której stosuje się przeciwciałą znakowane radioizotopem jest test RIA za wynalezienie którego Rosalyn Yakow w 19977 roku otrzymał nagrodę Nobla
- Metoda ELISA polega na wykryciu określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklinalnych koniugowanych z odpowiednim enzymem.
Zasada testu ELISA
- zasada działania testu ELISA polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko, które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał...
Odmiany ELISA
1. Sandwich ELISA - test podwójnego wiązania
2. test ELISA bezpośredni i pośredni
3. Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA
4. Kompetencyjny test ELISA
Ad1 Określa stężenie danego białka w badanej próbce
Ad.2 Test podwójnego wiązania bezpośredni z użyciem jednego przeciwciała - antygen po związaniu przez przeciwciała umieszczone na płytce jest wykrywane przez kolejne przeciwciała, które związano ze znacznikiem pośredni - przeciwciało monoklinalne rozpoznaje swoiście antygen nie jest znakowane. Znakowane jest natomiast kolejne przeciwciało, rozpoznające dany izotop immunoglobulina. Dysponujemy dodatkowym przeciwciałem rozpoznającym klasę przeciwciała pierwotnego.
Ad. 4 Wykorzystuje się mieszankę znakowanego antygenu lub przeciwciała
PCR
Reakcja łańcuchowa plomerazy, PCR- łańcuchowa reakcja polimerazy; metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus
PCR
Do reakcji wprowadza się
- matrycowy DNA
- triofosforany deoksyrybonukleotydów
- startery
- termostabilną polimerazę