Część doświadczalna:
Przygotowanie emulsji oleju:
60 ml 2%-owego wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego zmieszaliśmy z 40 ml oleju słonecznikowego i homogenizowaliśmy przez 5 minut. Uzyskana emulsje stosowaliśmy jako substrat w reakcji.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji.
Przygotowaliśmy 3 erlenmayerki o pojemności 100 ml i wprowadziliśmy przygotowana w poprzednim punkcie substancji. Doświadczenie przeprowadzaliśmy uwzględniając podaną kolejność:
2 próby właściwe, czyli do dwóch erlenmayerek wprowadziliśmy:
5 ml emulsji,
4 ml buforu,
1 ml wyciągu z trzustki.
Pierwszą próbę inkubowaliśmy 30 minut a drugą 60 minut w temperaturze 37°C. Po wyjęciu z inkubatora dodaliśmy 10 ml etanolu.
1 próba kontrolna, czyli do jednaj erlenmayerki wprowadziliśmy:
5 ml emulsji,
4 ml buforu,
10 ml etanolu,
1 ml wyciągu z trzustki.
Tak przygotowane mieszaniny mieszaniny miareczkowaliśmy 0,05 M NaOH w obecności fenoloftaleiny (2-3 krople) do różowego zabarwienia. Wyniki doświadczenia zestawiliśmy w tabeli:
Tab.1 Objętości NaOH użyte do miareczkowania przygotowanych prób.
| Substrat | Próba kontrolna [ml] | V30 [ml] | V60 [ml] | V30’ [ml] | V60’ [ml] |
|---|---|---|---|---|---|
| Olej kukurydziany | 5,5 | 9,1 | 12,05 | 3,6 | 6,55 |
| Olej ryżowy | 5,3 | 10,4 | 10,9 | 5,1 | 5,6 |
| Olej słonecznikowy | 5,5 | 7,5 | 11 | 2 | 5,5 |
| Olej z pestek winogron | 4,6 | 9,9 | 12,5 | 4,8 | 7,9 |
Obliczam aktywność lipazy w 1 dm3 Kreonu (dla oleju słonecznikowego):
$$A = \ \frac{\Delta V*50*20}{1\ ml*t}$$
Dla próby inkubowanej 30 minut:
$$A = \ \frac{2*50*20}{1\ ml*30\ }$$
A = 66, 67
Dla próby inkubowanej 60 minut:
$$A = \ \frac{5,5*50*20}{1\ ml*60}$$
A = 91, 67
Tab.2 Zestawienie wyników prób olejów inkubowanych w danych temperaturach
| Substrat | A30’ [U/mlroztworu kreonu] | A60’ [U/mlroztworu kreonu] |
|---|---|---|
| Olej kukurydziany | 120 | 109,2 |
| Olej ryżowy | 170 | 93,3 |
| Olej słonecznikowy | 66,67 | 91,67 |
| Olej z pestek winogron | 176,7 | 131,7 |
Wykres zależności ∆V=f(t) dla oleju słonecznikowego:
Wnioski:
Z przeprowadzonego doświadczenia wynika że aktywność lipazy zmniejsza się po upływie czasu. W próbie po upływie 60 minut aktywność lipazy jest mniejsza niż w próbie po upływie 30 minut (wyjątkiem jest olej słonecznikowy). Ilość NaOH jaką zużyliśmy do zmiereczkowania jest proporcjonalna do powstałych w czasie enzymatycznie zhydrolizowanych tłuszczów. Najmniej podatnym olejem na hydrolizę tłuszczów jest polej słonecznikowy a najbardziej olej z pestek winogron.
Oznaczanie w preparacie z tabletki Kreon enzymów- α-amylazy i proteinazy:
Oznaczanie α-amylazy:
Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 5 ml 1% skrobi. Do pierwszej dodaliśmy kilka kropel przygotowanego wcześniej preparatu enzymatycznego (próba właściwa), o drugiej dodaliśmy kilka kropel wody destylowanej (próba kontrolna). Próbówki pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 min. Po upływie wyznaczonego czasu dodaliśmy do próbówek po kilka kropel J2 w KJ.
Obserwacje:
W próbówce z preparatem enzymatycznym nastąpiło całkowite odbarwienie, próba kontrolna zabarwiła się na granatowo.
Wnioski:
Odbarwienie próby właściwej świadczy o obecności α- amylazy w preparacie Kreon. α- amylaza niszczy strukturę heliakalną skrobi, przez co roztwór jodu nie zabarwił próby. Próba kontrolna zabarwiła się na granatowo co świadczy o obecności jodu w próbie.
Oznaczanie proteinazy
Do dwóch próbówek wprowadziliśmy po 2 ml 2% kazeiny mleka. Do pierwszej próbówki (próby właściwej) dodaliśmy 1 ml preparatu enzymatycznego, do drugiej (próby kontrolnej) 1 ml wody. Obie próby pozostawiliśmy w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po tym czasie dodaliśmy do obu próbówek 4ml 5% TCA.
Obserwacje:
W obu próbówkach wytrącił się biały osad, jednak w próbówce zawierającej enzym wytrąciło się go mniej.
Wnioski:
W próbie z enzymem nastąpiła hydroliza białka. TCA powoduje denaturacje białka. A więc z próbie w której było mniej białka gdyż cześć została zhydrolizowana, powstało mniej osadu denaturowanego białka. Świadczy to o obecności proteinazy w tabletce Kreon.