Hodowla i wzrost mikroorganizmów

Wymagania odżywcze mikroorganizmów

1. Źródło węgla

   • Chemoautotrofy: metabolizują organiczne źródła węgla

   • Autotrofy: korzystają z nieorganicznych źródeł węgla (CO₂)

2. Źródło azotu: -NH₃, -NH₂, -NO₃, -NO₂, -N₂

3. Źródło siarki: SO3, S2O3, S

4. Źródła energii:

   • Chemoautotrofy - energia pochodzi z utleniania związków nieorganicznych.

   • Fotoautotrofy – energia świetlna

Izolowanie czystych kultur

Klon – mikroorganizmy pochodzące od jednej komórki – jednorodne genetycznie.

Szczep – mikroorganizmy jednego gatunku wyprowadzone z różnych klonów.

1. Posiew redukcyjny na agarze odżywczym (zestalenie agar-agarem – ciekły do 44^oC, topi się w 85^oC)

2. Metoda płytek lanych – hodowlę należy dziesięciokrotnie rozcieńczyć (w 0,5% NaCl), następnie z kilku probówek należy pobrać roztwór i przenieść na szalkę z agarem.

3. Metoda szeregu rozcieńczeń – posiew wykonuje się pipetą (po 100 μl)

Przechowywanie mikroorganizmów

Metodę przechowywania hodowli dobiera się tak, aby zminimalizować letalność komórek i stworzyć jak najbardziej sterylne warunki.

1. Skosy mikrobiologiczne

2. Wkłucia w podłoża stałe

3. Liofilizacja (najczęściej stosowana)

   • Schłodzenie hodowli do ok -70^oC

   • Szybkie wysuszenie hodowli (nie więcej niż 1% wody)

4. Ciekły azot – stabilizacja glicerolem lub DMSO

Podłoża mikrobiologiczne

1. Syntetyczne – zdefiniowane: minimalne – bazowe; optymalne – pełne.

2. Podłoża niezdefiniowane – kompleksowe; naturalne.

   1. Bulion odżywczy

   2. Agar odżywczy

(podłoże kompleksowe MacConkey’a)

Hodowle wzbogacające, namnażające

Selektywne faworyzowanie jednego gatunku – izolacja.

Podłoża selektywnie różnicujące

Podłoże MacConkey’a – rozróżnienie w obrębie pałeczek – koliformy (E. coli, Salmonella, Shigella)

Przebieg procesu różnicowania:

• Fiolet krystaliczny – inhibicja G(+),

• Fermentacja laktozy (E. coli) obniża pH, wtedy czerwień obojętna zyskuje kolor czerwony

• Sole żółciowe krystalizują na żółto wokół kolonii, które fermentują laktozę

• Brak fermentacji laktozy – barwa biała wokół kolonii (Salmonella, Shigella)

Czynniki wpływające na wzrost mikroorganizmów

1. pH – do stabilizacji pH używa się roztworów buforowych.

1. Stosunek do obecności tlenu

1. Aeroby – wymagają tlenu do metabolizmu

2. Anaeroby – bezwzględne beztlenowce

3. Anaeroby fakultatywne – rosną w obecności i przy braku tlenu

4. Mikroaerofile – wymagają niskich stężeń tlenu

5. Anaeroby tolerujące tlen – j.w.

1. Stosunek do temperatury

Punkt śmierci cieplnej – temperatura, w której hodowla ginie w ciągu 10min.

Czas śmierci cieplnej – czas, jaki jest potrzebny do zabicia hodowli w danej temperaturze.

1. Ciśnienie

Hydrofile – barofile

Osmotyczne – osmofile (np. 7,5% NaCl – Staphylococcus aureus)

Halofile – obligatoryjne osmofile

Dynamika wzrostu bakterii

1. Szybkość wzrostu – czas regeneracji – czas pomiędzy podziałami.

2. Charakterystyka wzrostu w hodowli stacjonarnej (ograniczenia: ubytek składników odżywczych; toksyny)

Diaukcja – wzrost dwufazowy – podwójny cykl wzrostu. Wymaga indukcji enzymów umożliwiających wykorzystanie nowego źródła węgla dostarczonego do podłoża.

Oznaczanie liczby mikroorganizmów w określonej objętości (inoculum). Liczbę mikroorganizmów wyznacza się najczęściej dla hodowli synchronicznych – populacja komórek dzieląca się w tym samym czasie (temperatura, składniki odżywcze, światła, filtry)

1. Wyznaczenie całkowitej (łącznie z komórkami martwymi) liczby komórek. Liczenie bakterii wg Petroff-Hausser

1. Wyznaczanie liczby żywych komórek metodą rozcieńczeń (podobnie jak izolowanie kultur metodą szeregu rozcieńczeń).

Przedłużanie hodowli – hodowle ciągłe – układ otwarty

1. Chemostat

2. Turbidostat – stała gęstość optyczna hodowli

Kontrola wzrostu mikroorganizmów

Sterylność – brak wszelkich form mikroorganizmów (również form przetrwalnikowych)

Aseptyczność – brak organizmów zakażających i czynników infekcyjnych (mogą występować mikroorganizmy niegroźne)

Wzrost bakterii można kontrolować poprzez:

• Filtrowanie

• Zabijanie (czynniki bakteriobójcze)

• Zahamowanie wzrostu; reprodukcji (czynniki bakteriostatyczne)

Filtry membranowe:

• Celuloza – octan celulozy

• Prasowana ziemia okrzemkowa (coraz rzadziej używana)

• Syntetyczne polimery: nylon, nitroceluloza.

Teoria sterylizacji – zabijanie mikroorganizmów

Wynikiem sterylizacji jest zamieranie (?)

Skuteczność zależy od:

1. Czasu ekspozycji

2. Gatunku

3. Liczebności populacji

4. Typu czynnika

Szczepy diagnostyczne: Bacillus stearothermophilus, Clostridium

Czynnik	Warunki	Zastosowanie
Temperatura – suche powietrze	160^oC/3h - 180^oC /2h	Szkło laboratoryjne, suszarki
Temperatura – wilgotne powietrze	121^oC/15min, 1,5atm	Podłoża, autoklaw
Temperatura – wilgotne powietrze pasteryzacja	62^oC/30min 71,7^oC/15s Flash	Podłoża, żywność, których walory mogłyby ulec zmianie w wyższej temperaturze
Tyndalizacja	3x pasteryzacja
Filtracja	Pory 0,05 – 0,22μm	Substancje płynne, ktróre nie mogą być podgrzane
Promieniowanie UV		Sterylizacja gazów, powierzchni
Promieniowanie γ		Zabezpieczanie żywności

Zahamowanie wzrostu

1. Związki nieselektywne – syntetyczne

   1. Antyseptyki – hamują wzrost lub zabijają na powierzchniach żywych tkanek

   2. Dezynfektanty – na przedmiotach martwych

2. Związki selektywne – antybiotyki

Czynniki alkilujące -

Metriolat – antyseptyk – tiosalicylan rtęciowy

C₂H₅HgSC₆H₅-0-COONa

Heksachlorofenol (toksyczność 1ppm)

Wyznaczanie skuteczności działania dezynfektantów – test fenolowy, współczynnik fenolowy, model Staphylococcus aureus.