Struktura DNA i RNA

Struktura DNA po raz pierwszy została określona przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka (przy udziale Rosalind Franklin) i opublikowana w „Nature” 25 kwietnia 1953 roku. Autorzy zaproponowali, że cząsteczka DNA jest biopolimerem zbudowanym z przeciwnie skierowanych łańcuchów, zwiniętych wokół wspólnej osi. Poznanie struktury DNA rozwiązało problem kopiowania (replikacji).

Cząsteczka DNA składa się z dwóch długich polinukleotydów, zbudowanych z czterech rodzajów nukleotydów, określonych jako łańcuchy lub jako nici DNA. Łańcuchy te są ze sobą związane łańcuchami wodorowymi tworzonymi między zasadami wchodzącymi w skład nukleotydów.

DNA składa się z 4 rodzajów zasad przyłączonych kowalencyjnie do rdzenia cukrowo-fosforanowego.

Zasady są kowalencyjnie połączone z pierścieniem cukru – 2’-deoksyrybozą w pozycji C-1. W pirymidynach miejscem połączenia z zasadą jest pozycja 1 (N-1), a w purynach pozycja 9 (N-9). Wiązanie pomiędzy cukrami i zasadami nazywane jest wiązaniem β-N-glikozydowym.

Grupa fosforanowa składa się z jednej, dwóch lub trzech reszt fosforanowych związanych z atomem węgla 5’ reszty cukrowej. Reszty fosforanowe oznaczone są symbolami alfa, beta i gamma. Reszta fosforanowa oznaczona symbolem alfa bezpośrednio łączy się resztą cukrową.

ZASADA + CUKIER = NUKLEOZYD

ZASADA + CUKIER + FOSFORAN = NUKLEOTYD

Nukleotyd to nukleozyd połączony wiązaniem estrowym z przynajmniej jedną grupą fosforanową.

Nukleozydy:	Nukleotydy - deoksynukleozydo-5’-trifosforany (dNTP)
deoksyadenozyna deoksyguanozyna deoksycytydyna deoksytymidyna	deoksyadenozyno-5’- trifosforan (dATP) deoksyguanozyno-5’-trifosforan (dGTP) deoksytymidyno-5’-trifosforan (dTTP) deoksycytydyno-5’-trifosforan (dCTP)

RESZTY DEOKSYRYBOZY + RESZTY FOSFORANOWE = RDZEŃ DNA (niezmienny wzdłuż całej cząsteczki)

Grupa 3’-hydroksylowa reszty cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest połączona z grupą 5’-hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.

Łańcuch kwasu nukleinowego jest polarny. Niezależnie od długości ma wolny koniec 5’, na którym może (lub nie) znajdować się grupa fosforanowa, oraz koniec 3’, który najczęściej stanowi wolna grupa hydroksylowa.

W pH obojętnym każda grupa fosforanowa ma pojedynczy ładunek ujemny, stąd kwasy nukleinowe są polimerami o dużym ładunku.

Zmienną częścią DNA jest sekwencja czterech rodzajów zasad (A, G, C, T), łączących się ze sobą wiązaniami wodorowymi na zasadzie komplementarności (parowanie Watsona-Cricka), A-T (2 wiązania), G-C (3 wiązania).

Fragment cząsteczki nukleotydów można zapisać: 5’-CATTGCCAGGGT-3’

Cechy helisy DNA:

• dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe oplatają się wspólną oś. Łańcuchy te biegną w przeciwnych kierunkach (antyrównolegle),

• zasady znajdują się wewnątrz, a fosforany i reszty deoksyrybozy na zewnątrz helisy. Płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi helisy, a płaszczyzny pierścieni cukrów są ułożone prostopadle względem zasad,

• średnica helisy (forma β) wynosi 2,0 nm. Odległość między sąsiednimi zasadami mierzona wzdłuż osi helisy, wynosi 0,34 nm. Zasady są skręcone względem siebie pod kątem 36° (na całkowity skręt helisy przypada po około 10 nukleotydów),

• pomiędzy rdzeniami cukrowo-fosforanowymi przebiegają dwa rowki, mały i duży, które układają się heliakalnie,

• dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi komplementarne pary. Adenina zawsze tworzy parę z tyminą, a guanina z cytozyną,

• kolejność zasad w łańcuchu polinukleotydowym nie jest w żaden sposób ograniczona. Ściśle określona sekwencja zasad niesie informację genetyczną,

• reszty cukrowe i fosforanowe pełnią rolę strukturalną,

• helisa jest dodatkowo stabilizowana przez asocjacją warstwową, nazywaną także oddziaływaniami typu π-π (dipol-dipol). Obejmuje ona oddziaływania hydrofobowe między sąsiednimi zasadami, zwiększające stabilność podwójnej helisy po połączeniu dwóch łańcuchów przez wiązania wodorowe.

Dzięki takiej strukturze cząsteczki DNA są stabilne w obojętnych roztworach wodnych (w warunkach fizjologicznych).

DNA w komórce występuje głównie w formie B. Odwodnienie włókna powoduje, że DNA przyjmuje strukturę typu A. Formę Z przyjmują cząsteczki DNA w roztworze o wysokiej sile jonowej, tworząc charakterystyczne sekwencje złożone z naprzemiennie występujących po sobie G i C.

PORÓWNANIE FORM A, B i Z DNA:

	TYPY HELISY
	A
Kształt	najszersza
Średnica helisy	2,55nm
Kierunek skręcania	P
Liczba par zasad na skręt helisy	11
Duży rowek	Wąski i bardzo głęboki
Mały rowek	Bardzo szeroki i płytki

Helisa A występuje w dwuniciowych odcinkach RNA, a także w cząsteczkach hybrydowych, tworzonych przez jedną nić DNA i jedną nić RNA (grupa -OH w pozycji 2’ rybozy RNA uniemożliwia podwójnej helisie przyjęcie konformacji B z powodu zawady przestrzennej). Tlen w pozycji 2’ leży na zewnątrz, a w B wewnątrz helisy.

Z-DNA – powstanie tej formy wiąże się z dodatnim napięciem torsyjnym w wyniku poruszania się po DNA polimerazy RNA (w trakcie transkrypcji); Z-DNA powstaje za polimerazą DNA i może regulować aktywność genów, uniemożliwiając ich ponowną transkrypcję.

Trójniciowy DNA – DNA H (sekwencje homopurynowe lub homopirynowe, co 150 kpz).

Forma krzyżowa DNA (sekwencje palindromowe, mają budowę podwójnej helisy B, w której jednak fragmenty nici wypętlają się i tworzą lokalne wewnątrzcząsteczkowe struktury dwuniciowe).

RNA

• tymina jest zastąpiona przez uracyl,

• cukrem jest ryboza,

• na ogół występuje jako cząsteczka jednoniciowa, jakkolwiek może mieć regiony o strukturze heliakalnej (powstałe poprzez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe i asocjację zasad w obrębie jednego łańcucha; zasady mogą być połączone wg reguły Watsona – Cricka lub w inny sposób, np. parowanie Hoogsteena),

• w syntezie RNA biorą udział 4 nukleotydy (NTP):

  • guanozyno-5’-trifosforan (GTP)

  • urydyno-5’-trifosforan (UTP)

  • cytydyno-5’-trifosforan (CTP)

  • adenozyno-5’-trifosforan (ATP)

• wiązanie 3’-5’-fosfodiesrowe jest mniej stabilne niż w DNA,

• w helisie RNA nie wszystkie zasady są sparowane; zdarzają się pary dwóch zasad pirymidynowych, niekiedy pojedyncze zasady ulegają wypętleniu,

• w niektórych rodzajach RNA zasady zmodyfikowane występują stosunkowo często,

• cząsteczki RNA są krótsze niż DNA (mają od kilkudziesięciu do kilku tysięcy nukleotydów).

Właściwości kwasów nukleinowych:

• wpływ środowiska kwaśnego – kwasy nukleinowe ulegają w roztworach silnych kwasów ulegają całkowitej hydrolizie do podstawowych składników : zasad, rybozy lub deoksyrybozy i fosforanu. W bardziej rozcieńczonych kwasach mineralnych selektywnie zrywane są wiązania najłatwiej ulegające hydrolizie – glikozydowe łączące zasady purynowe z pierścieniami rybozy,

• wpływ środowiska zasadowego:

  • DNA – zmianie ulegają tautomeryczne formy zasad (cząsteczka traci proton i formy ketonowe –> enolowe); wpływa to na wiązania wodorowe pomiędzy zasadami i w efekcie powoduje denaturację DNA,

  • RNA – także następuje denaturacja rejonów heliakalnych, ale efekt ten jest tuszowany podatnością RNA na hydrolizę w środowisku zasadowym.

Denaturacja – zerwanie metodami chemicznymi lub fizycznymi oddziaływań niekonwalencyjnych, takich jak wiązania wodorowe, które utrzymują strukturę drugorzędową lub strukturę wyższego rzędu w białkach i kwasach nukleinowych. Zdenaturowany DNA występuje w postaci wolnych, pojedynczych nici.

Wiązanie wodorowe – słabe przyciąganie elektrostatyczne między atomem elektroujemnym, takim jak tlen lub azot, i atomem wodoru związanym z innym atomem elektroujemnym.

Chemiczna denaturacja – wiele związków chemicznych w obojętnym pH powoduje denaturację DNA i RNA, np. mocznik, formamid. Duże stężenie tych związków powoduje rozerwanie wiązań wodorowych cząsteczek wody. Dochodzi do zmniejszenia energetycznej stabilizacji struktury kwasu nukleinowego (brak umiejscawiania się wody pomiędzy zasocjowanymi warstwowo hydrofobowymi zasadami) -> denaturacja.

Denaturacja termiczna – wzrost temperatury może spowodować denaturację DNA i RNA. W trakcie podgrzewania RNA ulega stopniowej denaturacji, natomiast DNA rozplata się do pojedynczych nici w określonej temperaturze Tm (temperatura topnienia), która jest funkcją zawartości par G+C w DNA.

Renaturacja – termiczną denaturację można odwrócić poprzez oziębienie roztworu. Szybkie ochłodzenie pozwala na powstanie jedynie ograniczonych regionów dwuniciowego DNA (dsDNA; double stranded DNA), natomiast powolne ochładzanie powoduje odnalezienie się w całości nici komplementarnych i odzyskanie w pełni struktury dwuniciowej helisy.

Absorpcja światła UV przez DNA i RNA:

• zasady purynowe i pirymidynowe absorbują światło UV,

• λmax = 260nm (λmax dla białek = 280nm),

• λ260/λ280 jest miarą czystości preparatów DNA; ≥1,8.