TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Cel ćwiczenia II:

1. Przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania poprzez elektroforezę preparatywną zlinearyzowanego i deforsforylowanego plazmidu.

2. Elucja DNA z żelu agarozowego (metoda Gel-Out ®).

PRZEBIEG DOŚWIDCZENIA:

1. Elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego plazmidu (horyzontalna elektroforeza preparatywna w żelu agarozowym o stężeniu 0,8%, przygotowanym w 1xTBE, zawierającym bromek etydyny w stężeniu 0,4 µg/ml; wymiary żelu: 72x85x5 mm ):

• Mieszaninę po defosforylacji, jak i bufor do nanoszenia próbek na żel agarozowy rozmrożono w temperaturze pokojowej i krótko odwirowano,

• Przygotowano próbkę do naniesienia na żel preparatywny poprzez dodanie do 20 µl mieszaniny po defosforylacji, 4 µl 6x buforu do nanoszenia próbek na żel agarozowy i odwirowano,

• Próbkę inkubowano w termomikserze Eppendorf w tem. 65°C przez 10 min (aby dodatkowo zdenaturować kompleks fosfataza-DNA), a następnie chłodzono w lodzie,

• Na żel agarozowy naniesiono 24 µl przygotowanej próbki defosforylowanego wektora pGEX-2T (każda z grup naniosła swoją próbke), oraz 7 µl markera wagowego FastRuler^TM DNA Ladder, Middle Range,

• Elektroforezę prowadzono w aparacie BIO-RAD, w buforze 1x TBE, przy stałym napięciu 80V, przez 30 min.,

• Żel analizowano w świetle UV przy długości fali 365 nm.

2. Elucja DNA z żelu agarozowwgo (metoda Gel-Out ®):

• Żel przed pobraniem badanych fragmentów, spadł na podłogę i popękał, Na szczęście udało się odzyskać wszystkie badane próbki po posładaniu fragmentów żelu na lampie UV,

• Po zlokalizowaniu na żelu agarozowym w świetle UV pasma, odpowiadającego fragmentowi DNA o odpowiedniej długości, wycięto go (włącznie z zanieczyszczeniami z podłogi) z żelu za pomocą narzędzia o nazwie X-tracta Gel Extractor Tool firmy Promag i przeniesiono do probówki (m_probówki= 0,994 g),

• Probówkę z badanych fragmentem wyciętym z żelu zważono na wadze analitycznej (m_fragmentu = 1,040 g),

• Masa naszego fragmentu wynosiła 1,040g - 0,994g = 0,46g = 46 mg.

• Do wyciętego skrawka żelu agarozowego dodano 400 µl roztworu R7S, w celu rozpuszczenia agarozy i przygotowania fragmentu DNA do kontaktu ze złożem krzemionkowym,

• Zawartość próbki wymieszano i inkubowano w termomikserze Eppendorf w temp. 50°C, przy obrotach 500 rpm, do momentu rozpuszczenia agarozy (10 min), od czasu do czasu mieszając probówkę,

• Następnie dodano 200 µl izopropanolu w celu wytrącenia kwasu nukleinowego i dokładnie wymieszano,

• Próbkę krótko odwirowano w celu usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki,

• Otrzymaną mieszaninę naniesiono na kolumnę do oczyszczania DNA, a następnie całość wirowano ok. 30 sekund, przy ok. 10 000 x g,

• Kolumnę wyjęto z probówki, przesącz odrzucono i ponownie włożono kolumnę do czystej probówki,

• Na złoże w kolumnie nałożono 600 µl roztworu A1 do płukania (roztwór płuczący, zawierający alkohol),

• Próbkę wirowano ok. 30 s przy ok. 10 000 x g,

• Kolumnę wyjęto z probówki, przesącz odrzucono, a kolumnę ponownie włożono do czystej probówki,

• Probówkę z kolumną inkubowano przez ok. 2 minuty w temp. pokojowej w celu osuszenia złoża (aby nie pojawiła się aktywność gwiezdna),

• Osuszoną kolumnę umieszczono w czystej probówce Eppendorfa i nałożono na nią 15 µl buforu TE tak, aby całkowicie pokryć złoże, w celu elucji DNA,

• Kolumnę pozostawiono na ok. 3 min. w temp. pokojowej,

• Następnie wirowano 1 min przy ok. 10 000 x g,

• Kolumnę umieszczono w czystej próbówce i powtórzono czynności (naniesiono 15 µl buforu TE, pozostawiono na 3 min. i wirowano przez 1 min),

• zmierzono objętość otrzymanego przesączu (v_przesączu = 30 µl),

• otrzymany przesącz zawierający zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T przechowano w temp. - 20°C

WNIOSKI:

Cel ćwiczenia jakim było przygotowanie plazmidu pGEX-2T do klonowania został pozytywnie zrealizowany. Otrzymano 30 µl przesączu, zawierającego zawierający zlinearyzowany, defosforylowany i oczyszczony plazmid pGEX-2T.

Zastosowano elektroforezę preparatywną, która umożliwia izolację z żelu tej części preparatu, którą zamierzamy użyć do dalszych prac (ćwiczenie III). Udało się wyizolować liniową formę DNA. Przy stosowaniu tej metody trzeba zwrócić szczególną uwagę na napięcie (przy zbyt dużym napięciu, wzrasta temperatura), ponieważ nadmiar ciepła może prowadzić do denaturacji i inaktywacji separowanych białek ( w naszym przypadku, może prowadzić do stopienia agarozy).

W naszym ćwiczeniu wykorzystano kolumnę ze złożem krzemionkowym. Podstawą większości produktów związanych z oczyszczaniem kwasów nukleinowych są unikalne właściwości matryc krzemionkowych do selektywnego wiązania DNA. Zasada oczyszczania poprzez matryce krzemionkowe opiera się na wysokim powinowactwie do ujemnie naładowanego szkieletu DNA, w kierunku dodatnio naładowanych cząstek krzemionki . DNA jest ściśle związane, a także intensywnie przemywane, aby pozbyć się wszystkich zanieczyszczeń. Oczyszczone cząsteczki DNA mogą być wymywane przy użyciu roztworów o niskiej sile jonowej ( o pH ≥ 7), później przy użyciu bufor TE lub wody destylowanej.

1